申请/专利权人：苏州吉玛基因股份有限公司

申请日：2018-11-14

公开（公告）日：2021-11-19

公开（公告）号：CN109224076B

主分类号：A61K45/00(20060101)

分类号：A61K45/00(20060101);C12N15/113(20100101);C12Q1/6886(20180101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.19#授权;2019.02.19#实质审查的生效;2019.01.18#公开

摘要：本发明公开了与肺癌诊疗相关的基因miR‑140‑3P及其mimics和应用。本发明提供了提高或增强miR‑140‑3P基因表达的物质或miR‑140‑3P模拟物在如下1‑3中任一种中的应用：1制备治疗肿瘤的产品；2制备抑制肿瘤细胞增殖的产品；3制备抑制肿瘤生长的产品。本发明发现人miR‑140‑3P基因在非小细胞肺癌早期诊断和治疗药物制备中的用途，并进一步构建了人miR‑140‑3P基因模拟物mimics，通过实验证明：该模拟物能够高效抑制肺癌细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义，为临床治疗非小细胞癌奠定基础。

主权项：1.增强miR-140-3P基因表达的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用；所述肿瘤为肺鳞癌。

全文数据：与肺癌诊疗相关的基因miR-140-3P及其mimics和应用技术领域本发明属于生物技术和治疗领域，具体涉及与肺癌诊疗相关的基因miR-140-3P及其mimics和应用。背景技术肺癌是发生率居全球首位，且恶性程度非常高的一类肿瘤，据统计，2018年美国肺癌发生人数为24.3万，其中有15万人死于肺癌。肺癌可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占80-85％，而小细胞肺癌则占10-15％左右。而非小细胞肺癌又可以分为腺癌、鳞癌和大细胞癌。肺癌的发生通常与吸烟、油烟及环境污染等因素相关。目前肺癌早期确诊率不高，虽然有一些标志物和影像学诊断方式，但是很多肺癌患者被诊断时已经是中晚期；此外，肺癌主要以放化疗、靶向治疗EGFR，ALK等、免疫治疗PD1抗体和手术治疗为主。其中靶向治疗具有很强的耐药性，而免疫治疗应答率并不理想，很多肺癌患者并无其他有效治疗方案。miRNAs是一类长20-24nt的非编码RNA，miRNA被普遍认为参与很多基因的调控。其主要机理是通过与编码基因mRNA的3端非编码区3’UTR结合，从而使编码基因发生降解，进一步阻止蛋白的翻译。大量的研究表明，组织、血样及其他体液中miRNA可以作为多种疾病诊断的标志物，并且可以作为治疗的靶标。发明内容本发明的一个目的是提供增强miR-140-3P基因表达的物质或增加miR-140-3P含量和或活性的物质或miR-140-3P模拟物的用途。本发明提供了增强miR-140-3P基因表达的物质或增加miR-140-3P含量和或活性的物质或miR-140-3P模拟物在制备治疗肿瘤的产品中的应用；本发明还提供了增强miR-140-3P基因表达的物质或增加miR-140-3P含量和或活性的物质或miR-140-3P模拟物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。本发明还提供了增强miR-140-3P基因表达的物质或增加miR-140-3P含量和或活性的物质或miR-140-3P模拟物在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。进一步的，所述miR-140-3P模拟物为模拟miR-140-3P活性的miRNA，即与miR-140-3P具有相同活性的miRNA。更进一步的，所述模拟miR-140-3P活性的miRNA是由正义链和反义链退火形成；所述正义链的核苷酸序列为序列5，所述反义链的核苷酸序列为序列6。本发明的miR-140-3P模拟物不仅包括由上述正义链和上述反义链退火形成的miRNA，还包括经过化学修饰的且与本发明的miR-140-3P模拟物功能相同的miRNA衍生物，例如经过2’-OME、2’-F、LNA、MOE、胆固醇等化学修饰的且与本发明的miR-140-3P模拟物功能相同的miRNA衍生物也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述肿瘤可为肺癌；所述肺癌可为非小细胞肺癌。上述应用中，所述肿瘤细胞可为肺癌细胞；所述肺癌细胞可为非小细胞肺癌细胞。本发明的另一个目的是提供一种miRNA或其衍生物。本发明提供的miRNA为上述模拟miR-140-3P活性的miRNA。本发明提供的miRNA衍生物为将上述模拟miR-140-3P活性的miRNA进行修饰后得到的具有相同功能的miRNA衍生物。进一步的，所述修饰可为化学修饰。更进一步的，所述化学修饰具体可为2’-OME、2’-F、LNA、MOE、胆固醇等化学修饰。本发明还有一个目的是提供miR-140-3P基因的用途。本发明提供了miR-140-3P基因在作为非小细胞肺癌早期诊断标记物中的应用。本发明最后一个目的是提供检测miR-140-3P基因表达的物质的用途。本发明提供了检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测样本是否为非小细胞肺癌的产品中的应用。