申请/专利权人：美国卫生和人力服务部

申请日：2015-04-09

公开（公告）日：2021-11-19

公开（公告）号：CN107207616B

主分类号：C07K19/00(20060101)

分类号：C07K19/00(20060101);C12N15/62(20060101);A61K35/17(20150101);A61P35/00(20060101)

优先权：["20141208 US 62/088,882"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.19#授权;2017.12.08#实质审查的生效;2017.09.26#公开

摘要：本发明提供具有针对CD70的抗原特异性的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含：抗原结合‑跨膜结构域，其含有缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的CD27氨基酸序列；4‑1BB胞内T细胞信号转导结构域；CD3ζ胞内T细胞信号转导结构域；以及任选地，CD28胞内T细胞信号转导结构域。还公开了与CAR相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群以及药物组合物。还公开了检测哺乳动物中的癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法。

主权项：1.具有针对CD70的抗原特异性的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含：抗原结合-跨膜结构域，其是缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部的人CD27氨基酸序列，其中所述抗原结合-跨膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；CD3ζ胞内T细胞信号转导结构域；以及i4-1BB胞内T细胞信号转导结构域和iiCD28胞内T细胞信号转导结构域之一或二者。

全文数据：抗GD70嵌合抗原受体[0001]相关申请的交叉引用[0002]本专利申请要求于2014年12月8日提交的美国临时专利申请第62088,882号的权益，将其通过引用整体并入本文。[0003]通过引用并入电子提交的材料[0004]通过引用整体并入本文的是同时提交并通过如下识别的计算机可读的核苷酸氨基酸序列表:名为“719062ST25.TXT”的一个55，121个字节的ASCIIText文件，日期为2014年12月3日。[0005]发明背景[0006]癌症是公共健康问题。尽管在诸如化疗的治疗中取得进步，但许多癌症的预后可能较差，所述癌症包括肾细胞癌RCC、胶质母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤NHL、慢性淋巴细胞白血病CLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。因此，对癌症，特别是RCC、胶质母细胞瘤、NHL、CLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤的其它治疗存在未满足的需求。[0007]发明概述[0008]本发明的实施方案提供具有针对CD70的抗原特异性的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含:抗原结合-跨膜结构域，其含有缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的⑶27氨基酸序列，其中所述部分为SEQIDNO:2所限定的至少氨基酸残基237至260;4-IBB胞内T细胞信号转导结构域;CD3G胞内T细胞信号转导结构域；以及任选地，CD28胞内T细胞信号转导结构域。[0009]本发明的另一实施方案提供具有针对CD70的抗原特异性的CAR，其包含与SEQIDNO:11-13中任一项至少约90%相同的氨基酸序列。[0010]本发明的其它实施方案提供与本发明的CAR相关的相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群以及药物组合物。[0011]本发明另外的实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中癌症的方法。[0012]附图几个视图的简要描述[0013]图IA和IB是显示施用mCD27-CD3GCAR转导的细胞（实心圆）、未转导的细胞（空心圆）、磷酸盐缓冲盐水PBSX或pmel+VI正方形并进行辐射500Rad之后一段时间（天数）内，B16mCD70-㈧或B16-⑶荷瘤小鼠的肿瘤大小mm2的图。[0014]图IC和ID是显示在施用每只小鼠IxlO4l、1XlO5实心正方形）、1Xltf或IX1〇7实心圆）个细胞的剂量的mCD27-CD3GCAR转导的细胞;PBS空心正方形）；转导有空载体的细胞空心圆）；或者pmel+VI菱形），进行C或不进行⑶辐射500Rad之后一段时间（天数）内，B16mCD70荷瘤小鼠的肿瘤大小mm2的图。[0015]图IE是显示在施用每只小鼠IXIO4菱形）、lxl〇S,IxlO6或IXIO7实心圆）个细胞的剂量的mCD27-⑶3GCAR转导的细胞;PBS空心正方形）；转导有空载体的细胞（空心圆）；或者pmel+VIΛ，随后进行辐射（500Rad之后一段时间（天数）内，B16m⑶70荷瘤小鼠的存活（％的图。[0016]图IF是显示在施用mCD27-⑶3GCAR转导的细胞正方形）、未转导的细胞Λ、转导有空载体的细胞或者pmel+VI环），随后进行辐射并施用IL-2之后一段时间（天数）内，B16m⑶70荷瘤小鼠的肿瘤大小mm2的图。[0017]图2A-2D是显示在施用mCD27-CD3GCAR转导的细胞实心圆）、未转导的细胞空心正方形）、磷酸盐缓冲盐水（PBS或pmel+VI，进行（A和C或不进行（B和D辐射500Rad之后一段时间（天数）内，B16mCD70-A和B或B16-C和D荷瘤小鼠的平均体重g的图。[0018]图2E-2H是显示在施用mCD27-CD3GCAR转导的细胞交叉线柱）、未转导的细胞无阴影柱或者转导有编码绿色荧光蛋白（GFP的载体的细胞斜纹柱），进行E和G或不进行F和H辐射500Rad之后一段时间（天I»内，B16mCD70荷瘤小鼠的绝对白细胞计数ΚμIΕ和F或脾细胞计数XIO7脾）（G和Η的图。[0019]图21是显示在施用mCD27-⑶3GCAR转导的细胞，进行（黑柱或不进行横纹柱）辐射;或者施用转导有编码GFP的载体，进行方格柱或不进行无阴影柱辐射500Rad之后一段时间（天数）内，B16mCD70荷瘤小鼠的血清干扰素（IFNγpgml水平的图。[0020]图3是显示在单独培养培养基转导有空的逆转录病毒载体对照）（MSGVl或者fCD27-CD3GSEQIDN0:7、ACD27-CD28-CD3GSEQIDN0:8、ACD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:9、ACD27-CD28-4-lBB-CD3GSEQIDN0:10、fCD27-CD28-CD3GSEQIDN0:11、fCD27-4-lBB-CD3ζSEQIDN0:12或fCD27-CD28-4-lBB-CD3ζSEQIDN0:13之一的人T细胞时（竖纹柱）；或者在与对照靶细胞624mel方格柱）、624CD70黑柱）、938mel点状柱）或938CD70白柱）、或RCC靶细胞RCC2245RQH斜杠柱）、RCC2246R反斜杠柱）、RCC2361R有横纹的柱或者RCC1764人字纹柱共培养时，分泌的IFN-γpgml的图。[0021]图4是显示在单独培养培养基未转导的UT细胞或者转导有Δ⑶27-4-1BB-CD3GSEQID勵:9的逆转录病毒包装克隆4210、83、：143或62竖纹柱时；或者在与对照靶细胞SNU1079点状柱）、SNU1196白柱）、938mel方格柱）或938CD70黑柱）、或RCC靶细胞RCC2245RQH斜杠柱）、RCC2246R反斜杠柱）、RCC2361R有横纹的柱）或者RCC1764人字纹柱共培养时，分泌的IFN-γpgml的图。[0022]图5是显示在单独培养培养基未转导的UT细胞或者转导有Δ⑶27-4-1BB-CD3GSEQIDN0:9的逆转录病毒包装克隆A2、B11、C5或D2竖纹柱）时；或者与对照靶细胞SNU1079点状柱）、SNU1196白柱）、938mel方格柱）或938CD70黑柱）、或RCC靶细胞RCC2245R正斜杠柱）、RCC2246R反斜杠柱）、RCC2361R有横纹的柱或者RCC1764人字纹柱共培养时，分泌的IFN-γpgml的图。[0023]发明详述[0024]本发明的实施方案提供具有针对CD70的抗原特异性的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含:抗原结合-跨膜结构域，其含有缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的⑶27氨基酸序列，其中所述部分为SEQIDNO:2所限定的至少氨基酸残基237至260;4-IBB胞内T细胞信号转导结构域;CD3G胞内T细胞信号转导结构域；以及任选地，CD28胞内T细胞信号转导结构域。在下文中，提及“CAR”，也指CAR的功能部分和功能变体，除非另外指明。[0025]CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号转导结构域相连的受体例如，肿瘤坏死因子TNF受体的抗原结合结构域。CAR的特征包括它们利用受体的抗原结合特性，使T细胞的特异性和反应性以不限于主要组织相容性复合体MHC的方式重定向至选定靶标的能力。不限于MHC的抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体TCRα和β链二聚化。[0026]本文使用的短语“具有抗原特异性”和“引发抗原特异性应答”意为，CAR能够特异性结合并免疫识别抗原，以使CAR与抗原的结合引发免疫应答。[0027]本发明的CAR具有针对⑶70的抗原特异性。CD70属于TNF超家族，并具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。当CD70与其受体CD27相互作用时，其是参与淋巴来源的细胞的增殖和存活的共刺激分子。CD70的正常、非癌表达限于淋巴组织，如激活的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞NK、单核细胞和树突细胞。CD70在多种人类癌症中表达，如例如RCCDiegmann等人，Eur.J.Cancer，41:1794-8012005例如透明细胞RCCccRCC、胶质母细胞瘤（Held-Feindt等人，Int.J.Cancer,98:352-562002;Wischhusen等人，CancerRes.,62:2592-992002、NHL和CLLLens等人，Br·J·Haematol·，106:491-5031999、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及滤泡性淋巴瘤。[0028]不受特定理论或机制的束缚，据信通过引发针对CD70的抗原特异性应答，本发明的CAR提供任何下述的一种或多种:靶向并破坏表达CD70的癌细胞，减少或清除癌细胞，促进免疫细胞至肿瘤部位的浸润，以及增强扩展抗癌应答。