申请/专利权人：山东农业大学

申请日：2018-07-26

公开（公告）日：2021-11-16

公开（公告）号：CN108866096B

主分类号：C12N15/82(20060101)

分类号：C12N15/82(20060101);C12N15/29(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/74(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.16#授权;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明公开了一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，涉及蔷薇属植物形状改良的基因工程领域，包括确定接种时期、配制侵染液、病毒载体的接种、接种后处理、基因沉默效率检验五个步骤，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至OD600为1.5‑2.0，保证了在自然条件下接种区域内携带病毒载体的农杆菌具有足够的存活基数，提高了整个实验的侵染效率；在侵染液配制中加入低浓度Silwet‑77组分，既增加了植物材料表面的亲水性，提高了侵染液的侵染效率，同时低浓度的组分不会对植物材料产生毒害作用，且其污染率低，有利于环保；本方法既节省了成本又提高了基因沉默效率，处理样本的的基因沉默效率达到87.5%以上。

主权项：1.一种大田多年生‘紫枝’玫瑰、‘紫龙卧池’玫瑰和山刺玫植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：1）确定接种时期：3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨；2）配制侵染液：侵染液现用现配，配制过程如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan50ugml、利福平100ugml，28℃条件下，200rmin震荡10-12h至浑浊而不泛白；其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan50ugml、利福平100ugml、MES10mM、AS200uM，28℃条件下震荡，在菌液浓度达到OD600为1.5-2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以12MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES10mM、AS100uM、MgC1210mM，调节菌液浓度OD600到1.5-2.0，形成农杆菌侵染缓冲液；最后，将含有等浓度pTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的液体中加入终浓度为0.01%的Silwet-77，黑暗条件下室温静置4h，形成两种农杆菌侵染液；3）病毒载体的接种：采取锋利尖锐的器具将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，小叶在背面划伤，可划透整个叶面，但不要使其残缺，叶柄及小枝划伤力度加大，伤口加深，但不能使其断裂，划伤的伤口为斜网格状交替排列，之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml或10ml离心管中进行侵染，单次侵染10-15min，若天气较干燥或有风天气时侵染后的叶片表面水分蒸发较快，可再次侵染2-5min，侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间；4）接种后处理：每接种完一组上述小叶、叶柄及小枝，采用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定，黑色塑料袋24h之后即可去除，使接种区域接触正常的自然条件，如遇恶劣天气，适当延迟摘袋时间；5）基因沉默效率检验：组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组和未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。