本发明还提供了检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测患者是否患有非小细胞肺癌的产品中的应用。本发明还提供了检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测细胞是否为非小细胞肺癌细胞的产品中的应用。在实际应用中，可以通过miR-140-3P基因的相对表达量检测或诊断待测样本是否为非小细胞肺癌：miR-140-3P基因的相对表达量低的待测样本为或候选为非小细胞肺癌；也可以通过miR-140-3P基因的相对表达量检测或诊断待测患者是否患有非小细胞肺癌：miR-140-3P基因的相对表达量低的待测患者为或候选为非小细胞肺癌患者；还可以通过miR-140-3P基因的相对表达量检测或诊断待测细胞是否为非小细胞肺癌细胞：miR-140-3P基因的相对表达量低的待测细胞为或候选为非小细胞肺癌细胞；所述miR-140-3P基因的相对表达量低是指miR-140-3P基因的相对表达量小于等于0.85。进一步的，所述检测miR-140-3P基因表达的物质可为miR-140-3P基因的探针或扩增miR-140-3P基因的引物对；更进一步的，所述探针的核苷酸序列可为序列4；所述引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。上述应用中，所述产品为试剂盒。上述应用中，所述miR-140-3P的核苷酸序列如序列1所示。本发明首先发现人miR-140-3P基因在非小细胞肺癌早期诊断和治疗药物制备中的用途，并进一步构建了人miR-140-3P基因模拟物mimics。通过实验证明：该模拟物能够高效抑制肺癌细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义，为临床治疗非小细胞癌奠定基础。附图说明图1为miR-140-3P在非小细胞肺癌患者癌旁组织和非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品中的相对表达量。图2为非小细胞肺癌患者癌旁组织和非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品荧光原位杂交FISH检测miR-140-3P结果。图3为miR-140-3P模拟物加入细胞后的表达情况。图4为miR-140-3P模拟物加入后非小细胞肺癌细胞增殖情况。图5为miR-140-3P模拟物在肺癌PDX模型中肿瘤体内的表达情况。图6为miR-140-3p模拟物加入后肺癌PDX模型的肿瘤大小。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述非限制性实施例可以使本领域的技术人员更好的理解本发明。任何熟悉本领域的技术人员在本发明的纰漏范围内，根据本发明的技术方案及构思进行替换或改变均属于本发明的保护范畴。下述实施例中所使用的试剂：FBSGibco、DMEM培养基Gibco、PBSPH7.4、Trypsin-EDTASolution0.05％Trypsin-EDTA，Gibco、Lipofectamin2000lipo2000转染试剂Invitrogen。下述实施例中所使用的H226细胞系购自中科院典藏细胞库。下述实施例中所使用的非小细胞肺癌异型瘤模型patientderivedxenograft，PDX来源于吉玛基因PDX库PDX-LU077编号的F4代种子，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的研究对象：非小细胞肺癌及癌旁组织52份，均采集自2014年到2018年，来自苏州大学附属第一医院，均为确诊为非小细胞肺癌的患者知情同意的志愿者，于手术后取样用于病理检测或本实验，所取组织包括癌旁及肿瘤组织和血浆样品。患者临床信息如表1所示。表1为临床特诊参数病人n＝52年龄年67.254-81性别男女502吸烟历史+-3715肿瘤分期III4178.8％肿瘤分期IIIIV1121.2％实施例1、miR-140-3P作为非小细胞肺癌诊断标志物的发现一miR-140-3P作为非小细胞肺癌诊断标志物miR-140-3P的核苷酸序列如下：UACCACAGGGUAGAACCACGG序列1。一、miR-140-3P的mRNA作为非小细胞肺癌诊断标志物qPCR1、总RNA的获得取医院石蜡病理切片或被病理诊断为非小细胞肺癌的患者样品共52例，包括癌旁组织及肿瘤组织表1，总RNA的提取方法具体如下：1取样品共1mLEzol裂解液。2加入0.2mL三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。34℃，12,000rpm离心20min。4将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀，-80℃放置1h。54℃，12,000rpm离心10min，去上清。6加入1mL的75％乙醇洗涤沉淀。74℃，5,000rpm离心3min，去上清，室温晾干。8加入40μL的RNA-free水溶解RNA。2、qPCR检测将上述步骤1得到的RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用引物homo-MIR-140-3P-F和homo-MIR-140-3P-R进行qPCR扩增，以U6作为内参基因，U6-F和U6-R作为内参引物。