由于正常的CD70表达限于诸如激活的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突细胞的淋巴组织，考虑本发明的CAR有利地大幅避免了靶向破坏多种正常组织。[0029]本发明的实施方案提供了CAR，其包含含有CD27氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域。就这点而言，CAR可以既包含⑶27抗原结合结构域又包含⑶27跨膜结构域。CD27可以包含任何合适的人抗原结合-跨膜结构域CD27氨基酸序列或者由其组成。在本发明的实施方案中，包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内T细胞信号转导结构域的全长CD27具有SEQIDN0:2的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，CD27的抗原结合结构域由SEQIDN0:2的氨基酸残基1-188组成，并具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，CD27的跨膜结构域由SEQIDN0:2的氨基酸残基189-211组成，并具有SEQIDN0:22的氨基酸序列，以及⑶27的胞内T细胞信号转导结构域由SEQIDNO:2的氨基酸残基212-260组成，并具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。因此，在本发明的实施方案中，CAR包含含有SEQIDN0:21和22的氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域。CD27的抗原结合结构域特异性结合CD70。[0030]本发明的实施方案提供包含抗原结合-跨膜结构域的CAR，所述抗原结合-跨膜结构域包含缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的CD27氨基酸序列，其中CAR缺乏的所述部分为SEQIDN0:2所限定的至少连续氨基酸残基237至260,至少连续氨基酸残基236至260，至少连续氨基酸残基235至260，至少连续氨基酸残基234至260，至少连续氨基酸残基233至260，至少连续氨基酸残基232至260，至少连续氨基酸残基231至260，至少连续氨基酸残基230至260，至少连续氨基酸残基229至260，至少连续氨基酸残基228至260，至少连续氨基酸残基227至260，至少连续氨基酸残基226至260，至少连续氨基酸残基225至260，至少连续氨基酸残基224至260，至少连续氨基酸残基223至260，至少连续氨基酸残基222至260，至少连续氨基酸残基221至260，至少连续氨基酸残基220至260，至少连续氨基酸残基219至260，至少连续氨基酸残基218至260，至少连续氨基酸残基217至260，至少连续氨基酸残基216至260,至少连续氨基酸残基215至260,至少连续氨基酸残基214至260或者至少连续氨基酸残基213至260。在本发明的实施方案中，抗原结合-跨膜结构域包含缺乏SEQIDNO:2的连续氨基酸残基237至260，连续氨基酸残基236至260，连续氨基酸残基235至260，连续氨基酸残基234至260，连续氨基酸残基233至260，连续氨基酸残基232至260，连续氨基酸残基231至260，连续氨基酸残基230至260，连续氨基酸残基229至260，连续氨基酸残基228至260，连续氨基酸残基227至260，连续氨基酸残基226至260，连续氨基酸残基225至260，连续氨基酸残基224至260，连续氨基酸残基223至260，连续氨基酸残基222至260，连续氨基酸残基221至260,连续氨基酸残基220至260,连续氨基酸残基219至260,连续氨基酸残基218至260，连续氨基酸残基217至260，连续氨基酸残基216至260，连续氨基酸残基215至260，连续氨基酸残基214至260或者连续氨基酸残基213至260的⑶27氨基酸序列。缺乏⑶27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的CD27氨基酸序列在本文也被称为“截短的CD27氨基酸序列”或“截短的⑶27”。[0031]在优选实施方案中，抗原结合-跨膜结构域包含缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部的CD27氨基酸序列。就这点而言，抗原结合-跨膜结构域包含缺乏SEQIDNO:2所限定的连续氨基酸残基212至260的⑶27氨基酸序列或者缺乏SEQIDNO:2的连续氨基酸残基212至260的CD27氨基酸序列。在本发明的实施方案中，抗原结合-跨膜结构域包含缺乏SEQIDN0:23的氨基酸序列的⑶27氨基酸序列。在本发明的实施方案中，包含缺乏⑶27胞内T细胞信号转导结构域的全部的CD27氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域，包含与SEQIDNO:3至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列或者由与SEQIDN0:3至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成，或者包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或由SEQIDNO:3的氨基酸序列组成。[0032]CAR还可以包含4-1BB胞内T细胞信号转导结构域;CD3G胞内T细胞信号转导结构域；以及任选地，CD28胞内T细胞信号转导结构域。在本发明的实施方案中，CAR包含4-1BB胞内T细胞信号转导结构域、CD3G胞内T细胞信号转导结构域和CD28胞内T细胞信号转导结构域。在本发明的另一实施方案中，CAR包含4-1BB胞内T细胞信号转导结构域和CD3G胞内T细胞信号转导结构域。在优选实施方案中，4_1BB、CD3G和CD28胞内T细胞信号转导结构域是人的。⑶28是T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。4-1BB也被称为⑶137,其向T细胞传输强有力的共刺激信号，促进了T淋巴细胞的分化并增强了T淋巴细胞的长期存活。CD3G与TCR联合以产生信号，并且其包含免疫受体酪氨酸激活基序ITAM。[0033]CD3G胞内T细胞信号转导结构域可以包含任何合适的人CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列或者由其组成。在本发明的实施方案中，CD3G胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDNO:4至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列或者由与SEQIDN0:4至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域包含SEQIDN0:4的氨基酸序列或者由其组成。[0034]4-1BB胞内T细胞信号转导结构域可以包含任何合适的人4-1BB胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列或者由其组成。在本发明的实施方案中，4-1BB胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDNO:5至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列或者由与SEQIDN0:5至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，4-1BB胞内T细胞信号转导结构域包含SEQIDNO:5的氨基酸序列或者由其组成。[0035]CD28胞内T细胞信号转导结构域可以包含任何合适的人CD28胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列或者由其组成。在本发明的实施方案中，CD28胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDNO:6至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列或者由与SEQIDN0:6至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，⑶28胞内T细胞信号转导结构域包含SEQIDN0:6的氨基酸序列或者由其组成。[0036]在本发明的实施方案中，CAR包含与CD3G胞内T细胞信号转导结构域组合的全长CD27氨基酸序列全长fCD27-CD3GCAR，所述全长CD27氨基酸序列含有CD27抗原结合结构域、CD27跨膜结构域和CD27胞内T细胞信号转导结构域。就这点而言，CAR可以包含与SEQIDNO:2至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的全长CD27氨基酸序列和本文就本发明其它方面所描述的任何CD3G氨基酸序列，或者由与SEQIDN0:2至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的全长CD27氨基酸序列和本文就本发明其它方面所描述的任何〇3ζ氨基酸序列组成。例如，fCD27-CD3GCAR可以包含SEQID如:2的全长027氨基酸序列和SEQIDN0:4的03ζ氨基酸序列，或者由SEQIDN0:2的全长CD27氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，fCD27-CD3GCAR可以包含与SEQIDN0:7至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列或者由与SEQIDNO:7至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，fCD27-CD3GCAR包含SEQIDN0:7的氨基酸序列或者由其组成。在本发明的实施方案中，f⑶27-⑶3GCAR缺乏截短的⑶19和DsRed之一或两者。[0037]在本发明的实施方案中，CAR包含与⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域和⑶28胞内T细胞信号转导结构域组合的全长⑶27氨基酸序列（f⑶27-CD28-⑶3ζ，所述全长⑶27氨基酸序列含有CD27抗原结合结构域、CD27跨膜结构域和CD27胞内T细胞信号转导结构域。就这点而言，CAR可以包含本文就本发明其它方面所描述的任何全长CD27氨基酸序列、任何CD3G氨基酸序列和任何CD28氨基酸序列，或者由本文就本发明其它方面所描述的任何全长CD27氨基酸序列、任何⑶3ζ氨基酸序列和任何⑶28氨基酸序列组成。例如，f⑶27-CD28-⑶3GCAR可以包含SEQIDNO:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列和SEQIDNO:6的CD28氨基酸序列，或者由SEQIDNO:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列和SEQIDΝ0:6的CD28氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，fCD27-CD28-CD3GCAR可以包含与SEQIDNO:11至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDNO:11至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，f⑶27-⑶28-⑶3GCAR包含SEQIDNO:11的氨基酸序列或者由其组成。