申请/专利权人：动量制药公司;拜奥法克图拉公司

申请日：2016-04-27

公开（公告）日：2021-09-21

公开（公告）号：CN108138214B

主分类号：C12P21/06(20060101)

分类号：C12P21/06(20060101);C12N15/00(20060101);C12Q1/04(20060101)

优先权：["20150427 US 62/153,178"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.21#授权;2018.07.03#实质审查的生效;2018.06.08#公开

摘要：本发明公开了制备治疗性蛋白质的方法。

主权项：1.一种制备治疗性蛋白质的方法，包括用以下核酸转染胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的哺乳动物细胞：i编码3-酮基类固醇还原酶的核酸；ii编码谷氨酰胺合成酶的核酸；iii含有氨基糖苷类抗生素抗性基因的核酸；以及iv编码所述治疗性蛋白质的核酸。

全文数据：制备治疗性蛋白质的方法[0001]发明背景[0002]使用哺乳动物细胞表达系统生产治疗性蛋白质在生物技术产业中越来越重要。已经描述了多种培养和转染系统，但每一种都具有显着的局限性。发明内容[0003]本文描述的发明部分地基于以下发现:胆固醇营养缺陷型细胞与一种或多种额外的选择性标志物的组合可用于制备治疗性蛋白质的方法，以避免与胆固醇营养缺陷型细胞相关的意外的制备问题例如，低生产率）。在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养具胆固醇营养缺陷型和谷氨酰胺营养缺陷型的细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；ii编码能够使所述细胞中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质的核酸；以及（iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0004]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0005]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0006]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码谷氨酰胺合成酶。[0007]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0008]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下例如，在核酸（ii转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在谷氨酰胺合成酶抑制剂例如，甲硫氨酸亚砜亚胺）的情况下例如，在核酸ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸（i转染期间和或之后培养所述细胞。[0009]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇、不存在外源引入的谷氨酰胺并且存在谷氨酰胺合成酶抑制剂例如，甲硫氨酸亚砜亚胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸（i转染之后培养所述细胞，并且在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下（例如，在核酸（ii转染之后培养所述细胞。[0010]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养胆固醇营养缺陷型细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码表达一种或多种选择性标志物的蛋白质的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0011]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0012]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0013]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。[0014]在一些实施方案中，核酸⑴编码3-酮基类固醇还原酶。[0015]在一些实施方案中，核酸（ii编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶DHFR或一种或多种抗生素例如，新霉素、杀稻瘟素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酚酸抗性基因。[0016]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0017]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸（i转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。[0018]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养不表达功能性二氢叶酸还原酶DHFR的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：⑴编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码DHFR的核酸；以及（iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0019]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0020]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0021]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。[0022]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0023]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后）培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在DHFR抑制剂（例如，甲硫氨酸亚砜亚胺MSX的情况下（例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸（i转染期间和或之后培养所述细胞。[0024]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在DHFR抑制剂（例如，甲硫氨酸亚砜亚胺MSX的情况下培养所述细胞。