全文数据：大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法技术领域[0001]本发明涉及蔷薇属植物形状改良的基因工程领域，具体地说是一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法。背景技术[0002]病毒诱导基因沉默virus-inducedgenesilencing,VIGS是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默post-transcriptionalgenesilencing，PTGS。当携带含有内源基因片段的病毒载体侵染寄主植物后，能够激活植物自身的免疫系统:在识别并降解病毒RNA的同时也会产生含内源目的基因的microRNA，这些microRNA与IE基因的mRNA结合，之后被Dicer酶降解，从而使目的基因表达水平下降或功能丧失。正是利用这一点，可以元成对未知基因相关功能的验证。其中由人工改良后的烟草脆裂病毒tobaccorattlevirus，TRV诱导的基因沉默，以其沉默效率高、持续时间长30-40天左右），寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。即便如此，TRV病毒诱导的基因沉默还是被最多的应用到茄科和十字花科等一系列草本植物的研究中去。当前，还未曾有以大田条件下多年生的蔷薇属植株为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系研宄的报道。[0003]蔷薇属的某些植物如玫瑰有着巨大的科研价值，而目前已有的病毒诱导基因沉^的技术操作在上述条件下的蔷薇属植物上并不适用，因此以其为对象建立一种优化的、高效的病毒诱导基因沉默体系尤为重要。而在病毒选择TRV和嵌入病毒的靶基因片段都是最优的条件下，在构建好带有靶基因的重组病毒载体后，介导转化农杆菌的活性、侵染液的配制、病毒载体的接种技术、接种时期、接种后培养植物材料的光温条件等因素才是影响病毒诱导基因沉默体系能否成功建立的关键。发明内容[0004]为解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种以大田条件下多年生的蔷薇属植株为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系的方法，简单高效，成本低廉，易于在室外运行。[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，通过如下步骤实现：1确定接种时期:3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨；2配制侵染液:侵染液现用现配，配制过程如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan5〇ugml、利福平100ugml，28°C条件下，200rmin震荡10-12h至浑独而不泛白；其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan50ugml、利福平100ugml、MES10mM、AS200uM，28°C条件下震荡，在菌液浓度达到ODsqq为1.5-2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以12MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES10raM、AS100uM、MgC1210mM，调节菌液浓度0D6。。到1.5-2.0,形成农杆菌侵染缓冲液；最后，将含有等浓度PTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的液体中加入终浓度为0.01%的Silwet-77,黑暗条件下室温静置4h，形成两种农杆菌侵染液；3病毒载体的接种:采取锋利尖锐的器具将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml或10ml离心管中进行侵染，单次侵染10-15min，若天气较干燥或有风天气时侵染后的叶片表面水分蒸发较快，可再次侵染2-5min，侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间；4接种后处理:每接种完一组上述小叶、叶柄及小枝，采用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定，黑色塑料袋24h之后即可去除，使接种区域接触正常的自然条件，如遇恶劣天气，适当延迟摘袋时间；5基因沉默效率检验:组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组合未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。[0006]步骤3中采用的器具设置为注射器针头、细针或刀片。[0007]步骤3中小叶在背面划伤，划透整个叶面，但不要使其残缺，叶柄及小枝划伤力度加大，伤口加深，但不能使其断裂。[0008]步骤3中划伤的伤口为斜网格状交替排列。[0009]步骤5中所有组别样本的表型观测具体操作为：自接种第一日起，在根据沉默目的基因的功能所预测的性状改变发生的日期前后，对基因沉默处理的区域的相关性状进行不同组别之间的观测对比，并统计好相应的数量。[0010]本发明针对大田条件下多年生蔷薇属植株建立病毒诱导基因沉默体系，基于在大田^件下自然环境的影响加之多年生植物材料本身具备的抗侵染能力，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至〇D6qQ为1•5-2•0，保证了在自然条件下接种区域内携带病毒载体的农杆菌具有足够的存活基数，提高了整个实验的侵染效率;在侵染液配制中加入低浓度Silwet-77组分，既增加了植物材料表面的亲水性，提高了侵染液的侵染效率，同时低浓度的组分不会对植物材料产生毒害作用，且其污染率低，有利于环保;将处理部位密集划伤，浸润侵染时间延长，既能增大伤口与侵染液接触的面积，提高侵染效率，同时因处理部位生长旺盛，在不使其断裂残缺的情况下，其正常生长不受太大影响;接种后的套袋暗处理，既能保温保湿，又能在一定程度上抵挡恶劣天气;本方法既节省了成本又提高了接种成功率，从而提高了基因沉默效率，处理样本的的基因沉默效率达到87.5%以上，极大地促进了基因工程领域在蔷薇属植物中的研究，也促进了以研究对象为实验验证材料的转变，大大缩减了基因功能验证的时间。具体实施方式[0011]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，通过如下步骤实现：1确定接种时期：3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨。[0012]2配制侵染液:侵染液现用现配，配制过程如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan5〇ugml、利福平100ugml，28°C条件下，200rmin震荡10-12h至浑独而不泛白；其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan50ugml、利福平100ugml、MES10mM、AS200uM，28。