引物序列如下：homo-MIR-140-3P-F：CAGTGCTGTACCACAGGGTAGA序列2；homo-MIR-140-3P-R：TATCCTTGTTCACGACTCCTTCAC序列3；U6-F：CGCTTCGGCAGCACATATAC；U6-R：TTCACGAATTTGCGTGTCATC。定量PCR反应程序：95℃，30秒预变性；95℃，10秒；60℃，30秒，40循环。qPCR结果如图1所示，从图中可以看出：miR-140-3P在非小细胞肺癌患者癌旁组织和非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品中的相对表达量有显著差异，与癌旁组织相比，在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中的miR-140-3P的相对表达量明显降低；根据SPSS软件计算得出miR-140-3PmRNA在组织样品中的含量用于鉴别正常和非小细胞肺癌的AUC值为0.85，95％可信区间为0.758-0.927，P值0.0001。二、miR-140-3P作为非小细胞肺癌诊断标志物FISH取医院石蜡病理切片或被病理诊断为非小细胞肺癌的患者样品共52例，包括癌旁组织及肿瘤组织进行如下操作：1、脱蜡1石蜡切片在60℃烤箱中预热30min。2将切片浸入二甲苯I,II中各放置10min建议在染缸中进行。3在梯度酒精中100％、95％、90％、80％、70％室温孵育各10min建议在染缸中进行。4PBS洗切片两次，每次2min建议在染缸中进行。2、蛋白酶处理1蛋白酶K稀释溶液预热至37℃。2每张切片滴加蛋白酶K稀释溶液100μL，37℃孵育20min。3每张切片滴加2×BufferC溶液100μL在室温下洗切片3次，每次1min。4梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥建议在染缸中进行。3、变性178℃预热变性液。2每张切片滴加预热变性液100μL，78℃孵育8min。3梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥建议在染缸中进行。4、杂交1合成如下探针序列：5’-GUGGUUCUACCCUGUGGUAUU-3’序列4，碱基为锁核甘酸LNA修饰，该探针由吉玛基因合成，合成后溶解于40μLDEPC水，得到浓度为1μgμL的探针溶液，避光备用。2探针混合液的配制：70μLBufferE，2μL探针溶液1μgμL，28μLDEPC水，终体积为100μL；配制好的探针混合液73℃变性5min。3准备湿盒，用免疫组化笔沿组织周围划圈，水平放置切片。4滴加100μL探针混合液在切片组织上。5盖上湿盒盖，37℃孵育12～16h。5、杂交后水洗143℃预热杂交后水洗溶液。2吸弃杂交溶液，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液100μL洗切片15min。3每张切片滴加2×BufferC预热至37℃100μL洗2次，每次10min。4PBS洗切片1次，10min建议在染缸中进行。6、细胞核染色1每张切片加100μL稀释后的DAPI工作液，在室温下避光孵育20min。2吸弃DAPI工作液，PBS洗切片2次，每次2min建议在染缸中进行。3滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。结果如图2所示，从图中可以看出：miR-140-3P在非小细胞肺癌患者癌旁组织和非小细胞肺癌患者肿瘤组织样品中的表达有显著差异，与癌旁组织相比，在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中的miR-140-3P的表达明显降低。因此，miR-140-3P可以作为非小细胞肺癌诊断标志物。二设计模拟miR-140-3P表达或活性的物质根据miR-140-3P基因序列，设计模拟其基因表达的mimics如下表2所示。表2、mimics序列模拟miR-140-3P表达或活性的mimicsmiR-140-3Pmimics及Control均由其正义链和其反义链退火得到。实施例2、模拟miR-140-3P表达或活性的物质在抑制肿瘤生长中的应用一、mimics转染细胞分别将模拟miR-140-3P表达或活性的mimics及Control转染H226细胞，分别得到转miR-140-3P的H226细胞和转control的H226细胞。具体步骤如下：1、H226细胞人肺鳞癌细胞在10cmdish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3mLPBS洗涤细胞两次。2、加1mLTrypsin-EDTAsolution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1分钟。加入2mL完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液。3、血球计数板计数，按照每孔约1×105的细胞量接种于24孔板。5、24孔板中加入1μLLipo2000。6、期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，按300μL孔24孔板加入培养基；静置20min后，将含有miR-140-3Pmimics和lipo2000的转染混合物miR-140-3Pmimics在转染混合物中的终浓度为50nM；含有miR-140-3Pmimics和lipo2000的转染混合物的具体制备方法如下：混合液甲：100μLDMEM和10pmolmiR-140-3Pmimics混匀；混合液乙：99μLDMEM培养液和1μLlipo2000转染试剂混匀；将混合液甲和混合液乙等体积混匀，得到含有miR-140-3Pmimics和lipo2000的转染混合物加入到24孔板中，200μL孔，同时设立control孔，将孔板摇匀，在培养箱中温育5小时。