[0025]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对新霉素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码新霉素抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0026]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0027]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0028]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码来自编码氨基糖苷3’-磷酸转移酶ΑΡΗ3‘II的Tn5的新霉素抗性基因。[0029]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0030]在一些实施方案中，第一表达载体和第二表达载体均含有HC和LC，一种载体含有KSR并且另一种载体含有GS或另一种抗生素抗性基因。在一些实施方案中，存在三种单独的载体例如，用于三重选择），其中全部三种载体都含有HC和LC;第一载体含有KSR，第二载体含有GS，而第三载体含有任意的抗生素抗性基因，例如ΝΕ0。[0031]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨基糖苷类抗生素例如，G418的情况下例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0032]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在氨基糖苷类抗生素例如，G418的情况下培养所述细胞。[0033]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对杀稻瘟素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码杀稻瘟素抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0034]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0035]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0036]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸（ii编码来自蜡状芽胞杆菌Bacilluscereus的杀稻瘟素抗性基因（其编码杀稻瘟素-S脱氨酶）。[0037]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0038]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在肽基核苷抗生素例如，杀稻瘟素）的情况下例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0039]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽基核苷抗生素氨基糖苷类抗生素例如，杀稻瘟素的情况下培养所述细胞。[0040]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对潮霉素B敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码潮霉素B抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0041]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0042]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0043]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码潮霉素B磷酸转移酶。[0044]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0045]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨基糖苷类抗生素例如，潮霉素B的情况下例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0046]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽基核苷抗生素氨基糖苷类抗生素例如，潮霉素B的情况下培养所述细胞。[0047]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对嘌呤霉素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码嘌呤霉素抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0048]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0049]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0050]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶。[0051]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0052]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨基核苷抗生素例如，嘌呤霉素）的情况下例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0053]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽基核苷抗生素氨基核苷抗生素例如，嘌呤霉素的情况下培养所述细胞。[0054]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对Zeocin敏感的胆固醇营养缺陷型细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码Zeocin抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0055]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0056]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0057]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码Shble基因产物。[0058]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0059]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在铜螯合的糖肽抗生素例如，Zeocin的情况下（例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸（i转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在铜螯合的糖肽抗生素例如，Zeocin的情况下培养所述细胞。