申请/专利权人：武汉市农业科学院

申请日：2018-06-25

公开（公告）日：2021-11-19

公开（公告）号：CN108707692B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.19#授权;2018.11.20#实质审查的生效;2018.10.26#公开

摘要：本发明公开了一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物，采用特定的SSR引物来检测西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种纯度，即EXGF:5’‑CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC‑3’和反向引物序列为EXGR:5’‑AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT‑3’。本发明鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法在5‑6天之内即可完成种子纯度鉴定工作，且具有准确、稳定、简单快速、低成本、便于推广等特点，能够替代传统西瓜新品种杂交种鉴定方法；且本发明纯度鉴定方法可在‘鄂西瓜16号’的制种、繁种、经销企业推广应用。

主权项：1.一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的引物，其特征在于，包括以下引物序列：正向引物序列为EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’；反向引物序列为EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3’。

全文数据：一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物技术领域[0001]本发明属于农业的瓜菜育种与应用技术领域，涉及西瓜杂交种纯度鉴定方法及引物，具体涉及一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法及引物。背景技术[0002]西瓜（CitrulluslanatusThunb.Matsum.Nakai是一种重要的经济作物。我国每年西瓜种植面积和产量均居世界第一位。因此，西瓜品种种子纯度对种植者来说是必需保证的。‘鄂西瓜16号’是由武汉市农业科学院作物所原武汉市农业科学研宄所培育的高产优质杂交西瓜品种，具有优秀的田间农艺性状。该品种在杂交制种的过程中，母本和父本分别种植在不同的区域，雌花开花前，母本需要人工去雄，开花期再授以父本花粉来完成杂交过程，从而产生杂交种。如果母本去雄不彻底或漏去雄，花粉就可能落到雌花柱头上产生自交种，都将会极大地影响制种纯度。因此，西瓜杂交种必需进行种子纯度鉴定。[0003]传统的西瓜杂交种纯度鉴定方法是将杂交种种植后，通过对成株进行形态学的比较来鉴定，‘鄂西瓜16号’的全生育期需要98-102天左右，该方法鉴定一般需要1至2个月，其周期长、工作量大、难度大且易受环境、季节因素影响导致结果准确性差，所以需要对其品种特性极其了解的专业育种者，因此田间表型鉴定越来越不适宜现代农业的发展需要。为了解决传统鉴定困难的问题，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为育种科研单位和企业共同关注的课题。[0004]伴随着现代农业技术的不断发展，特别是分子标记的快速发展，将分子标记应用到其中将加速杂交种纯度的鉴定过程，而且鉴定过程不受环境和人为因素影响，甚至不需要特定的育种工作者。分子标记对种子纯度的鉴定主要是依据父母本及杂交一代中的遗传fg息存在多样性，因此鉴定过程包括分子标记所需引物的开发，DNA的提取，筛选等等。高质量西瓜基因组测序的完成，为采用分子标记进行种子纯度鉴定提供了可能。发明内容[0005]本发明所要解决的技术问题是针对目前西瓜品种杂交种子纯度鉴定的传统方法存在周期长、花费高、不够准确等缺陷，提供一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号，杂交种子纯度的方法及引物，能够对西瓜新品种‘鄂西瓜ie号’杂交种纯度进行准确、稳定、简单快速、低成本检测。[0006]本发明提供了一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其基于SSR分子标记技术，利用‘鄂西瓜16号’与双亲在一些SSR位点上的差异，筛选合适的引物，用于西瓜杂交种室内纯度检测，为‘鄂西瓜16号’纯度鉴定提供一个准确、稳定、快捷、实用的检测方法，同时将对规范西瓜新品种种子产业，保护育种者的合法权益及种植户的切身利益等都有重要的意义。[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：、[0008]本发明的第一个方面是提供一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的引物，其特征在于，包括以下引物序列：[0009]正向引物序列为EXGF:5’-CAITTCCGTTTCCAniTCTTCAC-3,；[0010]反向引物序列为EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3,。