申请/专利权人：中国计量大学

申请日：2018-07-25

公开（公告）日：2021-10-12

公开（公告）号：CN109006479B

主分类号：A01H4/00(20060101)

分类号：A01H4/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.10.12#授权;2019.01.11#实质审查的生效;2018.12.18#公开

摘要：本发明公开了一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，按下列步骤进行：1）幼胚的获得；2）萌发芽生根培养；3）培养苗壮苗培养；4）再生植株移栽。本发明通过在野茭结实初期进行采收，避免了成熟后的种子脱落，对未成熟种子采用幼胚培养的方法处理，诱导获得大量再生植株，通过调节培养基配方，确定最佳培养方案，茭白再生苗获得率高达到96.5%。

主权项：1.一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于按下列步骤进行：1）幼胚的获得野茭结实中期进行种子采收，将采收回来的种子剥掉外壳后依次用清水、酒精、无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水进行清洗及消毒，将清洗过的种子放在灭过菌的滤纸，吸去多余水分，在解剖显微镜下用解剖针挑取无菌种胚为外植体，将种胚接种于诱导培养基中，基本培养基为改良MS,添加浓度为40g·L-1的蔗糖、9.5-10g·L-1的琼脂、0.1g·L-1的L-谷氨酰胺、0.5g·L-1的酪蛋白、1mg·L-1的IAA、2mg·L-1的2，4-D、2mg·L-1的维生素B5；培养条件：暗培养1周后，幼胚分化获得小的幼苗，然后进行光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25℃，培养两周后，得绿色幼苗；野茭结实中期是指种子脱落前成熟度程度为5-7成的时期，即花蕊脱落12-16天，外稃绿褐色，种皮浅褐色；2）萌发芽生根培养将萌发芽接种于生根培养基中，生根培养基的基本培养基为12MS，添加浓度为25g·L-1的蔗糖、9.5-10g·L-1的琼脂、0.5g·L-1的水解酪蛋白、0.5mg·L-1的维生素B5、0.5mg·L-1的IBA，培养条件：光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25℃，培养两周，得培养苗；3）培养苗壮苗培养两周以后，将生根的培养苗接种于壮苗培养基中，壮苗培养基的基本培养基为改良MS，添加40g·L-1的蔗糖、9.5-10g·L-1的琼脂、1.0g·L-1的6BA、0.05mg·L-1的NAA，培养条件：光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25℃，培养两周，得再生植株；4）再生植株移栽两周后，将再生植株进行驯化移栽，将其放在驯化室6000lux强光下炼苗一周，然后取出再生植株，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于土中。