[0060]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对霉酚酸MPA敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码MPA抗性基因的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0061]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0062]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0063]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶Ecogpt基因。[0064]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0065]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在MPA的情况下（例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0066]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在MPA的情况下培养所述细胞。[0067]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养对霉酚酸MPA敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码MPA抗性基因的核酸；以及（iii编码所述治疗性蛋白质的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0068]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0069]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0070]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶Ecogpt基因。[0071]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和（iii。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0072]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在MPA的情况下（例如，在核酸（ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。[0073]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在MPA的情况下培养所述细胞。[0074]在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括:培养胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞;用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质例如，KSR的核酸；（ii编码能够使所述细胞中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质例如，谷胱甘肽合成酶的核酸；（iii编码能够提供对G418的抗性的蛋白质的核酸例如，新霉素抗性基因）；以及（iv编码所述治疗性蛋白质例如，抗体，例如重链和轻链的核酸;在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。[0075]在一些实施方案中，首先将核酸（iii转染，并在转染期间和或转染后将G418添加至细胞培养基。在一些实施方案中，首先将核酸iii转染，并在转染期间和或转染后将G418添加至细胞培养基;并且第二步将核酸（ii转染，并在转染期间和或转染后，细胞培养基中不存在胆固醇。在一些实施方案中，首先将核酸（iii转染，并在转染期间和或转染后将G418添加至细胞培养基;并且第二步将核酸（ii转染，并在转染期间和或转染后，细胞培养基中不存在胆固醇例如，外源添加的胆固醇）；并且第三步将核酸（i转染，并在转染期间转染后，细胞培养基中不存在谷氨酰胺例如，外源添加的谷氨酰胺）（任选地将甲硫氨酸亚砜亚胺MSX添加至细胞培养基）。[0076]在一些实施方案中，将核酸（ii和（i同时转染，其中将G418添加至细胞培养基，并且该细胞培养基不含胆固醇例如，外源添加的胆固醇）。在一些实施方案中，将核酸i、ii、（iii和（iv同时转染，其中将G418添加至细胞培养基，并且该细胞培养基不含胆固醇例如，外源添加的胆固醇并且不含谷氨酰胺例如，外源添加的谷氨酰胺）（任选地将甲硫氨酸亚砜亚胺MSX添加至细胞培养基）。在一些实施方案中，将核酸（iv掺入与（i、ii和（iii中的每一个均相同的核酸序列（例如，载体）中。在一些实施方案中，将核酸iv掺入与⑴和（ii;⑴和（iii;或（ii和（iii中的每一个均相同的核酸序列例如，载体）中。在一些实施方案中，核酸（iv编码治疗性抗体的重链和轻链。在一些实施方案中，将所述轻链掺入与⑴和（ii;⑴和（iii;ii和（iii;或⑴、（ii和（iii中的每一个均相同的核酸序列（例如，载体）中。在一些实施方案中，将所述重链掺入与（i和（ii;i和iii;ii和（iii;或⑴、（ii和iii中的每一个均相同的核酸序列例如，载体）中。在一些实施方案中，将所述轻链和重链掺入与（i和（ii;i和（iii;ii和（iii;或⑴、（ii和iii中的每一个均相同的核酸序列例如，载体中。[0077]在一些实施方案中，将核酸（i、（ii、（iii和（iv中的任一种掺入单个核酸例如，单个载体）中。例如，在一些实施方案中，将核酸（i和（ii;i和（iii;i和（iv;⑴、（ii和（iii;⑴、（ii、（iii和（iv;ii和（iii;或（ii和（iv;iii和（iv掺入单个核酸上。在一些实施方案中，核酸（iv包含两种单独的核酸，一种编码治疗性抗体的重链，而一种编码治疗性抗体的轻链。在一些实施方案中，将所述重链掺入另一核酸例如（i、ii或（iii上。在一些实施方案中，将所述轻链掺入另一核酸例如⑴、（ii或（iii上。[0078]在一个实施方案中，所述细胞为NSO细胞。[0079]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为含Fc的融合蛋白。[0080]在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸（iv转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸i编码3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸ii编码谷氨酰胺合成酶。在一些实施方案中，核酸iii编码新霉素抗性基因。[0081]在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i和（iv，并且第二表达载体包含核酸（ii。