[0038]在本发明的实施方案中，CAR包含与⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域和4-1BB胞内T细胞信号转导结构域组合的全长⑶27氨基酸序列（f⑶27-4-1BB-CD30，所述全长⑶27氨基酸序列含有CD27抗原结合结构域、CD27跨膜结构域和CD27胞内T细胞信号转导结构域。就这点而言，CAR可以包含本文就本发明其它方面所描述的任何全长CD27氨基酸序列、任何CD3G氨基酸序列和任何4-1BB氨基酸序列，或者由本文就本发明其它方面所描述的任何全长⑶27氨基酸序列、任何⑶3ζ氨基酸序列和任何4-1BB氨基酸序列组成。例如，f⑶27-4-1BB-CD3ζCAR可以包含SEQIDN0:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDN0:4的CD3ζ氨基酸序列和SEQIDNO:5的4-1BB氨基酸序列，或者由SEQIDNO:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDNO:4的⑶3ζ氨基酸序列和SEQIDNO:5的4-1BB氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，fCD27-4-lBB-CD3GCAR可以包含与SEQIDNO:12至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDN0:12至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，fCD27-4-lBB-CD3ζCAR包含SEQIDN0:12的氨基酸序列或者由其组成。[0039]在本发明的实施方案中，CAR包含与⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域、4-1BB胞内T细胞信号转导结构域和CD28胞内信号转导结构域组合的全长CD27氨基酸序列（fCD27-CD28-4-lBB-CD3G，所述全长CD27氨基酸序列含有CD27抗原结合结构域、CD27跨膜结构域和CD27胞内T细胞信号转导结构域。就这点而言，CAR可以包含本文就本发明其它方面所描述的任何全长CD27氨基酸序列、任何CD3G氨基酸序列、任何4-1BB氨基酸序列以及任何CD28氨基酸序列，或者由本文就本发明其它方面所描述的任何全长CD27氨基酸序列、任何CD3G氨基酸序列、任何4-1BB氨基酸序列以及任何⑶28氨基酸序列组成。例如，f⑶27-CD28-4-lBB-CD3ζCAR可以包含SEQIDN0:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDN0:4的CD3ζ氨基酸序列、SEQIDN0:5的4-1BB氨基酸序列和SEQIDN0:6的CD28氨基酸序列，或者由SEQIDNO:2的全长CD27氨基酸序列、SEQIDN0:4的03ζ氨基酸序列、SEQIDN0:5的4-1BB氨基酸序列和SEQIDN0:6的CD28氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，fCD27-CD28-4-lBB-CD3GCAR可以包含与SEQIDNO:13至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDNO:13至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，fCD27-CD28-4-lBB-CD3GCAR包含SEQIDNO:13的氨基酸序列或者由其组成。[0040]在本发明的实施方案中，CAR包含与小鼠CD3G胞内T细胞信号转导结构域组合的全长小鼠⑶27氨基酸序列mCD27-⑶3ζ，所述全长小鼠⑶27氨基酸序列含有⑶27抗原结合结构域、CD27跨膜结构域和CD27胞内T细胞信号转导结构域。就这点而言，CAR可以包含与小鼠CD3G氨基酸序列组合的全长小鼠CD27氨基酸序列，或者由与小鼠CD3G氨基酸序列组合的全长小鼠⑶27氨基酸序列组成，所述全长小鼠⑶27氨基酸序列与SEQIDNO:26至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同，所述小鼠〇3ζ氨基酸序列与SEQIDNO:27至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。例如，mCD27-CD3GCAR可以包含SEQIDNO:26的全长小鼠CD27氨基酸序列和SEQIDNO:27的小鼠03ζ氨基酸序列，或者由SEQIDNO:26的全长小鼠⑶27氨基酸序列和SEQIDN0:27的小鼠⑶3ζ氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，mCD27-CD3GCAR可以包含与SEQIDNO:25至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDN0:25至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，m⑶27-⑶3GCAR包含SEQIDNO:25的氨基酸序列或者由其组成。[0041]在本发明的实施方案中，CAR包含与⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域和⑶28胞内T细胞信号转导结构域组合的，包含截短的CD27氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域截短的Δ⑶27-⑶28-⑶3ζ，所述截短的⑶27氨基酸序列缺乏⑶27胞内T细胞信号转导结构域的全部。就这点而言，CAR可以包含与本文就本发明其它方面所描述的任何CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列和任何CD28胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列组合的截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列，或者由与本文就本发明其它方面所描述的任何CD3ζ胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列和任何CD28胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列组合的截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列组成，所述截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列与SEQIDNO:3至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同。例如，ACD27-CD28-CD3GCAR可以包含，SEQIDN0:3的截短的⑶27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDNO:4的⑶3ζ氨基酸序列和SEQIDNO:6的⑶28氨基酸序列，或者由SEQIDNO:3的截短的⑶27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDN0:4的03ζ氨基酸序列和SEQIDN0:6的CD28氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，ΔCD27-CD28-CD3ζCAR可以包含与SEQIDN0:8至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDNO:8至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，ACD27-CD28-CD3GCAR包含SEQIDN0:8的氨基酸序列或者由其组成。[0042]在本发明的实施方案中，CAR包含与⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域和4-1BB胞内T细胞信号转导结构域组合的，包含截短的CD27氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域（ΔCD27-4-1BB-⑶3ζ，所述截短的⑶27氨基酸序列缺乏⑶27胞内T细胞信号转导结构域的全部。就这点而言，CAR可以包含本文就本发明其它方面所描述的任何截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、任何CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列和任何4-1BB胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列，或者由本文就本发明其它方面所描述的任何截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、任何CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列和任何4-1BB胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列组成。例如，Δ⑶27-4-lBB-CD3CCAR可以包含SEQIDNO:3的截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列和SEQIDΝ0:5的4-1ΒΒ氨基酸序列，或者由SEQIDΝ0:3的截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列和SEQIDNO:5的4-1ΒΒ氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，ACD27-4-1BB-CD3GCAR可以包含与SEQIDN0:9至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDN0:9至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，ACD27-4-lBB-CD3GCAR包含SEQIDNO:9的氨基酸序列或者由其组成。[0043]在本发明的实施方案中，CAR包含与CD3G胞内T细胞信号转导结构域、CD28胞内T细胞信号转导结构域和4-1BB胞内T细胞信号转导结构域组合的，包含截短的CD27氨基酸序列的抗原结合-跨膜结构域（八〇27-0028-4-188-〇3，所述截短的〇27氨基酸序列缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部。