[0011]本发明的第二个方面是提供一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，包括以下步骤：[0012]1西瓜基因组SSR引物的开发:设计出跨越SSR位点的PCR引物，其正向引物序列为EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’和反向引物序列为EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3’；[0013]⑵西瓜品种基因组DNA的提取:提取西瓜新品种‘鄂西瓜16号’样品的幼嫩叶片基因组DNA，并对提取的DNA样品进行质量检测；[0014]⑶PCR扩增反应体系及程序:在PCR管内加入SSR引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液含Mg2+、‘鄂西瓜16号’样品基因组DNA和灭菌双蒸水，利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物，混匀后置于PCR仪上进行扩增；[0015]⑷PCR扩增产物的毛细管电泳荧光检测分析:将步骤⑶中6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R0X荧光标记的PCR产物稀释10倍;分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1此加入到DNA分析仪专用深孔板中；板中各孔分别加入0•lyLLIZ500分子量内标和8•9yL去尚子甲酰胺;将样品在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却lOmin以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上;使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个样品的等位变异大小数据;将EXGFEXGR引物的亲本和杂交F1毛细管电泳数据制成指纹图谱；[0016]5待测样品种子纯度鉴定:利用EXGFEXGR引物，将待测样品种子按步骤4制备出指纹图谱后，以父母本样品DNA的特异峰作为对照，只有同时具有亲本特异峰的单株才可确定为‘那西瓜16号’杂交种，否则为杂种;种子纯度按以下公式计算：[0017]受检样品种子纯度=检测所得真植株数检测植株总数）X100%。[0018]进一步地，步骤⑵中采用改良的CTAB法提取西瓜新品种的幼嫩叶片基因组DNA。[0019]进一步优选地，步骤（2中提取西瓜新品种的幼嫩叶片基因组DNA过程中还包括DIECA晶体和活性炭的引入。[0020]更进一步地，步骤2中所述提取西瓜新品种的幼嫩叶片基因组DNA的方法如下：选取西瓜杂交品种‘鄂西瓜16号’样品种子发芽3-4天后的幼嫩组织30mg-40mg，置于2.0ml预冷过的离心管中，迅速在组织上撒上约〇.5mg的DIECA晶体，加入液氮，用组织捣碎仪打碎样品成粉末状，加入700此2%CTAB预热缓冲液及0•5mg的活性炭，65°C水浴lh，加入7〇OuL24:1氯仿-异戊醇，混匀，12，OOOrpm离心lOmin;吸取上清液加入预先装有7〇OyL异丙醇的1.5mL的离心管中，混匀后放_2〇°C冰箱3〇min，12，OOOrpm离心lOmin;弃上清液，用7〇%乙醇溶液洗涤两遍，自然条件下干燥后，加入l〇〇yLddH20，待充分溶解后检测浓度，-20°C保存留用。[0021]进一步地，步骤3中，PCR扩增反应体系为:在PCR管中加入dNTP0.25mmolL，正、反向引物各0.2wn〇lL，TaqDNA聚合酶1.0U，10XPCR缓冲液含Mg2+，‘鄂西瓜16号’样品基因组DNA60ng、灭菌双蒸水补充到15uL。[0022]进一步地，PCR扩增反应程序：94°c预变性5min;94°C变性30s，55°C退火3〇s，72°C延伸40s，共34个循环;最后72。：延伸lOmindt：保存待用。[0023]本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：[0024]1提供特定的SSR引物来检测西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种纯度，即EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’和反向引物序列为EXGR:5,-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3,；[0025]2快速高效:本发明只需把‘鄂西瓜16号’种子发芽3-4天后，检测过程仅需要1-2天，且不受环境的限制，即可完成种子纯度的鉴定工作；[0026]3准确性高:该发明是以SSR技术为基础，且基因组DNA不受环境的影响，避免了田间表型鉴定因为环境影响带来的误差;其检测的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致；[0027]4操作简单:本方法所需的设备和试剂都是常规实验室拥有的，其程序化操作简便易行，不需特殊理论基础；[0028]5成本低廉:该方法避免了种植西瓜新品种所需的各种设备及管理，节省了大量的人工、土地和物力；[0029]综上，本发明相比于传统田间鉴定需要102天左右），该方法全过程需5-6天，且具有准确、稳定、简单快速、低成本等优点，能够替代传统西瓜品种杂交种鉴定方法;本发明可在‘鄂西瓜16号’的制种、繁种、经销企业推广应用。