在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸（ii和iv。在一些实施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进行。[0082]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸⑴转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下例如，在核酸（ii转染之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在谷氨酰胺合成酶抑制剂例如，甲硫氨酸亚砜亚胺）的情况下例如，在核酸ii转染期间和或之后培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸（i转染期间和或之后培养所述细胞。[0083]在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇、不存在外源引入的谷氨酰胺并且存在谷氨酰胺合成酶抑制剂例如，甲硫氨酸亚砜亚胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸（i转染之后培养所述细胞，并且在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下（例如，在核酸（ii转染之后培养所述细胞。附图说明[0084]图1示出了本文所述方法的示例性方案。[0085]图2示出了3-酮基类固醇还原酶的NCBI参考氨基酸序列（NP_057455SEQIDNo.1〇[0086]图3示出了HSD1707的NCBI参考mRNA序列（ΝΜ_016371·3SEQIDΝο·2。[0087]图4示出了谷氨酰胺合成酶的NCBI参考氨基酸序列（ΝΡ_002056.2SEQIDNo.3〇[0088]图5Α至E示出了谷氨酰胺合成酶的NCBI参考mRNA序列（匪_002065.6SEQIDNo·4〇[0089]图6示出了二氢叶酸还原酶DHFR的NCBI参考氨基酸序列ΝΡ_000782.1SEQIDNo.5〇[0090]图7Α-Β示出了DHFR的NCBI参考mRNA序列（ΝΜ_000791·3SEQIDΝο·6。[0091]图8示出了使用3-KSR细胞培养系统产生的蛋白质的稳定性。图8列出了对于10种不同的3-KSR细胞克隆，3-KSR细胞上清液中的最终蛋白质效价。四种克隆（3-261、3-330、3-351、3-997表现出高蛋白质效价。然而，如图8进一步所示，3-KSR克隆3-351表现出细胞单位生产率的下降。[0092]图9为示出使用Neo100ygml或200ygmlG418进行的细胞选择的线图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。[0093]图10为示出使用谷胱甘肽合成酶GS分别将谷氨酰胺浓度从2mM降低至OmM或从0.5mM降至OmM进行的细胞选择的线图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。[0094]图11为示出使用3-KSR、neo和GS作为三重选择而进行的细胞选择的线图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。neo基因可以赋予对G418的抗性。NSO中G418的浓度为100ugml和200ugml;将谷氨酰胺浓度从2mM降低至OmM或从0.5mM至OmM。还可使用MSX抑制剂来抑制GS活性。具体实施方式[0095]在某些重组蛋白质生产系统如NSO宿主细胞系统中，通过将3-酮基类固醇还原酶3-KSR基因引入编码治疗性蛋白质的载体中来开发胆固醇营养缺陷体，并且通过从培养基中除去胆固醇而选择重组细胞US20100028940。然而，本公开的发明人出人意料地发现，由于在该细胞系中难以扩增，该系统可能具有低生产率例如，每个细胞每天的蛋白质产物和低蛋白质效价参见例如图8。在其他NSO宿主细胞系统中，通过将谷氨酰胺合成酶GS基因引入编码治疗性蛋白质的载体中来开发谷氨酰胺营养缺陷体，并且通过从培养基中除去谷氨酰胺来选择转染的细胞。另外，可将GS抑制剂添加至培养基中以驱动针对GS基因的多个拷贝引入（因此针对编码感兴趣蛋白质的基因）的选择（Barnes等人，Cytotechnology.2000.Advancesinanimalcellrecombinantproteinproduction:GS-NSOexpressionsystemFeb;322:109-23。每个系统均具有不同的局限性。本文描述了在例如NSO宿主细胞系统中制备治疗性产物的替代方法。[0096]如本文所用的，“谷氨酰胺营养缺陷型”细胞被定义为不合成任何谷氨酰胺或不合成足以能够在无谷氨酰胺的细胞培养基中存活和生长的谷氨酰胺的细胞。[0097]如本文所用的，“胆固醇营养缺陷型”细胞被定义为不合成任何胆固醇或不合成足以能够在无胆固醇的细胞培养基中存活和生长的胆固醇的细胞。[0098]如本文所用的，“使谷氨酰胺生物合成恢复”是指将细胞中的谷氨酰胺生物合成水平从谷氨酰胺营养缺陷型细胞中的水平提高到至少使细胞能够在无谷氨酰胺细胞培养基中存活和生长的水平。[0099]如本文所用的，“使胆固醇生物合成恢复”是指将细胞中的胆固醇生物合成水平从胆固醇营养缺陷型细胞中的水平提高到至少使细胞能够在无胆固醇细胞培养基中存活和生长的水平。[0100]如本文所用的，“存活和生长”是指如通过台盼蓝排除法测量的，细胞或细胞培养物在对数期生长期间维持大于60%的细胞活力的能力。[0101]3-酮基类固醇还原酶KSR[0102]3-酮基类固醇还原酶由HSD1707基因编码，并在胆固醇的生物合成中起3-酮基类固醇还原酶的作用Marijanovic等人，MolEndocrinol.2003年9月；17⑶：1715-25C3NCBI参考氨基酸序列NP_057455和mRNA序列NM_016371.3分别参见图2SEQIDNo.1和图3SEQIDNo.2〇[0103]谷氨酰胺合成酶GS[0104]由谷氨酰胺合成酶基因编码的谷氨酰胺合成酶催化由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺Eisenberg等人，BiochimicaetBiophysicaActa，2000,Vol1477,122-145。已经发现了该基因的几种可变剪接转录物变体。NCBI参考氨基酸序列NP_002056.2和mRNA序列NP_002056.2分别参见图4SEQIDNo.3和图5SEQIDNo.4。[0105]二氢叶酸还原酶DHFR[0106]DHFR酶由DHFR基因编码，并将二氢叶酸转化为四氢叶酸——一种从头合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸所需的甲基穿梭体methylgroupshuttle。已经发现了该基因的几种可变剪接转录物变体。NCBI参考氨基酸序列NP_000782.1和mRNA序列NM_000791.3分别参见图6SEQIDNo.5和图7SEQIDNo.6。[0107]抗生素抗性基因选择性标志物[0108]抗生素抗性基因是哺乳动物细胞培养中常用的阳性选择性标志物（参见例如AntibodyExpressionandProduction,MohamedAl-Rubeai编，SpringerNetherlands,SpringerScienceBusinessMediaB.V.,ISBN978-94-007-1256-0；CelILineDevelopment,MohamedAl-Rubeai，2009年8月11日，SpringerScienceBusinessMedia〇示例性抗生素抗性基因包括但不限于赋予对新霉素抗性基因、杀稻瘟素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酚酸的抗性的基因。