就这点而言，CAR可以包含本文就本发明其它方面所描述的任何截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、任何CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列、任何CD28胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列以及任何4-1BB胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列，或者由本文就本发明其它方面所描述的任何截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、任何CD3G胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列、任何CD28胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列以及任何4-1BB胞内T细胞信号转导结构域氨基酸序列组成。例如，ACD27-CD28-4-lBB-CD3GCAR可以包含SEQID腸:3的截短的027抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列、SEQIDNO:6的CD28氨基酸序列以及SEQIDNO:5的4-1BB氨基酸序列，或者由SEQIDNO:3的截短的CD27抗原结合-跨膜结构域氨基酸序列、SEQIDNO:4的03ζ氨基酸序列、SEQIDNO:6的CD28氨基酸序列以及SEQIDN0:5的4-1BB氨基酸序列组成。在本发明的实施方案中，ACD27-CD28-4_1BB-CD3GCAR可以包含与SEQIDNO:10至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列，或者由与SEQIDNO:10至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的氨基酸序列组成。优选地，ΔCD27-CD28-4-lBB-CD3ζCAR包含SEQIDN0:10的氨基酸序列或者由其组成。[0044]在本发明的实施方案中，CAR包含与SEQIDN0:8-10中任一项至少约90%相同的氨基酸序列。在本发明的实施方案中，CAR包含与SEQIDN0:9或10至少约90%相同的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，CAR包含与SEQIDNO:11-13中任一项至少约90%相同的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，CAR包含与SEQIDNO:12或13至少约90%相同的氨基酸序列。优选地，CAR包含表IA所示的任一氨基酸序列，由表IA所示的任一氨基酸序列组成，或者基本由表IA所示的任一氨基酸序列组成。在本发明的优选实施方案，CAR包含SEQIDN0:7-13中任一项的氨基酸序列。优选地，CAR包含SEQIDN0:9、10、12和13中任一项的氨基酸序列。[0045]表IA[0046][0047][0048]本发明的范围包括本文所述的本发明的CAR的功能部分。当提及CAR使用时，术语“功能部分”指本发明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留所述部分或片段所来源的CAR亲本CAR的生物活性。功能部分涵盖，例如保留与亲本CAR相似程度、相同程度或者比亲本CAR更高程度地识别靶细胞或者检测、治疗或预防癌症的能力的CAR的那些部分。提及亲本CAR，功能部分可以包含例如亲本CAR的约10%、约25%、约30%、约50%、约68%、约80%、约90%、约95%或更多。[0049]功能部分在所述部分的氨基端或羧基端或这两端可以包含其它氨基酸，所述其它氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中不存在。可取地，所述其它氨基酸不干扰功能部分诸如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等的生物功能。更可取地，与亲本CAR的生物活性相比，所述其它氨基酸增强了生物活性。[0050]本发明的范围包括本文所述的本发明的CAR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”指与亲本CAR具有大量的或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白，所述功能变体保留了该变体所来源的CAR的生物活性。功能变体涵盖，例如保留与亲本CAR相似程度、相同程度或比亲本CAR更高程度地识别靶细胞的能力的本文所述CAR亲本CAR的那些变体。提及亲本CAR，功能变体可以，例如与亲本CAR在氨基酸序列方面至少约30%、约50%、约75%、约80%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%相同或者更加相同。[0051]功能变体可以，例如包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。可选地或另外，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸置换优选不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，以使与亲本CAR相比，功能变体的生物活性增加。[0052]本发明的CAR的氨基酸置换优选保守氨基酸置换。保守氨基酸置换在本领域是已知的，并且包含这样的氨基酸置换，其中具有某些物理和或化学特性的一个氨基酸被换成具有相同或相似化学或物理特性的另一氨基酸。例如，保守氨基酸置换可以是酸性带负电荷的极性氨基酸被另一酸性带负电荷的极性氨基酸例如Asp或Glu置换，具有非极性侧链的氨基酸被另一具有非极性侧链的氨基酸（例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pr〇、Trp、CyS、Val等置换，碱性带正电荷的极性氨基酸被另一碱性带正电荷的极性氨基酸例如Lys、His、Arg等置换，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸被另一具有极性侧链的不带电荷的氨基酸例如4811、6111、561'、1'111'、171'等置换，具有0分支侧链的氨基酸被另一具有β分支侧链的氨基酸例如Ile、Thr和Val置换，具有芳香族侧链的氨基酸被另一具有芳香族侧链的氨基酸例如His、Phe、Trp和Tyr置换等。[0053]CAR可以基本由指定的氨基酸序列或者本文所述的序列组成，以使其它成分例如其它氨基酸不实质性改变功能变体的生物活性。[0054]本发明的实施方案的CAR可以是任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，条件是所述CAR保留它们的生物活性，例如特异性结合抗原、检测哺乳动物中的癌细胞或者治疗或预防哺乳动物中的癌症等的能力。例如，CAR的长度可以是约50至约5000个氨基酸，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。[0055]本发明的实施方案的CAR可以包含合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。此类合成的氨基酸在本领域是已知的，并且包括例如，氨基环己羧酸、正亮氨酸、α-氨基η-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1，2,3,4_四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、Ν’-苯甲基-Ν’-甲基-赖氨酸、Ν’，Ν’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-2-氨基-2-降莰烧-羧酸、α，γ_二氨基丁酸、α，β_二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔-丁基甘氨酸。[0056]本发明的实施方案的CAR可被糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、经例如二硫键环化，或者转变为酸加成盐和或任选地二聚化或多聚化或缀合。[0057]本发明的实施方案的CAR可以通过本领域已知的方法获得，如例如从头合成。另夕卜，可以利用标准重组方法，利用本文所述的核酸重组产生多肽和蛋白。参见，例如Green和Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual，第4版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY2012。可选地，本文所述的CAR可以通过公司商业合成，如SynpepDublin，CA、PeptideTechnologiesCorp·Gaithersburg,MD以及MultiplePeptideSystemsSanDiego，CA。在这方面，本发明的CAR可以是合成的、重组的、分离的和或纯化的。[0058]本发明的实施方案还提供了包含编码本文所述的任何CAR的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可以包含编码本文所述的任何抗原结合结构域、跨膜结构域和或胞内T细胞信号转导结构域的核苷酸序列。在本发明的实施方案中，核酸包含表IB所示的任一核苷酸序列，或者由表IB所示的任一核苷酸序列组成，或者基本由表IB所示的任一核苷酸序列组成。优选地，核酸包含SEQIDNO:14-20中任一项的核苷酸序列。优选地，核酸包含SEQID勵：16、17、19和20中任一项的核苷酸序列。在本发明的实施方案中，编码沈027-〇30六如勺核苷酸序列不编码截短的⑶19和DsRed之一或两者。[0059]表IB[0060][0061]本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意为DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链，合成的或从天然来源获得的（例如分离的和或纯化的），其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间连键，如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，替代存在于未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和或置换。然而，如本文所讨论的，在一些情况下核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和或置换可能是合适的。在一些实施方案中，核酸可以编码这样的其它氨基酸序列:其不影响CAR的功能，并且其在宿主细胞表达核酸时可能被翻译或者可能不被翻译。[0062]本发明的实施方案的核酸可以是重组体。本文使用的术语“重组体”指（i通过将天然的或合成的核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或者（ii由以上⑴中所述的那些分子的复制而产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。[0063]重组核酸可以是具有非天然存在的序列或者具有通过序列的两个原本分离的区段的人工组合而制备的序列的一种核酸。