附图说明[0030]图1为利用上游引物:EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’和下游引物:EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGA1TCGCCAT-3’获得的标准图谱;A父本；早：母本;1-5:杂交F1代；[0031]图2为待测样品种子制备出指纹图谱。具体实施方式[0032]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。[0033]材料说明：西瓜品种‘鄂西瓜16号’是以“01P005”作母本，“01P011”作父本杂交选育而成的中熟西瓜品种。果实发育期30_32〇1，全生育期98-1021，平均单瓜质量3.0-3.51^，产量3〇•0-37•沉•hnf2;果实高圆形，果皮绿色，覆墨绿色锯齿状条带;果肉鲜红色，中心糖含量11.13%，边糖含量8.36%。肉质细嫩爽口，汁多味甜，风味佳。果皮薄而初，不易裂果，抗病、抗逆性较强，较耐贮运。[0034]实施例1用于西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度鉴定开发的SSR引物，包括步骤：[0035]首先，根据公布的西瓜全基因组序列WWW.icugi.org进行SSR序列的下载；[0036]然后，使用DNAstar软件设计出跨越SSR位点的PCR引物1〇〇对，由Invitrogen公司合成。[0037]实施例2西瓜品种‘鄂西瓜16号’基因组DNA的提取，包括如下步骤：[0038]选取西瓜杂交品种‘鄂西瓜16号’样品种子发芽3-4天后的幼嫩组织3〇mg-4〇mg，置于2•Oml预冷过的离心管中，迅速在组织上撒上约〇.5mg的DIECA晶体，加入液氮，用组织捣碎仪打碎样品成粉末状，加入700uL2%CTAB预热缓冲液及0.5mg的活性炭，65°C水浴lh，加入700此24:1氯仿-异戊醇，混匀，，〇〇〇rpm离心lOmin;吸取上清液加入预先装有700此异丙醇的1•5mL的离心管中，混匀后放—20冰箱30min，12，OOOrpm离心1Omin;弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤两遍，自然条件下干燥后，加入100此ddH20，待充分溶解后检测浓度，_2TC保存留用。[0039]实施例3利用上游引物：EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’和下游引物：EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3’制备西瓜品种‘鄂西瓜16号’种子纯度标准图谱：[0040]lDNA的提取:取5粒‘鄂西瓜16号’Fl、l粒父本、1粒母本，参照实例2的改良CTAB法分别提取基因组DNA;[0041]2PCR反应体系及扩增程序:在PCR管中加入dNTP0.25mmolL，正、反向引物各0.2wnolL，TaqDNA聚合酶l.〇U，l〇XPCR缓冲液（含Mg2+，‘郡西瓜16号’样品基因组DNA60ng、灭菌双蒸水补充到15uL，利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物；同时设置空白对照实验，空白对照实验以无菌水代替基因组DNA;混匀后置于PCR仪上进行扩增，PCR反应程序:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，共34个循环；最后72°C延伸10min;4°C保存待用；[0042]⑶PCR扩增产物的毛细管电泳荧光检测分析:将扩增的6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和R0X荧光标记的PCR产物稀释10倍;分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取liiL加入到DNA分析仪专用深孔板中。板中各孔分别加入0•lyLLIZ500分子量内标和8•9yL去尚子甲酰胺;将样品在PCR仪上95°C变性5min,取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上;瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上;使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个样品的等位变异大小数据;将EXGFEXGR引物的亲本和杂交H毛细管电泳数据制成指纹图谱图1，该图即为‘鄂西瓜16号’标准图谱。[0043]实施例4待测样品种子纯度鉴定：[0044]待测样品种子纯度鉴定利用EXGFEXGR引物，将待测样品种子按上述实例3制备出指纹图谱后，以父母本样品DNA的特异峰作为对照，只有同时具有亲本特异峰的单株才可确定为‘鄂西瓜16号’杂交种，否则为杂种。如图2所示，其中10号样品与标准图谱不同，故为杂种，其余的为‘鄂西瓜16号’杂交种。[0045]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