用于细胞选择的合适的抗生素抗性基因和相应的抑制剂会是本领域技术人员已知的。[0109]表1.示例性抗生素选择性标志物[0110][0111][0112][0113]载体、宿主细胞和治疗性蛋白质的产生[0114]本发明的治疗性蛋白质可由宿主细胞产生。宿主细胞是指包含将本文所述的多肽和构建体从其相应的核酸表达所需的必需细胞组分例如，细胞器）的媒介。核酸可包含在核酸载体中，该核酸载体可通过本领域已知的常规技术例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射、感染等）引入到宿主细胞中。核酸载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞来源于原核生物例如，细菌或真核生物（例如，哺乳动物。[0115]核酸载体构建与宿主细胞[0116]编码本发明治疗性蛋白质的氨基酸序列的核酸序列可通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导的或位点定向的诱变和PCR诱变。编码本发明的治疗性蛋白质的核酸分子可使用标准技术例如基因合成来获得。或者，可使用本领域的标准技术，例如QuikChange™诱变，使编码野生型治疗性蛋白质的核酸分子突变，以含有特定的氨基酸置换。可使用核苷酸合成仪或PCR技术来合成核酸分子。[0117]可将编码本发明的治疗性蛋白质的核酸序列插入能够在原核或真核宿主细胞中复制并表达核酸分子的载体中。本领域中有许多可用的载体，并且其可用于本发明的目的。每种载体均可包含可针对与特定宿主细胞的相容性进行调整和优化的各种组分。例如，载体组分可包括但不限于复制起点、选择性标志物基因、启动子、核糖体结合位点、信号序列、编码感兴趣蛋白质的核酸序列和转录终止序列。[0118]在一个实例中，本发明的载体包括:包含用于选择性基因（例如，3-酮基类固醇还原酶和谷氨酰胺合成酶）的弱启动子和用于编码感兴趣蛋白质（例如，抗体，例如抗体的重链和轻链的基因的强启动子的载体。可对载体进行线性化或超螺旋化，从而表现出提高的转染效率。在一些实施方案中，采用载体的密码子优化来使编码序列中罕见密码子的使用减至最少并且提高蛋白质生产产率。Wurm2004NatureBiotechnology，Vol22;Issue11:1393-1398中描述了本发明的示例性载体。[0119]在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞作为本发明的宿主细胞。谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型表型可通过对非谷氨酰胺营养缺陷型且非胆固醇型营养缺陷型的细胞进行遗传操作来诱导，该遗传操作包括例如内源性谷氨酰胺生物合成所必需的基因如谷氨酰胺合成酶）的突变或缺失。遗传工程化的常用方法是本领域技术人员公知的，例如，位点定向诱变、锌指核酸酶、shRNA、转座子，参见例如Cytotechnology.2007年4月；531-3:65-73。被称为NSO的鼠骨髓瘤细胞是已知的谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型的细胞（参见例如Barnes等人，Cytotechnology.2000.Advancesinanimalcellrecombinantproteinproduction:GS-NSOexpressionsystemFeb;322:109-23;以及US20100028940。[0120]可被操作以用作宿主细胞的哺乳动物细胞类型的其他实例包括但不限于人胚肾HEK例如HEK293，HEK293F、中国仓鼠卵巢（CHO、HeLa、C0S、PC3、Vero、MC3T3、NS0、VERY、BHK、MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、CRL7030和HsS78Bst细胞。在其他实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294ATCC®31，446、大肠杆菌λ1776ΑΤΧ®31，537、大肠杆菌BL210已3八丁〇：@8厶厶-1025和大肠杆菌1^308八丁：€：?31，608。不同的宿主细胞具有用于蛋白质产物翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达的治疗性蛋白质的正确修饰和加工。可使用本领域的常规技术，例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀和直接显微注射，将上述表达载体导入合适的宿主细胞中。一旦将载体导入宿主细胞中用于蛋白质生产，就将宿主细胞在适当改良的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。用于表达治疗性蛋白质的方法是本领域已知的，参见例如PaulinaBaibas,ArgeliaLorence编）RecombinantGeneExpression:ReviewsandProtocolsMethodsinMolecularBiology,HumanaPress；2004年第二版（2004年7月20日）以及VladimirVoynov和JustinA.Caravella编）TherapeuticProteins:MethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiologyHumanaPress;2012年第二版（2012年6月28日）。[0121]蛋白质生产、回收和纯化[0122]用于产生本发明的治疗性蛋白质的宿主细胞可在本领域已知的并且适用于培养选定的宿主细胞的培养基中生长。用于哺乳动物宿主细胞的合适培养基的实例包括最小必需培养基MEM、Dulbecco改良Eagle培养基DMEM、Expi293™表达培养基、补充有胎牛血清FBS的DMEM，和RPMI-1640。用于细菌宿主细胞的合适培养基的实例包括加有必需补充剂如选择剂例如氨苄青霉素的Luria肉汤LB。在合适的温度如约20°C至约39°C，例如25°C至约37°C，优选37°C和CO2水平如5至10%优选8%下培养宿主细胞。培养基的pH通常为约6.8至7.4，例如7.0，主要取决于宿主生物体。如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。用于产生治疗性蛋白质的常规细胞培养条件是本领域已知的，例如参见Butler,CellCultureandUpstreamProcessing,TaylorFrancis;第一版（2007年5月25日）。[0123]蛋白质回收通常涉及破坏宿主细胞，该破坏通常通过诸如渗透压休克、声处理或裂解等手段进行。一旦将细胞破坏，就可通过离心或过滤去除细胞碎片。可进一步纯化蛋白质。可通过蛋白质纯化领域已知的任何方法来纯化本发明的抗体，例如，通过蛋白A亲和层析、其他层析例如，离子交换层析、亲和层析和大小排阻柱层析）、离心、溶解度差异或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。