该人工组合通常通过化学合成来完成，或者更通常通过人工操纵分离的核酸区段来完成，例如通过诸如以上的Green和Sambrook中所述的那些技术的基因工程技术来完成。可以利用本领域已知的程序，基于化学合成和或酶连接反应构建核酸。参见，例如以上的Green和Sambrook。例如，可以利用天然存在的核苷酸或者设计以增加分子的生物稳定性或者增加杂交时所形成的双链体的物理稳定性的不同修饰的核苷酸例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸来化学合成核酸。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于:5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-羧基羟甲基尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D半乳糖基Q核苷（beta-D-区]^：1:〇8719116〇8；[116、肌酐、1'16-异戊稀腺噪呤、1-甲基鸟噪呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷beta-D-mannosylqueosine、5’-甲氧基羧甲基尿啼啶、5-甲氧基尿啼啶、2-甲硫基-N6-异戊稀腺噪呤、尿啼啶-5-轻乙酸V、怀丁苷wybutoxosine、假尿啼啶、Q核苷queosine、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、3-3-氨基-3-N-2-羧丙基尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的核酸中的一种或多种可购自诸如MacromolecularResourcesFortCollins，CO和SynthegenHouston，TX的公司。[0064]核酸可以包含编码本文就本发明其它方面所描述的任何CAR的任何分离或纯化的核苷酸序列。可选地，核苷酸序列可以包含任何序列简并的核苷酸序列或者简并序列的组合。[0065]本发明的实施方案还提供分离或纯化的核酸，其含有与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者含有在严紧条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。[0066]在严紧条件下杂交的核苷酸序列可以在高度严紧条件下杂交。“高度严紧条件”意为核苷酸序列以可检测地比非特异性杂交更强的量与靶序列本文所述的任何核酸的核苷酸序列特异性杂交。高度严紧条件包括将含有准确互补序列的多核苷酸或者仅含有数个分散的错配的多核苷酸与恰巧具有匹配核苷酸序列的数个小的区域例如3-10个碱基）的随机序列区分开的条件。此类小的互补区域比14-17个或者更多个碱基的全长互补体更易熔化，并且高度严紧杂交使其易于区分。相对高度严紧的条件将包括，例如低盐和或高温条件，如由约0.02-0.IMNaCl或等同物，在约50-70°C的温度下所提供的条件。此类高度严紧条件容忍极少如果存在核苷酸序列与模板或靶标链之间的错配，并且特别适合于检测任何本发明的CAR的表达。普遍认为通过添加增加量的甲酰胺可以导致更严紧的条件。[0067]本发明还提供这样的核酸，其包含与本文所述的任何核酸至少约70%或者更多，例如约80%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的核苷酸序列。[0068]在实施方案中，可将本发明的核酸并入重组表达载体。就这点而言，本发明的实施方案提供包含本发明的任何核酸的重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”意为遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以使mRNA、蛋白、多肽或肽在细胞内表达的条件下将载体与细胞接触时，其允许由宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体作为整体不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或者部分由天然来源获得的，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连键或者两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不妨碍载体的转录或复制。在本发明的实施方案中，包含编码fCD27-CD3GCAR的核苷酸序列的重组表达载体不编码截短的⑶19和DsRed之一或两者。[0069]在实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计以用于增殖和扩增或者用于表达或者用于这两种的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列FermentasLifeSciences,GlenBurnie,MD、pBluescript系列（Stratagene，LaJolla，CA、pET系列Novagen,Madison，WI、pGEX系列（PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden以及pEX系列Clontech,PaloAlto，CA。也可使用诸如XGTlO、XGT11azapllStratagene、XEMBL4和λ匪1149的噬菌体载体。植物表达载体的实例包括？8101、？81101.2、？81101.3、？81121和pBIN19Clontech。动物表达载体的实例包括pEUK_Cl、pMAM和pMAMneoClontech。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体可以是转座子。[0070]在实施方案中，可以利用例如以上Green和Sambrook中所述的标准重组DNA技术来制备本发明的重组表达载体。可将环状或线性表达载体的构建体制备为含有在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可以来源于，例如ColEl、2μ质粒、A、SV40、牛乳头瘤病毒等。[0071]重组表达载体可以包含调控序列，如转录和翻译起始和终止密码子，视情况而定并且考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的，其对于待引入载体的宿主细胞的类型（例如细菌、真菌、植物或动物具有特异性。重组表达载体可以包含限制位点以促进克隆。[0072]重组表达载体可以包含允许对转化或转染的宿主细胞进行选择的一种或多种标志物基因。标志物基因包括抗微生物剂抗性例如对抗生素、重金属等的抗性），在营养缺陷型宿主中互补以提供原营养等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如新霉素G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因以及氨苄西林抗性基因。[0073]重组表达载体可以包含与以下序列可操作地连接的天然或非天然的启动子:编码CAR的核苷酸序列或者与编码CAR的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的，在本领域技术人员的普通技术内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域技术人员的技术内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子或鼠干细胞病毒的长末端重复中存在的启动子。[0074]可将本发明的重组表达载体设计为瞬时表达、稳定表达或者设计为这两种。另外，可将重组表达载体制备为组成型表达或诱导型表达。[0075]此外，可将重组表达载体制备为包含自杀基因。本文使用的术语“自杀基因”指引起表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予基因在其中表达的细胞针对试剂例如药物的敏感性的基因，并且当细胞与所述试剂接触或者暴露于所述试剂时引起细胞死亡。自杀基因在本领域是已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒HSV胸苷激酶TK基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。[0076]本发明的实施方案还提供包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文使用的术语“宿主细胞”指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类;或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接由生物体如人分离到的细胞。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞在本领域是已知的，并且包括，例如DH5a大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5a细胞。出于产生重组CAR的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何类型的细胞、可以来源于任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段，但是宿主细胞可以是外周血淋巴细胞PBL或外周血单核细胞PBMC。宿主细胞可以是T细胞。[0077]出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞;或者是来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等;或者是获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，T细胞可以获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或者其它组织或液体。T细胞也可以是富集的或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞例如Th1和Th2细胞）、CD8+T细胞例如细胞毒性T细胞）、月中瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。[0078]本发明的实施方案还提供包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是除了至少一种其它细胞外还包含含有所述任何重组表达载体的宿主细胞的异质群，所述其它细胞例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞例如T细胞或者除了T细胞之外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。可选地，细胞群可以是基本同质的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞（例如基本由含有重组表达载体的宿主细胞组成）。群体也可以是克隆细胞群，其中群体的所有细胞均为含有重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以使群体的所有细胞均包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。