全文数据：一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法技术领域[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法。背景技术[0002]茭白古称菰，为水生宿根性草本植物。它属于禾本科菰属，是一种营养丰富的水生蔬菜。我们所食用的部位是茭白植株被菰黑粉菌侵染后形成的膨大肉质茎。内生真菌-菰黑粉菌成功侵染茭白植株后，会导致茭白茎部膨大。茭白表型可以分为:正常茭、雄茭及灰茭三种。但在田间发现了会开花的野茭（古称，但野茭结的种子却很难萌发，面临的困难主要有两方面:1.成熟的种子易脱落，难采收;2.种子很难萌发，之前我们试过各种方法，放在土里，培养基里，萌发率都很低。已有研究表明，将菰种子浸泡48h，温度34°C30°C，光照周期比（L:D16h:8h条件下发芽率可以达到62.9%，但萌发率仍然较低，亟需解决茭白再生苗尚效获得的问题。发明内容[0003]针对现有技术中存在的问题，本发明涉及的目的在于提供一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法。[0004]本发明通过以下技术方案加以实现：所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于按下列步骤进行：1幼胚的获得野茭结实中期进行种子采收，将采收回来的种子剥掉外壳后依次用清水、酒精、无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水进行清洗及消毒，将清洗过的种子放在灭过菌的滤纸，吸去多余水分，在解剖显微镜下用解剖针挑取无菌种胚为外植体，将种胚接种于诱导培养基中，基本培养基为改良MS，添加浓度为40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、O.lg·I71的L-谷氨酰胺、0.5g·I71的酪蛋白、Img·I71的IAA、2mg·I71的2,4-D、2mg·I71的维生素B5;培养条件：光培养，光强300011«，光周期16811，温度25€，培养两周后，得萌发芽；2萌发芽生根培养将萌发芽接种于生根培养基中，生根培养基的基本培养基为12MS，添加浓度为25g·L_1的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、0.5g·I71的水解酪蛋白、0.5mg·I1的维生素B5、0.5mg·L_1的IBA，培养条件:光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得培养苗；3培养苗壮苗培养两周以后，将生根的培养苗接种于壮苗培养基中，壮苗培养基的基本培养基为改良MS，添加40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、l.Og·I71的6BA、0.05mg·I71的NAA，培养条件：光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得再生植株；4再生植株移栽两周后，将再生植株进行驯化移栽，将其放在驯化室60001UX强光下炼苗一周，然后取出再生植株，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于土中。[0005]所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤1中野茭结实初期是指种子脱落前成熟度为5-7成的时期，即花蕊脱落12-16天，外稃绿褐色，种皮浅褐色。[0006]所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤1中清洗及消毒的顺序依次为清水冲洗三次，每次3min，75%的酒精清洗三次，每次3min，无菌水继续冲洗三次，每次5min，次氯酸钠溶液清洗10分钟，每次3min，最后用无菌水再清洗三次，每次5min〇[0007]所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于所述次氯酸钠溶液的浓度为3%。[0008]所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤4中温水温度为25-30°C。[0009]本发明通过在野茭结实初期进行采收，避免了成熟后的种子脱落，对未成熟种子采用幼胚培养的方法处理，诱导获得大量再生植株，通过调节培养基配方，确定最佳培养方案，茭白种胚萌发率高达到96.5%。附图说明[0010]图1为茭白幼胚拯救用种子表型；（a为结实中期未成熟种子，（b为脱落的成熟种子；图2为幼胚拯救及幼苗再生图；图3为再生幼苗生根培养图；图4为再生苗壮苗培养图；图5为再生苗移栽图。具体实施方式[0011]以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，并给出具体实施方式。实施例[0012]利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，按下列步骤进行：1幼胚的获得如图1所示，野茭结实初期进行种子采收，即在种子脱落前，种子成熟度达5-7成熟的时期进行采收，此时，花蕊脱落12-16天，外稃绿褐色，种皮浅褐色。将采收回来的种子剥掉外壳后依次用清水、酒精、无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水进行清洗及消毒，具体为:清水冲洗三次，每次3min，75%的酒精清洗三次，每次3min，无菌水继续冲洗三次，每次5min，3%次氯酸钠溶液清洗10分钟，每次3min，最后用无菌水再清洗三次，每次5min，将清洗过的种子放在灭过菌的滤纸，吸去多余水分，在解剖显微镜下用解剖针挑取无菌种胚为外植体，将种胚接种于诱导培养基中，基本培养基为改良MS，添加浓度为40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、O.lg·L-1的L-谷氨酰胺、0.5g·I71的酪蛋白、Img·I71的IAA、2mg·I71的2,4-D、2mg·171的维生素135;培养条件:光培养，光强300011«，光周期16811，温度25€，培养两周后，得萌发芽；2萌发芽生根培养将萌发芽接种于生根培养基中，生根培养基的基本培养基为12MS，添加浓度为25g·L_1的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、0.5g·I71的水解酪蛋白、0.5mg·I1的维生素B5、0.5mg·L_1的IBA，培养条件:光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得培养苗；3培养苗壮苗培养两周以后，将生根的培养苗接种于壮苗培养基中，壮苗培养基的基本培养基为改良MS，添加40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、l.Og·I71的6BA、0.05mg·I71的NAA，培养条件：光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得再生植株；4再生植株移栽两周后，将再生植株进行驯化移栽，将其放在驯化室60001UX强光下炼苗一周，然后取出再生植株，用30-40°C温水洗净根部的培养基，将植株移栽于土中。移栽成活率达98%。[0013]试验例1该试验例1的方法同实施例步骤1方法相同，不同之处在于种胚接种于诱导培养基的配方为:基本培养基为改良MS，添加浓度为40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、O.lg·I71的L-谷氨酰胺、0.5g·I71的酪蛋白、2mg·I71的IAA、2mg·I71的2,4-D、2mg·I71的维生素B5;两周后统计实施例和试验例1的发芽率，结果见表1。[0014]表1种胚萌发对比从表1可知，采用本发明配方的诱导培养基，其在其他条件相同的条件下，种胚萌发率明显高于试验例1的种胚萌发情况。[0015]试验例2将实施例获得的萌发芽接种到本试验例中的生根培养基中，该试验例生根培养基的基本培养基为12MS，添加浓度为25g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、0.5g·I71的水解酪蛋白、0.5mg·I71的NAA，生根情况见图2。图2可知，实施例中的生根培养基中的苗长势良好。[0016]试验例3将实施例获得的生根的培养苗接种到本试验例中的壮苗培养基中，该试验例壮苗培养基的基本培养基为改良MS，添加40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、Img·I71的GA3,苗生长情况见图3。图3可知，实施例中的壮苗培养基中的苗长势良好。[0017]本发明中改良MS培养基不含琼脂和鹿糖配方mgL:PotassiumNitrate硝酸钾1900AmmoniumNitrate硝酸鞍1650PotassiumPhosphateMonobasic磷酸二氢钾170MagnesiumSulfate硫酸儀370CalciumChloride氯化I丐440PotassiumIodide鹏化钾0.83BoricAcid硼酸6.2ManganeseSulfate硫酸猛22.3ZincSulfate硫酸锌8.6SodiumMolybdate钼酸钠0.25CupricSulfate硫酸铜0.025CobaltChloride.6H20氯化钴0.025Na2EDTA乙二胺四乙酸二钠37.3FerrousSulfate硫酸亚铁27.8Myo-Inosito1肌醇100Glycin甘氨酸2Thiamine.HCl盐酸硫胺素0.1Pyridoxine.HCl盐酸卩比卩多醇0.5NicotinicAcid烟酸0.5。[0018]12MS培养基不含琼脂和蔗糖配方mgL:PotassiumNitrate硝酸钾9500AmmoniumNitrate硝酸鞍825PotassiumPhosphateMonobasic磷酸二氢钾85MagnesiumSulfate硫酸儀185CalciumChloride氯化I丐220PotassiumIodide鹏化钾0.83BoricAcid硼酸6.2ManganeseSulfate硫酸猛22.3ZincSulfate硫酸锌8.6SodiumMolybdate钼酸钠0.25CupricSulfate硫酸铜0.025CobaltChloride.6H20氯化钴0.025Na2EDTA乙二胺四乙酸二钠37.3FerrousSulfate硫酸亚铁27.8Myo-Inosito1肌醇100Glycin甘氨酸2Thiamine.HCl盐酸硫胺素0.1Pyridoxine.HCl盐酸卩比卩多醇0.5NicotinicAcid烟酸0.5。