（参见ProcessScalePurificationofAntibodies，UweGottschalk编）JohnWileySons，Inc·，2009。在一些情况下，可将治疗性蛋白质与标志物序列如肽相缀合，以促进纯化。标记氨基酸序列的一个实例为以微摩尔亲和力结合镍官能化琼脂糖亲和柱的六组氨酸肽His-标签）。对纯化有用的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于来源于流感血凝素蛋白质的表位。[0124]药物组合物和制剂[0125]本发明的特征在于包含一种或多种本文所述的治疗性蛋白质的药物组合物。除治疗有效量的治疗性蛋白质外，该药物组合物还可含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其可通过本领域技术人员已知的方法配制。[0126]药物组合物中可接受的载体和赋形剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的。可接受的载体和赋形剂可包括缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、聚合物、氨基酸和碳水化合物。本发明的药物组合物可以以可注射制剂的形式肠胃外施用。可使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制用于注射（即，静脉内注射的药物组合物。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基（例如，Dulbecco改良Eagle培养基DMEM、α-改良Eagles培养基α-MEM、F_12培养基）。配制方法是本领域已知的，参见例如Banga编）TherapeuticPeptidesandProteins!Formulation,ProcessingandDeliverySystems第二版TaylorFrancisGroup,CRCPress2006〇[0127]可根据需要以单位剂量形式形成药物组合物。包含在药物制剂中的活性成分例如，一种或多种本发明的治疗性蛋白质）的量使得提供在指定范围内的合适剂量例如，在0.01-500mgkg体重范围内的剂量）。[0128]治疗性蛋白质[0129]可通过本文所述的方法制备的治疗性蛋白质包括任何感兴趣的重组治疗性蛋白质或其生物相似物，包括但不限于抗体例如，单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体）、融合蛋白（例如，Fc融合体）、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白质支架、酶、生长因子、激素、激素释放因子、干扰素、白细胞介素和溶栓剂。治疗性蛋白质包括糖基化蛋白质例如，具有至少一个寡糖链的蛋白质和非糖基化蛋白质。[0130]示例性的单克隆抗体包括但不限于阿达木单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、依库珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、ofatumab、卡那奴单抗、贝利木单抗、阿利库单抗、美泊利单抗、奈昔木单抗、纳武单抗、地努图希单抗、苏金单抗、依伏库单抗、兰妥莫单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗、雷昔库单抗、培妥珠单抗、本妥昔单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、托珠单抗、奥法木单抗、卡那奴单抗、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、雷珠单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、依法珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿仑珠单抗、吉妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗和阿昔单抗（adalimumab，infiIiximab，palivizumab，cetuximab，natalizumab,eculizumab,ustekinumab,goIimumab,ofatumab,canakinumab,belimumab,alirocumab,mepolizumab,necitumumab,nivolumab,dinutuximab,secukinumab,evolocumab,blinatumomab,pembroIizumab,ramucirumab,vedoIizumab,siltuximab,obinutuzumab,trastuzumab,raxibacumab,pertuzumab,brentuximab,ipiIimumab,denosumab,tociIizumab,ofatumumab,canakinumab,certoIizumab,catumaxomab,ranibizumab，panitumumab，bevacizumab,cetuximab，efalizumab，omalizumab，tositumomab,ibritumomab,alemtuzumab,gemtuzumab,basiIiximab,dadizumab,rituximab，andabciximab〇[0131]示例性的融合蛋白包括但不限于阿来西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、2；^-阿柏西普、利纳西普、罗米司亭、3口0〇6口1：、1^6311311；[13、13118113；[1]101和杜拉鲁肽alefacept,entanercept,abatacept,belatacept,afIibercept,ziv~afIibercept,rilonacept,romiplostim,apocept,trebananib,blisibimod,anddulaglutide〇[0132]其他实施方案[0133]下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用并入本文。[0134]实施例[0135]实施例1.利用双重营养缺陷型细胞制备治疗性抗体[0136]以下实施例描述了制备治疗性蛋白质如抗体的方法，其包括在胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞中表达感兴趣的治疗性蛋白质。该方法符合预期地允许感兴趣基因的扩增和拷贝数增加，以及在不存在胆固醇的情况下的生产胆固醇在水溶液中高度不溶并且其使用非常具有挑战性）。该示例性方法在图1中进一步概述。[0137]用包含编码3-酮基类固醇还原酶3-KSR的核酸的第一载体来转染谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型的细胞，如NSO细胞。在该第一次转染期间和之后，将细胞维持在不含胆固醇的培养基中以选择表达第一载体的细胞，由此产生表达3-KSR的谷氨酰胺营养缺陷型细胞培养物。同时或随后，用包含编码谷氨酰胺合成酶GS和感兴趣蛋白质（例如，治疗性抗体的重链和轻链的核酸的第二载体转染这些细胞。在该第二次转染期间和之后，将细胞维持在无谷氨酰胺的细胞培养基中以选择表达第二载体的细胞。