[0079]在本发明的实施方案中，群体中细胞的数目可以快速扩增。表达CAR的细胞的数目的扩增可以通过如以下中所述的本领域已知的多种方法中的任何方法来完成，例如美国专利8,034,334;美国专利8,383,099;美国专利申请公开号20120244133;Dudley等人，J.Immunother·，26:332-422003;以及Ridde11等人，J.Immunol.Methods，128:189-2011990。在实施方案中，通过将T细胞与0KT3抗体、IL-2和饲养PBMC例如受辐射的同种异体PBMC—起培养来进行细胞数目的扩增。[0080]在下文中CAR、核酸、重组表达载体和宿主细胞包括其群体共同被称作“本发明的CAR材料”，其可以是分离的和或纯化的。本文使用的术语“分离的”意为已从其天然环境中移出。术语“纯化的”或“分离的”不要求绝对的纯度和分离;而是其意图作为相对术语。因此，例如纯化的（或分离的）宿主细胞制备物是一种这样的制备物，其中宿主细胞比其体内天然环境中的细胞更纯。此类宿主细胞可以，例如通过标准纯化技术产生。在一些实施方案中，将宿主细胞制备物进行纯化，以使宿主细胞代表制备物总细胞含量的至少约50%，，例如至少约70%。例如，纯度可以是至少约50%，可以高于约60%、约70%或约80%，或者可以是约100%。[0081]可将本发明的CAR材料配制为组合物，如药物组合物。就这点而言，本发明的实施方案提供包含任何CAR、核酸、表达载体和宿主细胞包括其群体）以及药学可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的CAR材料的本发明的药物组合物可以包含多种本发明的CAR材料，例如CAR和核酸，或者两种或更多种不同的CAR。可选地，药物组合物可以包含与其它药学活性剂或药物组合的本发明的CAR材料，所述其它药学活性剂或药物如化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉酚、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在优选实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。[0082]优选地，载体是药学可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于所考虑的具体的本发明的CAR材料的那些载体中的任何载体。此类药学可接受的载体对于本领域技术人员而言众所周知，并且公众容易获得。优选地，药学可接受的载体是在使用条件下，无有害副作用或毒性的载体。[0083]载体的选择部分将由具体的本发明的CAR材料以及由用于施用本发明的CAR材料的具体方法决定。因此，存在多种合适的本发明的药物组合物的制剂。合适的制剂可以包括用于口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内或腹膜间施用的那些制剂中的任何制剂。可以利用多种途径来施用本发明的CAR材料，并且在某些情况下，特定途径可以比另一途径提供更直接以及更有效的应答。[0084]优选地，通过注射，例如静脉内注射施用本发明的CAR材料。当本发明的CAR材料是表达本发明的CAR的宿主细胞时，用于注射的细胞的药学可接受的载体可以包括任何等张载体，如例如生理盐水含约0.90%wvNaCl的水，含约300m0smLNaCl的水，或者每升水约9.0gNaCl、N0RM0S0LR电解质溶液（Abbott,Chicago,IL、PLASMA-LYTEA^axter,Deerfield，IL、含约5%葡萄糖的水或者乳酸林格氏液。在实施方案中，用人血清白蛋白补充药学可接受的载体。[0085]本发明的CAR材料的剂量也将由可能伴随具体的本发明的CAR材料的施用的任何不良副反应的存在、性质和程度决定。通常，考虑多种因素，如年龄、体重、整体健康、饮食、性别、待施用的本发明的CAR材料、施用途径以及被治疗的癌症的严重性，主治医师将决定用于治疗各个体患者的本发明的CAR材料的剂量。在本发明的CAR材料是细胞群的实施方案中，每次输注施用的细胞的数目可以不同，例如从约IXIO6至约IX1〇12个细胞或更多。在某些实施方案中，可以施用少于IXIO6个细胞。[0086]出于本发明的目的，施用的本发明的CAR材料的量或剂量应当足以在合理的时间框内在对象或动物中产生治疗应答或预防应答。例如，本发明的CAR材料的剂量应当足以在离施用时间约2小时或更长，例如约12至约24或者更多个小时的时间段内结合抗原，或者检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段甚至可能更长。剂量将由具体的本发明的CAR材料的效力和动物例如人的情况以及待治疗的动物例如人的体重决定。[0087]出于本发明的目的，可以使用下述分析来确定向哺乳动物施用的起始剂量:其包括例如比较各给予不同剂量的表达本发明的CAR的T细胞的一组哺乳动物中，在向哺乳动物施用给定剂量的此类T细胞时，靶细胞裂解的程度和或此类T细胞分泌IFN-γ的程度。可以通过本领域已知的方法来分析施用某一剂量时，靶细胞裂解和或IFN-γ分泌的程度。[0088]本领域普通技术人员将容易地理解，可以以多种方式对本发明的CAR材料进行修饰，以通过修饰增加本发明的CAR材料的治疗或预防效力。例如，可将本发明的CAR材料直接或经接头间接与靶向部分缀合。将化合物，例如本发明的CAR材料与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。[0089]当将本发明的CAR材料与一种或多种其它治疗剂一起施用时，一种或多种其它治疗剂可以共施用至哺乳动物。“共施用”意为在时间上足够接近地施用一种或多种其它治疗剂和本发明的CAR材料，以使本发明的CAR材料可以增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。就这点而言，可以首先施用本发明的CAR材料，之后施用一种或多种其它治疗剂，反之亦然。可选地，可以同时施用本发明的CAR材料和一种或多种其它治疗剂。可与CAR材料共施用的示例性治疗剂是IL-2。据信，IL-2增强本发明的CAR材料的治疗效果。[0090]考虑可将本发明的药物组合物、CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法中。不受特定理论或机制的束缚，本发明的CAR具有生物活性，例如识别抗原例如CD70的能力，以使当由细胞表达时，CAR能够介导针对表达CAR特异性抗原例如CD70的细胞的免疫应答。就这点而言，本发明的实施方案提供治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括向哺乳动物施用有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量的本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和或药物组合物。[0091]本发明的实施方案还包括在施用本发明的CAR材料前，对哺乳动物进行淋巴细胞清除。淋巴细胞清除的实例包括但可能不限于:非骨髓根除性淋巴细胞清除化疗、骨髓根除性淋巴细胞清除化疗、全身辐射等。[0092]出于施用宿主细胞或细胞群的本发明的方法的目的，细胞可以是与哺乳动物同种异体的细胞或是其自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。[0093]本文提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文使用的术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠；以及兔形目的哺乳动物，如兔。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科猫和犬科狗）。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科牛和猪科猪）；或者来自奇蹄目，包括马科马）。哺乳动物可以来自灵长目、猿Ceboids目或猴Simoids目（猴），或者来自类人猿目（人和类人猿）。优选地，哺乳动物是人。[0094]关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括任何急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、小泡型横纹肌肉瘤、膀胱癌bladdercancer例如膀胱癌bladdercarcinoma、骨癌、脑癌（例如髓母细胞瘤）、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病CLL、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌瘤、头颈癌例如头颈鳞状细胞癌）、胶质母细胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、肾癌kidneycancer、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌例如非小细胞肺癌）、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤NHL、B-慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病ALL和伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、舌咽癌、前列腺癌、RCC、ccRCC、直肠癌、肾癌（renalcancer、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌以及输尿管癌。优选地，癌症的特征为CD70的表达。在优选实施方案中，癌症是RCC例如ccRCC、胶质母细胞瘤、NHL、CLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤中的任何癌症。[0095]本文使用的术语“治疗”和“预防”以及尤其衍生的词语不一定意指100%或完全的治疗或预防。而是，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供任何量任何水平的哺乳动物中癌症的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可以包括被治疗或预防的疾病例如癌症）的一种或多种病况或症状的治疗或预防。另外，出于本文的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病况的发作。[0096]本发明的另一实施方案提供本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或药物组合物在哺乳动物中的癌症的治疗或预防中的用途。[0097]本发明的另一实施方案提供检测哺乳动物中癌症的存在的方法，其包括：（a使包含来自所述哺乳动物的一种或多种细胞的样本与本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群接触，从而形成复合物，（b以及检测复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中癌症的存在。