：条件下震荡，在菌液浓度达到0D6。。为1.5-2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以12MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES10mM、AS100uM、MgC1210mM，调节菌液浓度0D6。。到1.5-2.0,形成农杆菌侵染缓冲液；最后，将含有等浓度PTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的液体中加入终浓度为0.01%的Silwet-77,黑暗条件下室温静置4h，形成两种农杆菌侵染液。[0013]3病毒载体的接种:采取锋利尖锐的器具将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml或10ml离心管中进行侵染，单次侵染l〇-15min，若天气较干燥或有风天气时侵染后的叶片表面水分蒸发较快，可再次侵染2-5min，侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间；采用的器具优选注射器针头或者细针，划伤方式优选在每片小叶的背面进行划伤，可酌情增加伤口数量，划透整个叶面，尽量不要使其残缺，叶柄以及叶片基部的小枝等处划伤力度可适当增加，伤口加深，但是不能使其发生断裂，划伤的伤口优选为斜网格状交替排列。[0014]4接种后处理:根据设定的接种流程，下午3点以后开始接种，接种完毕一般为傍晚时分，气温逐渐下降。每接种完一组上述小叶、叶柄及小枝，采用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定。该方法既能达到接种后进行暗处理的要求，又能在夜间为接种区域保温保湿，以保证携带病毒的农杆菌在侵染24h之内能够尽可能多的侵染渗透，如遇降雨天气，还可以在一定程度上遮挡雨水。黑色塑料袋24h之后即可去除，使接种区域接触正常的自然条件，如遇恶劣天气，适当延迟摘袋时间；5基因沉默效率检验:组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组合未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，优选方式为自接种第一日起，在根据沉默目的基因的功能所预测的性状改变发生的日期前后，对基因沉默处理的区域的相关性状进行不同组别之间的观测对比，并统计好相应的数量。其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。[0015]实施例1:以大田条件下多年生‘紫枝’玫瑰为对象建立病毒诱导花色相关基因沉默的方法：1确定接种时期:根据紫枝’玫瑰的往年花期和现阶段抽枝发芽的生长情况以及最近一个周的天气预测，确定的接种日期为2018年3月18日至20日，共三天。具体时间为:接种曰期的下午3点半至5点半。[0016]2侵染液的配制:根据现用现配的使用原则，配制时间皆为接种日的当天上午。首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基（含kan50ugml，利福平l〇〇ugml中，28°C;200rmin震荡过10h至浑独而不泛白；其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基（kan50ugml;利福平100ugml;MES10mM;AS2〇OuM培养，28C震荡，在菌液浓度达到〇D6QQ=1.8时取出，然后离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液MES10mM;AS100uM;MgCl210mM;无菌水作为溶剂悬浮菌体，调节ODeoo到1.5-2.0之间；最后，将含有等浓度PTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合其中不带有任何目的基因片段的空载体混合侵染液作为对照组侵染液），分别在两种混合好的侵染缓冲液中加入终浓度为〇.〇1%的Silwet-77,黑暗条件下室温24°C静置4h。[0017]3病毒载体的接种:用注射器针头将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，具体操作为:在每片小叶的背面进行划伤，伤口为斜网格状交替排列，可酌情增加伤口数量，划透整个叶面，但尽量不要使其残缺。而在小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝等处可适当增加力度，加深伤口，但不能使其发生断裂。之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据其体积大小完全浸没在盛有侵染液的l〇ml离心管中进行侵染，单次侵染l〇min。侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间。[0018]4接种后处理:根据设定的接种流程，接种完毕时间为下午5点半左右，气温逐渐下降。每接种完一组便用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定。套袋24h之后即次日相同时间将套袋去除，使接种区域接触正常的自然条件。[0019]5基因沉默效率检验:此次所有组别样本处理总数为40,其中病毒空载体处理总数为20,病毒与目的基因复合载体处理总数为20。自接种第一日起，35天之后，经基因沉默处理的区域陆续开花。根据所沉默基因的功能，我们预测性状改变为花色变浅。经统计，与空白对照组相比，病毒空载体处理的样本中无有明显花色变浅表型的花朵；与空白对照组和病毒空载体组相比，在病毒与目的基因复合载体处理的样本中，共有17朵花产生了花色变浅的表型。对所有组别处理过花瓣提取RNA，合成第一链cDNA，经PCR和琼脂糖凝胶电泳检测后统计，空白对照组检测不到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常;病毒空载体处理的样本中共有19朵花能够检测到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常，而在病毒与目的基因复合载体处理的样本中共有18朵花既能检测到TRV病毒的存在，同时可以检测到被沉默的目的基因其内源转录本丰度有着明显下降，而其中包括有花色变浅表型出现的17朵花。因此，此次病毒诱导基因沉默的综合沉默效率到达92.5%。[0020]实施例2:以大田条件下多年生‘紫龙卧池’玫瑰为对象建立病毒诱导花色相关基因沉默的方法：1确定接种时期:根据‘紫龙卧池’玫瑰的往年花期和现阶段抽枝发芽的生长情况以及最近一个周的天气预测，确定的接种日期为2018年4月5日至7日，共三天。具体时间为:接种日期的下午3点半至5点半。[0021]2侵染液的配制：根据现用现配的使用原则，配制时间皆为接种日的当天上午。首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基（含kan50ugml，利福平100ugml中，28°C，200rmin震荡12h至浑独而不泛白；其次，分别再用5〇mlLB或YEB液体培养基（kan50ugml;利福平100ugml;MES10mM;AS2〇OuM培养，28°C震荡，在菌液浓度达到㈤6。。