为了进一步选择已经引入多个拷贝的第二载体的细胞，在第二次转染期间和或之后，为细胞培养基补充谷氨酰胺合成酶抑制剂，如甲硫氨酸亚砜亚胺MSX。最终的产生3-KSR-GS抗体的细胞可保持在无胆固醇的培养基中，从而避免与胆固醇相关的制备问题，并且其显示出来源于MSX选择的高水平生产率。[0138]实施例2:细胞活力测定:[0139]以下实施例描述了用于确定细胞活力的台盼蓝测定法，细胞活力作为表现出充分存活和生长的细胞的指标。[0140]在pH7.2至7.3的缓冲等渗盐溶液卿，磷酸盐缓冲盐水）中制备台盼蓝的0.4%溶液。将0.ImL的台盼蓝储备液添加至ImL的细胞。加载血细胞计数器并且在低放大倍数的显微镜下立即检查。对蓝色染色的细胞数目和细胞总数进行计数。细胞活力以血细胞计数器上网格内的活细胞数目除以细胞总数来计算。如果细胞吸收台盼蓝，则其被认为是非存活的。对于健康的对数期培养物，细胞活力至少为90%。[0141]%活细胞=[1.00-蓝色细胞数目+细胞总数]XlOO[0142]细胞系悬浮液的细胞密度可使用血细胞计数器来测定。[0143]为了计算每mL培养物中的活细胞数目，使用以下公式来校正稀释因数:活细胞数目父1^4\1.1=细胞11^培养物。[0144]实施例3.利用三重选择方法制备治疗性抗体[0145]以下实施例描述了制备治疗性蛋白质如抗体的方法，其包括在具有另外的第三选择机制例如新霉素抗性基因（例如，使用G418来选择的具胆固醇营养缺陷型和谷氨酰胺营养缺陷型的细胞中表达感兴趣的治疗性蛋白质。该方法符合预期地允许感兴趣基因的扩增和拷贝数增加，以及在不存在胆固醇的情况下的生产胆固醇在水溶液中高度不溶且其使用非常具有挑战性），同时克服与3-KSR细胞培养选择系统相关的意外的制备挑战，包括例如低生产率。[0146]首先使用单一新霉素选择（图9和单一GS选择（图10来优化NSO细胞选择。对于新霉素优化，根据标准惯例，用编码新霉素抗性基因的核酸载体转染细胞。然后以（l〇〇ygml或200ygml将新霉素添加至细胞培养基中以供选择。在回收后的指定天数时测量细胞活力。对于基于GS的选择，用编码GS的核酸载体转染细胞，并将细胞维持在无谷氨酰胺细胞培养基中。在回收后的指示天数时测量细胞活力。使用新霉素、3-KSR和GS选择来优化基于3-KSR的三重选择方法，以克服与3-KSR选择相关的意外的低生产率（图8。根据标准惯例，用一种或多种编码3_KSR、GS和新霉素抗性基因的核酸载体转染细胞。对于选择，将细胞维持在不存在谷氨酰胺和胆固醇并存在新霉素的情况下。如图11所示，三重选择在回收后维持充足的细胞活力。

权利要求：1.一种制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括：培养胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码能够使所述细胞中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。2.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体。3.如权利要求1所述的方法，其中在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中核酸⑴编码3-酮基类固醇还原酶。5.如权利要求1所述的方法，其中核酸ii编码谷氨酰胺合成酶。6.如权利要求1所述的方法，其中第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸ii。7.如权利要求1所述的方法，其中第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和iii。8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一表达载体的转染在所述第二表达载体的转染之前进行。9.如权利要求7所述的方法，其中所述第一表达载体的转染与所述第二表达载体的转染同时进行。10.如任一前述权利要求所述的方法，其中在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸i转染之后培养所述细胞。11.如任一前述权利要求所述的方法，其中在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下（例如，在核酸ii转染之后培养所述细胞。12.如权利要求1所述的方法，其中在存在谷氨酰胺合成酶抑制剂例如，甲硫氨酸亚砜亚胺的情况下例如，在核酸ii转染期间和或之后培养所述细胞。13.如权利要求1所述的方法，其中在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。14.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述细胞为NSO细胞。15.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、依库珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、ofatumab、卡那奴单抗、贝利木单抗、阿利库单抗、美泊利单抗、奈昔木单抗、纳武单抗、地努图希单抗、苏金单抗、依伏库单抗、兰妥莫单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗、雷昔库单抗、培妥珠单抗、本妥昔单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、托珠单抗、奥法木单抗、卡那奴单抗、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、雷珠单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、依法珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿仑珠单抗、吉妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、阿昔单抗、阿来西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、ziv_阿柏西普、利纳西普、罗米司亭、apocept、trebananib、blisibimod和杜拉鲁肽。16.—种制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括：培养胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码表达一种或多种选择性标志物的蛋白质的核酸；以及iii编码所述治疗性蛋白质的一种或多种核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。17.如权利要求16所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体。18.如权利要求16所述的方法，其中在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iii转染所述细胞。19.如权利要求16所述的方法，其中核酸⑴编码3-酮基类固醇还原酶。20.如权利要求16所述的方法，其中核酸（ii编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶DHFR或一种或多种抗生素例如，新霉素、杀稻痕素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酸酸）抗性基因。