权利要求：1.一种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的引物，其特征在于，包括以下引物序列：正向引物序列为EXGF:5’-CAnTCCGnTCCATTITCTTCAC-3’；反向引物序列为EXGR:5’-MGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3’。2.—种快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：1西瓜基因组SSR引物的开发：设计出跨越SSR位点的PCR引物，其正向引物序列为EXGF:5’-CATTTCCGTTTCCATTTTCTTCAC-3’和反向引物序列为EXGR:5’-AAGTAACATCAAGCGATTCGCCAT-3’；2西瓜品种基因组DNA的提取:提取西瓜新品种‘鄂西瓜16号’样品的幼嫩叶片基因组DNA，并对提取的DNA样品进行质量检测；3PCR扩增反应体系及程序:在PCR管内加入SSR引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液含Mg2+、‘鄂西瓜16号’样品基因组DNA和灭菌双蒸水，利用DNA分析仪检测时使用荧光标记的引物，混匀后置于PCR仪上进行扩增；⑷PCR扩增产物的毛细管电泳荧光检测分析:将步骤⑶中6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍;分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取luL加入到DNA分析仪专用深孔板中；板中各孔分别加入0•luLLIZ500分子量内标和8.9uL去离子甲酰胺;将样品在PCR仪上95°C变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却lOmin以上;瞬时离心l〇s后置放到DNA分析仪上;使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个样品的等位变异大小数据;将EXGFEXGR引物的亲本和杂交H毛细管电泳数据制成指纹图谱；⑸待测样品种子纯度鉴定:利用EXGFEXGR引物，将待测样品种子按步骤⑷制备出指纹图谱后，以父母本样品DNA的特异峰作为对照，只有同时具有亲本特异峰的单株才可确定为‘鄂西瓜16号’杂交种，否则为杂种;种子纯度按以下公式计算：受检样品种子纯度=检测所得真植株数检测植株总数）X100%。3.根据权利要求2所述的快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其特征在于，步骤⑵中采用改良的CTAB法提取西瓜新品种的幼嫩叶片基因组DNA。4.根据权利要求3所述的快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其特征在于，步骤2中所述提取西瓜新品种的幼嫩叶片基因组DNA的方法如下:选取西瓜杂交品种‘鄂西瓜16号’样品种子发芽3-4天后的幼嫩组织30mg-40mg，置于2.Oml预冷过的离心管中，迅速在组织上撒上约〇.5mg的DIECA晶体，加入液氮，用组织捣碎仪打碎样品成粉末状，加入70〇yL2%CTAB预热缓冲液及0•5mg的活性炭，65°C水浴lh，加入700yL24:1氯仿-异戊醇，混匀，12，OOOrpm离心lOmin;吸取上清液加入预先装有7〇0此异丙醇的1_5mL的离心管中，混匀后放-20°C冰箱3〇min，12，OOOrpm离心lOmin;弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤两遍，自然条件下干燥后，加入l〇〇yLddH2〇,待充分溶解后检测浓度，-2TC保存留用。5.根据权利要求2所述的快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其特征在于，步骤⑶中，PCR扩增反应体系为:在PCR管中加入dNTP0.25mraolL，正、反向引物各〇.2_〇11^39〇财聚合酶1_〇11，10\?〇?缓冲液〇^^2+，‘鄂西瓜16号’样品基因组〇隱6〇ng、灭菌双蒸水补充到15UL。6.根据权利要求2所述的快速鉴定西瓜品种‘鄂西瓜16号’杂交种子纯度的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序:94。：预变性5min;94。：变性30s，55。：退火3〇s，72C延伸4〇S，共M个循环;最后72°C延伸l〇min;4°C保存待用。

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