[0098]样本可以通过任何合适的方法获得，例如活检或尸检。活检是从个体中移出组织和或细胞。此类移出可以是从个体中收集组织和或细胞，以便对移出的组织和或细胞进行实验。该实验可以包括确定个体是否患有和或正在遭受某种病况或病势的实验。病况或疾病可以是，例如癌症。[0099]关于检测哺乳动物中癌症的存在的本发明的方法的实施方案，包含哺乳动物细胞的样本可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的一部分例如细胞核或细胞质部分、全蛋白部分或核酸部分）的样本。如果样本包含全细胞，则细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。[0100]出于本发明的检测方法的目的，关于哺乳动物，接触可以发生在体外或体内。优选地，接触是在体外。[0101]另外，复合物的检测可以通过本领域已知的多种方式进行。例如，可用可检测的标记来标记本文所述的本发明的CAR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群，所述可检测的标记如例如，放射性同位素、荧光团（例如异硫氰酸荧光素（FITC、藻红蛋白PE、酶例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）以及元素颗粒例如金颗粒）。[0102]测试CAR识别靶细胞的能力以及其抗原特异性的方法在本领域是已知的。例如Clay等人，J.Immunol.,163:507-5131999教导了测量细胞因子（例如，干扰素-γ、粒细胞单核细胞集落刺激因子GM-CSF、肿瘤坏死因子aTNF-α或者白介素2IL-2的释放的方法。此外，如Zhao等人，J.Immunol.，174:4415-44232005中所述，可以通过测量细胞的细胞毒性来评估CAR的功能。[0103]下述实施例进一步阐明本发明，但是当然不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。[0104]实施例1[0105]本实施例显示了编码CARmCD27-CD3GCAR的逆转录病毒载体的转导效率以及mCD27-⑶3GCAR在体外针对表达m⑶70的肿瘤细胞的反应性，所述CAR含有全长小鼠⑶27和小鼠CD3GT细胞胞内信号转导结构域并具有SEQIDN0:25的氨基酸序列。[0106]构建编码CARmCD27-CD3GCAR的逆转录病毒载体，所述CAR含有全长小鼠CD27和小鼠⑶3ζΤ细胞胞内信号转导结构域并具有SEQID勵:25的氨基酸序列。用11£027403〇八1?逆转录病毒载体以逆转录病毒的方式转导鼠T细胞。转导效率确定为62.6%。[0107]由脾细胞产生的小鼠T细胞是未转导的UT或者转导有编码GFP或mCD27-CD3GCAR的载体效应细胞），并且单独培养培养基）或者与不表达小鼠CD70的B16黑素瘤细胞B16细胞或转导以表达小鼠CD70的B16细胞B16mCD70靶细胞共培养。将识别B16肿瘤的小鼠T细胞Pmel细胞用作阳性对照效应细胞。测量IFN-γ分泌。结果显示于表2中。如表2所示，mCD27-CD3GCAR转导的细胞显示出在体外针对表达CD70的肿瘤的高反应性。[0108]表2[0109][0110]实施例2[0111]本实施例显示，由转导有编码CARm⑶27-⑶3GCAR的核苷酸序列的脾细胞产生的小鼠T细胞降低了肿瘤负荷并增加了表达CD70的荷瘤小鼠的存活，所CAR含有全长小鼠CD27和小鼠CD3GT细胞胞内信号转导结构域并具有SEQIDN0:25的氨基酸序列。[0112]在将表达CAR的细胞转移至小鼠前11天，通过用B16细胞或B16mCD70细胞注射小鼠在小鼠中建立肿瘤。4天之后，从小鼠中移出脾细胞，并用伴刀豆球蛋白AConA和IL-7或者抗小鼠CD3m⑶3以及可溶的⑶28s⑶28对其进行刺激。两天之后，用编码具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的mCD27-⑶3GCAR的MSGVl逆转录病毒载体，转导由刺激的脾细胞产生的小鼠T细胞。5天之后，向荷瘤小鼠施用转导mCD27-⑶3GCAR的细胞（IXIO7，并且对小鼠进行福射500rad。向对照荷瘤小鼠施用未转导的细胞、磷酸盐缓冲盐水PBS或者pmel细胞pmel、gpl00疫苗V和IL-2⑴的组合（“pmel+VI”），并进行辐射。在治疗后长至约35天的时间段内，测量肿瘤大小。结果显示于图1A-1B中。如图1A-1B所示，mCD27-CD3GCAR转导的细胞降低了B16mCD70荷瘤小鼠中的肿瘤负荷，但是未降低B16荷瘤小鼠中的肿瘤负荷。因此，负荷有⑶70+肿瘤的小鼠可成功地用mCD27-⑶3GCAR转导的细胞进行治疗，并且治疗是⑶70特异性的。[0113]用B16mCD70荷瘤小鼠重复实验，除了用抗mCD3和sCD28刺激脾细胞，以及还在辐射以及施用转导的细胞之后向小鼠施用IL-2。向对照荷瘤小鼠施用未转导的细胞、空载体转导的细胞或者pmel+VI，之后进行辐射并施用IL-2。在治疗后长至约24天的时间段内，测量肿瘤大小。结果显示于图IF中。如图IF所示，当与IL-2共施用时，mCD27-CD3GCAR转导的细胞降低了B16mCD70荷瘤小鼠中的肿瘤负荷。[0114]细胞转移后21天，从被治疗的小鼠中移出肿瘤，并使其体外生长7天。通过FACS测量小鼠⑶70在肿瘤中的表达。观察到⑶70的表达在用mCD27-⑶3GCAR转导的细胞进行治疗的小鼠中丧失，但在用Pmel+V或未转导的细胞进行治疗的小鼠中未丧失。不受特定理论或机制的束缚，据信肿瘤生长的复发最可能是由于B16mCD70肿瘤中CD70表达的丧失。[0115]用B16m⑶70荷瘤小鼠再次重复与图IB对应的实验，包括下述例外。以每只小鼠IX104、IX105、1XIO6或IXIO7个细胞的剂量向B16mCD70荷瘤小鼠施用mCD27-CD3GCAR转导的细胞，进行或不进行辐射500Rad。向对照荷瘤小鼠施用PBS、pmel+VI或者转导有空载体的小鼠T细胞，进行或不进行辐射500Rad。结果显示于图1C-1D中。如图IC所示，当对小鼠进行辐射时，治疗肿瘤的最低有效剂量是每只小鼠IXIO5个mCD27-CD3GCAR转导的细胞。如图1C-1D所示，在每只小鼠IXIO7个细胞的剂量下，辐射似乎未影响治疗效力。[0116]也在治疗后长至约42天的时间段内对荷瘤小鼠的存活进行评估。结果显示于图IE中。如图IE所示，用mCD27-CD3GCAR转导的细胞治疗的受辐射的荷瘤小鼠存活更久，特别是在每只小鼠IXIO6或IXIO7个细胞的剂量下。[0117]实施例3[0118]本实施例显示，向荷瘤小鼠施用转导有mCD27-⑶3GCAR的细胞导致一些毒性。该实施例还显示，小鼠可以从毒性中恢复。[0119]向B16或B16m⑶70荷瘤小鼠施用未转导的细胞或者转导有具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的mCD27-CD3GCAR的细胞、PBS或pmel+V，进行或不进行辐射500Rad。在从细胞转移后约6天开始长至治疗后约17天的时间段内，测量小鼠的平均体重。结果显示于图2A-2D中。如图2A-2D所示，用mCD27-CD3GCAR治疗的B16mCD70和B16-荷瘤小鼠均观察到瞬时较低的体重。在mCD27-CD3GCAR治疗的小鼠中观察到的较低体重与移植的肿瘤无关。不受特定理论或机制的束缚，据信较低的体重指示内源细胞被mCD27-⑶3GCAR祀向。当向小鼠施用含水的水凝胶、亲水胶体hydrocolloid、食用酸以及苯甲酸钠时，小鼠恢复失去的体重。[0120]向B16或B16m⑶70-荷瘤小鼠施用未转导的细胞或者转导有具有SEQIDNO:25的氨基酸序列的mCD27-CD3GCAR的细胞，或者转导有编码GFP的载体的细胞，进行或不进行辐射500Rad。在从细胞转移后约6天开始长至治疗之后约14天的时间段内，测量小鼠中的绝对白细胞WBC计数。结果显示于图2E-2H中。如图2E-2F所示，在用mCD27-CD3GCAR进行治疗的小鼠中观察到瞬时较低的WBC计数。如图26-2!1所示，在用mCD27-CD3GCAR进行治疗的小鼠中也观察到瞬时较低的脾细胞计数。[0121]向B16mCD70-荷瘤小鼠施用转导有具有SEQID勵:25的氨基酸序列的111〇27-〇03GCAR的细胞或者转导有编码GFP的载体的细胞，进行或不进行辐射500Rad。测量血清IFN-γ水平，持续从细胞转移之后约3天开始长至治疗之后约7天的时间段。结果显示于图21中，如图21所示，在用m⑶27-⑶3GCAR治疗的受辐射的小鼠中观察到瞬时IFN-γ分泌。[0122]实施例4[0123]本实施例显示，mCD27-CD3GCAR的施用对于非荷瘤小鼠的长期免疫功能无可测量的影响。[0124]向非荷瘤小鼠施用转导有具有SEQID勵:25的氨基酸序列的111〇27-00304郎勺细胞或者转导有编码GFP的载体的细胞GFP，进行或不进行辐射500Rad。在转移转导的细胞之后32天或50天，用卵清蛋白（OVA或人hgplOO免疫小鼠。在免疫之后7天，从小鼠的脾脏和淋巴结LN移出T细胞。用0T-U0T-II或hgplOO肽体外刺激细胞。结果显示于表3第32天-脾脏）、表4第32天-LN以及表5第50天-脾脏）中。在表5中，将免疫的C57BL6免疫活性小鼠（B6Im用作阳性对照。将初始C57BL6小鼠（B6初始用作阴性对照。如表3-5中所示，mCD27-CD3GCAR的施用对于非荷瘤小鼠的长期免疫功能无可测量的影响。[0125]在细胞转移之后3至7天，对各器官的组织学进行检验，所述器官包括脑、肺、肝脏、肾脏、肠、心脏、脾脏和骨。在细胞转移之后3天至7天，对血液的化学成分，特别是下述的血液水平进行检验:钠、钾、氯化物、钙、镁、磷、葡萄糖、血尿素氮BUN、肌酸酐、尿酸、白蛋白、蛋白、胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶ALKP、丙氨酸氨基转移酶ALTGPT、天冬氨酸氨基转移酶ASTG0T、淀粉酶、肌酸激酶CK、以及乳酸脱氢酶LD。未观察到组织学或血液化学成分的改变。[0126]表3[0127][0128]表4[0129][0130]表5[0131][0132]实施例5[0133]本实施例显示，转导有编码含有全长人CD27和人CD3GT细胞胞内信号转导结构域的CARfCD27-CD3GCAR的核苷酸序列的T细胞，在转导的细胞的数目扩增之后表达所述CAR0[0134]用0KT3非特异性刺激PBL，并且产生自PBL的T细胞是a未转导的UT，（b用编码全长人⑶27f⑶27的核苷酸序列转导，或者（c用编码具有SEQIDNO:7的氨基酸序列的fCD27-⑶3GCAR的核苷酸序列转导。使细胞生长，通过荧光激活细胞分选FACS对CAR的表达进行分析，并基于IFN-γ的产生对肿瘤反应性进行测试。通常如Riddell等人，J.Immunol.Methods,128:189-2011990中所述，对CD70反应性细胞的数目进行快速扩增REP。使扩增数目的细胞生长，并通过FACS对⑶27、CD70、⑶45R0和⑶62L的表达进行分析。表6显示了通过FACS所测量的具有指示的表型的细胞的百分数。表7显示了刺激之后但是REP之前）以及REP之后细胞的倍数扩增以及活力（％。如表6和7所示，扩增数目的转导细胞表达CAR，有活力且具有效应记忆表型。[0135]表6[0136][0137][0138]表7[0139][0140]实施例6[0141]本实施例显示，转导有编码含有全长人CD27和人CD3GT细胞胞内信号转导结构域的CARf⑶27-CD3GCAR的核苷酸序列的T细胞，在与表达⑶70的细胞共培养时增殖，并且在体外特异性识别表达CD70的肿瘤细胞系。