21.如权利要求16所述的方法，其中第一表达载体包含核酸（i和（iii，并且第二表达载体包含核酸ii。22.如权利要求16所述的方法，其中第一表达载体包含核酸（i，并且第二表达载体包含核酸ii和iii。23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一表达载体的转染在所述第二表达载体的转染之前进行。24.如权利要求22所述的方法，其中所述第一表达载体的转染与所述第二表达载体的转染同时进行。25.如权利要求16所述的方法，其中在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸i转染之后培养所述细胞。26.如权利要求16所述的方法，其中在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下（例如，在核酸ii转染之后培养所述细胞。27.如权利要求16所述的方法，其中在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。28.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞为NSO细胞。29.如权利要求16所述的方法，其中所述蛋白质选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、依库珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、ofatumab、卡那奴单抗、贝利木单抗、阿利库单抗、美泊利单抗、奈昔木单抗、纳武单抗、地努图希单抗、苏金单抗、依伏库单抗、兰妥莫单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗、雷昔库单抗、培妥珠单抗、本妥昔单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、托珠单抗、奥法木单抗、卡那奴单抗、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、雷珠单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、依法珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿仑珠单抗、吉妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、阿昔单抗、阿来西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、ziv_阿柏西普、利纳西普、罗米司亭、apocept、trebananib、blisibimod和杜拉鲁肽。30.—种制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括：培养胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：（i编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；（ii编码表达第一选择性标志物的蛋白质的核酸；（iii编码表达第二选择性标志物的蛋白质的核酸；以及iv编码所述治疗性蛋白质的一种或多种核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和或纯化所述治疗性蛋白质。31.如权利要求30所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体。32.如权利要求30所述的方法，其中在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸iv转染所述细胞。33.如权利要求30所述的方法，其中核酸⑴编码3-酮基类固醇还原酶。34.如权利要求30所述的方法，其中核酸（ii编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶DHFR或一种或多种抗生素例如，新霉素、杀稻痕素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酸酸）抗性基因。35.如权利要求30所述的方法，其中核酸（iii编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶DHFR或一种或多种抗生素例如，新霉素、杀稻痕素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酸酸）抗性基因。36.如权利要求30所述的方法，其中在不存在外源引入的胆固醇的情况下（例如，在核酸i转染之后培养所述细胞。37.如权利要求30所述的方法，其中在不存在外源引入的谷氨酰胺的情况下（例如，在核酸ii转染之后培养所述细胞。38.如权利要求30所述的方法，其中在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下（例如，在核酸i转染期间和或之后培养所述细胞。39.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞为NSO细胞。40.如权利要求30所述的方法，其中所述蛋白质选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、依库珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、ofatumab、卡那奴单抗、贝利木单抗、阿利库单抗、美泊利单抗、奈昔木单抗、纳武单抗、地努图希单抗、苏金单抗、依伏库单抗、兰妥莫单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗、雷昔库单抗、培妥珠单抗、本妥昔单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、托珠单抗、奥法木单抗、卡那奴单抗、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、雷珠单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、依法珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿仑珠单抗、吉妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、阿昔单抗、阿来西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、ziv_阿柏西普、利纳西普、罗米司亭、apocept、trebananib、blisibimod和杜拉鲁肽。41.如权利要求30所述的方法，其中核酸（ii编码谷氨酰胺合成酶，并且核酸（iii编码一种或多种抗生素例如，新霉素、杀稻瘟素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酚酸抗性基因。42.如权利要求30所述的方法，其中核酸（ii编码谷氨酰胺合成酶，并且核酸（iii编码新霉素抗生素抗性基因。

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