=2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液MES10mM;AS100uM;MgCl210mM;无菌水作为溶剂悬浮菌体，调节0D6QQ到1•5-2•0之间；最后，将含有等浓度pTRVl的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2_目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合其中不带有任何目的基因片段的空载体混合侵染液作为对照组侵染液），分别在两种混合好的侵染液中加入终浓度为0.01%的Silwet-77,黑暗条件下室温23°C静置4h〇[0022]3病毒载体的接种：用细针将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，具体操作为:在每片小叶的背面进行划伤，伤口为斜网格状交替排列，可酌情增加伤口数量，划透整个叶面，但尽量不要使其残缺。而在小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝等处可适当增加力度，加深伤口，但不能使其发生断裂。之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据其体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml离心管中进行侵染，单次侵染12min。侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间。[0023]4接种后处理:根据设定的接种流程，接种完毕时间为下午5点半左右，气温逐渐下降。我们采取的措施为每接种完一组便用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定。套袋24h之后即次日相同时间将套袋去除，使接种区域接触正常的自然条件。[0024]5基因沉默效率检验:此次所有组别样本处理总数为40,其中病毒空载体处理总数为20，病毒与目的基因复合载体处理总数为20。自接种第一日起，33天之后，经基因沉默处理的区域陆续开花。根据所沉默基因的功能，预测性状改变为花色变浅。经统计，与空白对照组相比，病毒空载体处理的样本中无有明显花色变浅表型的花朵;与空白对照组和病毒空载体组相比，在病毒与目的基因复合载体处理的样本中，共有15朵花产生了花色变浅的表型。对所有组别处理过花瓣提取RNA，合成第一链cDNA，经PCR和琼脂糖凝胶电泳检测后统计，空白对照组检测不到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常;病毒空载体处理的样本中共有18朵花能够检测到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常，而在病毒与目的基因复合载体处理的样本中共有17朵花既能检测到TRV病毒的存在，同时可以检测到被沉默的目的基因其内源转录本丰度有着明显下降，而其中包括有花色变浅表型出现的15朵花。因此，此次病毒诱导基因沉默的综合沉默效率到达87.5%。[0025]实施例3:以大田条件下多年生山刺玫为对象建立病毒诱导花色相关基因沉默的方法：1确定接种时期:根据山刺玫的往年花期和现阶段抽枝发芽的生长情况以及最近一个周的天气预测，确定的接种日期为2018年3月25日至27日，共三天。具体时间为:接种曰期的下午3点半至5点半。[0026]2侵染液的配制:根据现用现配的使用原则，配制时间皆为接种日的当天上午。首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基含kan50ugml，利福平100ugml中，28°C，200rmin震荡llh至浑独而不泛白；其次，分别再用5〇mlLB或YEB液体培养基kan50ugml;利福平100ugml;MES10mM;AS200uM培养，28°C震荡，在菌液浓度达到㈤60=1•5时取出；然后离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液MES10mM;AS100uM;MgChlOmM;无菌水作为溶剂悬浮菌体，调节㈤6〇q到1•5_2•0之间；最后，将含有等浓度pTRVl的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合其中不带有任何目的基因片段的空载体混合侵染液作为对照组侵染液），分别在两种混合好的侵染液中加入终浓度为0.01%的Silwet-77,黑暗条件下室温28°C静置4h〇[0027]3病毒载体的接种:用刀片将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，具体操作为:在每片小叶的背面进行划伤，伤口为斜网格状交替排列，可酌情增加伤口数量，划透整个叶面，但尽量不要使其残缺。而在小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝等处可适当增加力度，加深伤口，但不能使其发生断裂。之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据其体积大小完全浸没在盛有侵染液的l〇ml离心管中进行侵染，单次侵染15min。因天气干燥，重复侵染一次5min。侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间。[0028]4接种后培养植物材料的光温条件:根据设定的接种流程，接种完毕时间为下午5点半左右，气温逐渐下降。我们采取的措施为每接种完一组便用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定。套袋24h之后即次日相同时间将套袋去除，使接种区域接触正常的自然条件。[0029]5基因沉默效率检验:此次所有组别样本处理总数为40,其中病毒空载体处理总数为20，病毒与目的基因复合载体处理总数为20。自接种第一日起，30天之后，经基因沉默处理的区域陆续开花。根据所沉默基因的功能，我们预测性状改变为花色变浅。经统计，与空白对照组相比，病毒空载体处理的样本中无有明显花色变浅表型的花朵;与空白对照组和病毒空载体组相比，在病毒与目的基因复合载体处理的样本中，共有18朵花产生了花色变浅的表型。对所有组别处理过花瓣提取RNA，合成第一链cDNA，经PCR和琼脂糖凝胶电泳检测后统计，空白对照组检测不到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常;病毒空载体处理的样本中共有19朵花能够检测到TRV病毒的存在且目的基因表达量正常，而在病毒与目的基因复合载体处理的样本中共有19朵花既能检测到TRV病毒的存在，同时可以检测到被沉默的目的基因其内源转录本丰度有着明显下降，而其中包括有花色变浅表型出现的18朵花。因此，此次病毒诱导基因沉默的综合沉默效率可到达95%。[0030]当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