[0142]T细胞产生自人I^BL。将未转导的〇]1'1'细胞或转导有编码沈027或沈027-〇3〇八1?的核苷酸序列的T细胞效应细胞单独培养，或者与表达CD70的肿瘤细胞系624mel或转导有⑶70的624mel细胞624CD70祀细胞共培养。在共培养第4天，利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯CFSE测量效应细胞的增殖。转导有fCD27-⑶3GCAR的T细胞仅在与表达⑶70的肿瘤细胞系624CD70共培养时才增殖。UTT细胞和转导有fCD27的T细胞在任何培养中均不增殖。[0143]将UTT细胞或者转导有编码fCD27或fCD27-CD3GCARSEQIDN0:7的核苷酸序列的T细胞效应细胞单独培养培养基），或者与以下表8中显示的人RCC细胞系或对照细胞系624、624〇70、3冊245、3冊1079或3冊1196靶细胞）中的一种共培养。所有3冊细胞系均为⑶70阴性。测量IFN-γ的分泌。结果显示于表8中。如表8所示，转导有核苷酸序列代027_⑶3GCARSEQIDNO:7的T细胞对表达⑶70的人RCC细胞系具有反应性。[0144]表8[0145][0146]实施例7[0147]本实施例显示了抗⑶70人CAR构建体的转导效率。[0148]用空的逆转录病毒载体模拟或编码表9A-9C中所示的构建体中的一种的逆转录病毒载体转导人T细胞。含有截短的（△CD27的CAR缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部，即截短的CD27缺乏SEQIDNO:2的连续氨基酸残基212-260。通过FACS分析转导的细胞的CD3、CD27、CD62L和CD45R0的表达。表9A-9C显示了通过FACS所测量的具有指示的表型的细胞的百分数。如图表9B所示，转导有CAR的细胞具有效应记忆表型。[0149]表9A[0150][0151][0152]表9B[0153][0154]表9C[0155][0156][0157]实施例8[0158]本实施例显示，转导有fCD27-CD3GSEQIDN0:7、ACD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:9、ACD27-CD28-4-lBB-CD3GSEQIDN0:10、fCD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:12SfCD27-CD28-4-lBB-CD3GSEQIDN0:13的人T细胞在体外识别表达CD70的RCC肿瘤细胞。[0159]用空的逆转录病毒载体MSGVl或编码表9A中所示的构建体中的一种的逆转录病毒载体转导人T细胞。将转导的细胞单独培养培养基或与对照靶细胞624mel、624CD70、938mel或者转导以表达CD70的938mel细胞（938CD70或者RCC靶细胞RCC2245R、RCC2246R、RCC2361R或RCC1764细胞共培养。测量IFN-γ的分泌。结果显示于图3中。如图3所示，转导有fCD27-CD3ζSEQIDN0:7、ΔCD27-4-lBB-CD3ζSEQIDN0:9、ΔCD27-CD28-4-lBB-CD3GSEQIDN0:10、fCD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:12SfCD27-CD28-4-lBB-CD3GSEQIDNO:13的人T细胞在体外识别表达CD70的RCC肿瘤细胞。[0160]实施例9[0161]本实施例显示了产生ACD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:9逆转录病毒载体的包装克隆的选择。[0162]逆转录病毒包装细胞系PG13克隆42^1033、：143、62未转导或者用编码八〇27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:9的逆转录病毒载体转导。表10显示了通过FACS所测量的具有指示的表型的细胞的百分数。[0163]表1〇[0164][0165][0166]将转导的克隆单独培养培养基）或者与靶对照细胞938mel、938CD70、SNU1079、SNUl196或者靶RCC细胞系RCC2245R、RCC2246R、RCC2361R或RCC1764共培养。测量IFN-γ的分泌。结果显示于图4中。如图4所示，逆转录病毒包装克隆E3显示出针对表达CD70的靶肿瘤细胞系的反应性。[0167]用如表11中所示的CAR转导逆转录病毒包装细胞克隆。表11显示了通过FACS所测量的具有指示的表型的细胞的百分数。[0168]表11[0169][0170]将转导的克隆单独培养培养基）或者与靶对照细胞938mel、938CD70、SNU1079、5順1196或者靶1?0：细胞系1?0：22451?、1?0：22461?、1?0：23611?或1?0：1764共培养。测量正^丫的分泌。结果显示于图5中。如图5所示，逆转录病毒包装克隆E3显示出针对表达CD70的靶肿瘤细胞系的反应性。[0171]基于逆转录病毒包装克隆E3ACD27-4-lBB-CD3GSEQIDN0:9的转导效率和肿瘤活性，选择其用于临床用途。[0172]在此将本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用并入，其程度如同将各参考文献单独且明确指明通过引用并入，并且在本文整体示出一样。[0173]术语“一个一种a”和“一个一种an”和“所述the”以及类似的指代物在描述本发明的上下文中（特别是在下述权利要求的上下文中）的使用被解释为既涵盖单数又涵盖复数，除非本文另外指明或者上下文明显矛盾。术语“包含（comprising”，具有having”、“包括（including”以及“含有（containing”被解释为开放式术语（S卩，意为“包括但不限于”）除非另外标注。本文数值范围的叙述仅意图作为单独指落入范围内的各独立数值的速记法，除非本文另外指明，并且各独立的数值并入说明书如同本文单独对其进行叙述一样。可以以任何合适的顺序实施本文所述的所有方法，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。本文提供的任何或所有实施例或者示例性语言例如“如”）的使用仅意图更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中的语言均不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必要的。[0174]本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。经阅读前述描述，那些优选实施方案的改变对于本领域普通技术人员而言可以变得显而易见。发明人期望本领域技术人员视情况应用此类改变，并且发明人意图以与本文具体所述的不同的方式实践本发明。因此，如适用的法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中所述的主题的所有修饰和等同物。此外，本发明涵盖以上所述元素的所有可能的改变的任何组合，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。

权利要求：1.具有针对CD70的抗原特异性的嵌合抗原受体CAR，所述CAR包含：抗原结合-跨膜结构域，其含有缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部或部分的⑶27氨基酸序列，其中所述部分为SEQIDNO:2所限定的至少氨基酸残基237至260;4-1BB胞内T细胞信号转导结构域；CD3G胞内T细胞信号转导结构域；以及任选地，CD28胞内T细胞信号转导结构域。2.如权利要求1所述的CAR，其包含4-1BB胞内T细胞信号转导结构域、CD3G胞内T细胞信号转导结构域以及CD28胞内T细胞信号转导结构域。3.如权利要求1所述的CAR，其包含4-1BB胞内T细胞信号转导结构域和⑶3ζ胞内T细胞信号转导结构域。4.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述CD28胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDNO:6至少约90%相同的氨基酸序列。5.如权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述4-1BB胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDN0:5至少约90%相同的氨基酸序列。6.如权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述CD3G胞内T细胞信号转导结构域包含与SEQIDN0:4至少约90%相同的氨基酸序列。7.如权利要求1-6中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合-跨膜结构域包含缺乏CD27胞内T细胞信号转导结构域的全部的CD27氨基酸序列。8.如权利要求1-7中任一项所述的CAR，其中所述⑶27抗原结合-跨膜结构域包含与SEQIDNO:3至少约90%相同的氨基酸序列。9.如权利要求1-8中任一项所述的CAR，其包含与SEQIDN0:8-10中任一项至少约90%相同的氨基酸序列。10.具有针对CD70的抗原特异性的CAR，其包含与SEQIDNO:11-13中任一项至少约90%相同的氨基酸序列。11.如权利要求9或10所述的CAR，其包含SEQIDN0:8-13中任一项的氨基酸序列。12.核酸，其包含编码权利要求1-11中任一项所述的CAR的核苷酸序列。13.如权利要求12所述的核酸，其包含SEQIDNO:16、17、19和20中任一项的核苷酸序列。14.重组表达载体，其包含权利要求13所述的核酸。15.分离的宿主细胞，其包含权利要求14所述的重组表达载体。16.细胞群，其包含至少一种权利要求15所述的宿主细胞。17.药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的CAR、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的重组表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或者权利要求16所述的细胞群，以及药学可接受的载体。18.检测哺乳动物中癌症的存在的方法，所述方法包括：a使包含来自所述哺乳动物的一个或多个细胞的样本与权利要求1-11中任一项所述的CAR、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的重组表达载体、权利要求15所述的宿主细胞、权利要求16所述的细胞群或者权利要求17所述的药物组合物接触，从而形成复合物，以及⑹检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示所述哺乳动物中存在癌症。19.权利要求1-11中任一项所述的CAR、权利要求12或13所述的核酸、权利要求14所述的重组表达载体、权利要求15所述的宿主细胞、权利要求16所述的细胞群或者权利要求17所述的药物组合物，其用于癌症的治疗或预防。

百度查询： 美国卫生和人力服务部 抗CD70嵌合抗原受体

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