7、移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养，control孔拍照观察转染效率。二、逆转录及qPCR检测1、上述步骤一中转染48小时以后收取细胞样品转miR-140-3P的H226细胞和转control的H226细胞，提取总RNA，采用逆转录引物进行逆转录，得到cDNA。2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行荧光定量PCR，检测各组miR-140-3P的mRNA水平。反应体系20μL由10μL2×SYBRGreenqPCRMixThermoFisherkit、上游引物溶液20μM、下游引物溶液20μM、模板、rTaqDNA聚合酶溶液5UμL和ddH2O组成。反应体系中的上游引物和下游引物的浓度均为0.10μM，rTaqDNA聚合酶的浓度为0.05UμL，模板加入量为50ng。反应条件：94℃3min；94℃12s、62℃30s、72℃30s，40个循环。引物序列如下：homo-MIR-140-3P-F：CAGTGCTGTACCACAGGGTAGA；homo-MIR-140-3P-R：TATCCTTGTTCACGACTCCTTCAC；U6-F：CGCTTCGGCAGCACATATAC；U6-R：TTCACGAATTTGCGTGTCATC。结果如图3所示，从图中可以看出：转mimics的H226细胞中的miR-140-3P相对表达量显著高于转control的H226细胞，说明mimics能够模拟miR-140-3PmRNA的过表达。三、模拟miR-140-3P表达或活性的物质在抑制肿瘤增殖中的应用1、将上述步骤一得到的转miR-140-3P的H226细胞和转control的H226细胞，传代后培养过夜，倾去培养液，用3mLPBS洗涤细胞两次。2、加1mLTrypsin-EDTAsolution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3分钟。3、加入3mL含10％FBS的培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。4、血球计数板计数，将细胞稀释至5×105细胞mL。5、按3×103细胞孔的浓度接种96孔板，同时设置调零组，即直接在孔中加入100μL完全培养基，每组设5重复，混匀后于37℃、5％CO2培养。6、培养至0小时、24小时、48小时、72小时，倾去培养液，加入新鲜的培养基100μL，每孔避光加入CCK810μL，避光培养2小时，酶标仪450nm波长测OD值。结果如图4所示，从图中可以看出，miR-140-3P能够抑制H226细胞的增殖。四、模拟miR-140-3P表达或活性的物质在抑制肺癌小鼠模型的肿瘤生长中的应用以非小细胞肺癌异型瘤模型patientderivedxenograft，PDX作为肺癌小鼠模型进行药效试验。具体步骤如下：给药时间：当瘤体大小处于50-150mm3时开始给药。给药方法：实验组miR-140-3p：将2OD的miR-140-3pmimics与lipo2000孵育，得到200微升制剂mimics制备方法同实施例2步骤一的6，miR-140-3pmimics终浓度为50nM；对照组control：将2OD的control序列与lipo2000孵育，得到200微升制剂control。给药剂量：以一周注射两次的频率，连续注射两周瘤内注射，每次注射剂量为200微升只小鼠。给药后第18天处死小鼠，称重、测量瘤体大小，并检测瘤体内的miR-140-3P的相对表达量。结果如图5和图6所示，从图中可以看出：和对照组相比，注射miR-140-3pmimics的实验组瘤体内的miR-140-3P显著过表达图5。对照组小鼠体重为17.48g±1.04g，实验组小鼠体重为17.69g±0.58g；和对照组相比，注射miR-140-3pmimics的实验组小鼠的瘤体明显变小图6。说明针对miR-140-3P的mimics能够抑制肿瘤生长。序列表110苏州吉玛基因股份有限公司120与肺癌诊疗相关的基因miR-140-3P及其mimics和应用1606170PatentInversion3.5210121121212RNA213人工序列ArtificialSequence4001uaccacaggguagaaccacgg21210221122212DNA213人工序列ArtificialSequence4002cagtgctgtaccacagggtaga22210321124212DNA213人工序列ArtificialSequence4003tatccttgttcacgactccttcac24210421121212RNA213人工序列ArtificialSequence4004gugguucuacccugugguauu21210521121212RNA213人工序列ArtificialSequence4005uaccacaggguagaaccacgg21210621121212RNA213人工序列ArtificialSequence4006gugguucuacccugugguauu21