权利要求：1.一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：1确定接种时期：3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨；2配制侵染液:侵染液现用现配，配制过程如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan5〇ugml、利福平100ugml，28°C条件下，200rmin震荡10-12h至浑独而不泛白；其次，分别再用5〇mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan50ugml、利福平100ugml、MES10mM、AS200uM，28。：条件下震荡，在菌液浓度达到》_为1.5-2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以12MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES10mM、AS100uM、MgC1210mM，调节菌液浓度0D6。。到1.5-2.0,形成农杆菌侵染缓冲液；最后，将含有等浓度pTRVl的农杆菌侵染缓冲液分别与含有PTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的液体中加入终浓度为0.01%的Silwet_77,黑暗条件下室温静置4h，形成两种农杆菌侵染液；3病毒载体的接种:采取锋利尖锐的器具将擦拭干净的当年生的整簇的小叶、小叶着生的叶柄以及叶片基部的小枝进行密集划伤，之后将整簇的小叶及其他有划伤的部位根据体积大小完全浸没在盛有侵染液的5ml或10ml离心管中进行侵染，单次侵染l〇-15min，若天气较干燥或有风天气时侵染后的叶片表面水分蒸发较快，可再次侵染2-5min，侵染完毕后挂牌注明处理组别及处理时间；4接种后处理:每接种完一组上述小叶、叶柄及小枝，采用大号黑色塑料袋将接种区域连同其所在的整个枝条完全套住并将袋口封紧固定，黑色塑料袋24h之后即可去除，使接种区域接触正常的自然条件，如遇恶劣天气，适当延迟摘袋时间；5基因沉默效率检验:组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组合未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。2.根据权利要求1所述的大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，步骤3中采用的器具设置为注射器针头、细针或刀片。3.根据权利要求1所述的大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，步骤3中小叶在背面划伤，可划透整个叶面，但不要使其残缺，叶柄及小枝划伤力度加大，伤口加深，但不能使其断裂。4.根据权利要求1或3所述的大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，步骤3中划伤的伤口为斜网格状交替排列。5.根据权利要求1所述的大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，其特征在于，步骤5中所有组别样本的表型观测具体操作为：自接种第一日起，在根据沉默目的基因的功能所预测的性状改变发生的日期前后，对基因沉默处理的区域的相关性状进行不同组别之间的观测对比，并统计好相应的数量。

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