权利要求：1.一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于按下列步骤进行：1幼胚的获得野茭结实中期进行种子采收，将采收回来的种子剥掉外壳后依次用清水、酒精、无菌水、次氯酸钠溶液、无菌水进行清洗及消毒，将清洗过的种子放在灭过菌的滤纸，吸去多余水分，在解剖显微镜下用解剖针挑取无菌种胚为外植体，将种胚接种于诱导培养基中，基本培养基为改良MS，添加浓度为40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、O.lg·I71的L-谷氨酰胺、0.5g·I71的酪蛋白、Img·I71的IAA、2mg·I71的2,4-D、2mg·I71的维生素B5;培养条件：暗培养1周后，幼胚分化获得小的幼苗，然后进行光培养，光强30001uX，光周期168h，温度25°C，培养两周后，得绿色幼苗；2萌发芽生根培养将萌发芽接种于生根培养基中，生根培养基的基本培养基为12MS，添加浓度为25g·L_1的蔗糖、9.5-1^.171的琼脂、0七.171的水解酪蛋白、0.511^171的维生素、0.511^171的IBA，培养条件:光培养，光强3000Iux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得培养苗；3培养苗壮苗培养两周以后，将生根的培养苗接种于壮苗培养基中，壮苗培养基的基本培养基为改良MS，添加40g·I71的蔗糖、9.5-10g·I71的琼脂、l.Og·I71的6BA、0.05mg·I71的NAA，培养条件：光培养，光强3000lux，光周期168h，温度25°C，培养两周，得再生植株；4再生植株移栽两周后，将再生植株进行驯化移栽，将其放在驯化室60001UX强光下炼苗一周，然后取出再生植株，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于土中。2.如权利要求1所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤1中野茭结实中期是指种子脱落前成熟度程度为5-7成的时期，即花蕊脱落12-16天，外稃绿褐色，种皮浅褐色。3.如权利要求1所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤1中清洗及消毒的顺序依次为清水冲洗三次，每次5min，75%的酒精清洗三次，每次3min，无菌水继续冲洗三次，每次5min，次氯酸钠溶液清洗10分钟，最后用无菌水再清洗三次，每次5min〇4.如权利要求1或3所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于所述次氯酸钠溶液的浓度为2%-3%。5.如权利要求1所述的一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法，其特征在于步骤4中水洗温水温度为25-30°C。

百度查询： 中国计量大学 一种利用茭白幼胚进行再生苗诱导的方法

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