权利要求：1.增强miR-140-3P基因表达的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用；或，增加miR-140-3P含量和或活性的物质在制备治疗肿瘤的产品中的应用；或，miR-140-3P模拟物在制备治疗肿瘤的产品中的应用。2.增强miR-140-3P基因表达的物质在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用；或，增加miR-140-3P含量和或活性的物质在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用；或，miR-140-3P模拟物在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用。3.增强miR-140-3P基因表达的物质在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用；或，增加miR-140-3P含量和或活性的物质在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用；或，miR-140-3P模拟物在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺癌；或，所述肿瘤细胞为肺癌细胞；或，所述肺癌为非小细胞肺癌；或，所述肺癌细胞为非小细胞肺癌细胞。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述miR-140-3P模拟物为模拟miR-140-3P活性的miRNA。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述模拟miR-140-3P活性的miRNA是由正义链和反义链退火形成；所述正义链的核苷酸序列为序列5，所述反义链的核苷酸序列为序列6。7.miRNA，其为权利要求5或6中所述的模拟miR-140-3P活性的miRNA；或miRNA衍生物，其为将权利要求5或6中所述的模拟miR-140-3P活性的miRNA进行修饰后得到的具有相同功能的miRNA衍生物。8.miR-140-3P基因在作为非小细胞肺癌早期诊断标记物中的应用。9.检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测样本是否为非小细胞肺癌的产品中的应用；或，检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测患者是否患有非小细胞肺癌的产品中的应用；或，检测miR-140-3P基因表达的物质在制备检测或诊断待测细胞是否为非小细胞肺癌细胞的产品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述检测miR-140-3P基因表达的物质为miR-140-3P基因的探针或扩增miR-140-3P基因的引物对；或，所述探针的核苷酸序列为序列4；或，所述引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。

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