申请/专利权人：常州市第一人民医院

申请日：2019-04-08

公开（公告）日：2021-11-19

公开（公告）号：CN109917042B

主分类号：G01N30/02(20060101)

分类号：G01N30/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.11.19#授权;2019.07.16#实质审查的生效;2019.06.21#公开

摘要：本发明提供一种适用于评估房颤导管消融术后晚期复发风险的试剂盒。并且本试剂盒为用于测定血浆TMAO含量的试剂盒，通过对患者血浆中TMAO测定，可有效的评估房颤患者导管消融术后的复发风险，便于医生能在术前评估患者导管消融术后晚期复发风险，进而指定针对性治疗方案，为患者提供及时有效的治疗。

主权项：1.TMAO在制备房颤导管消融术后复发的评估试剂盒中的应用，其特征在于所述试剂盒包括以下组分：乙腈、乙酸铵、TMAO标准品、d9-TMAO；所述乙腈和乙酸铵的规格是色谱纯；所述TMAO标准品的纯度是≥99%；所述d9-TMAO的纯度是≥98%。

全文数据：一种试剂盒技术领域本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种试剂盒。背景技术房颤为临床上最常见的心律失常之一，其发病率及患病率随年龄增长而逐步增加。房颤引发的脑卒中、心力衰竭、心脏骤停等可严重增加致死率、致残率，带来沉重的医疗负担。治疗房颤的治疗手段有很多种，导管消融便是其中重要的一种。然而房颤导管消融术后的晚期复发率达25%-40%，因此在术前评估房颤导管消融术后复发风险并指定针对性治疗方案具有重要意义。房颤的病理生理学机制尚未完全阐释清楚，现在一般认为房颤是由始动的触发因素及维持基质相互作用产生的。在自主神经刺激、缺血等情况下，心大静脉（包括肺静脉、腔静脉等）肌袖内的异常自律性细胞可自发产生快速电活动，此类异常电活动即为房颤的始动触发因素。始动触发的异常电活动传播至心房肌引发多个折返子波，从而导致房颤的形成。房颤一旦触发形成便可自我维持，而这维持即依赖于心房的电重构与结构重构。电重构的基础为在房颤、心房牵张等情况下心房肌细胞基因表达可发生变化，进而引起细胞表面离子通道发生改变。心肌细胞表面离子通道的变化进而引起跨膜离子流的变化，如L型钙通道离子流、瞬时外向钾通道电流、延迟整流钾电流的减小，内向整流钾通道及ATP敏感钾通道电流的增大，最终引起心房肌细胞的有效不应期缩短、不均一性增加、频率适应性不良。房颤的持续发生同样会导致心房的结构重构。房颤引发的结构重构包括缝隙连接重构、细胞重构。缝隙连接重构表现为连接蛋白的表达及分布分异质性；细胞重构是由心肌细胞凋亡、肌溶解及心肌间质纤维增生引发的心房纤维化。心房肌细胞超微结构的改变、心肌纤维化、连接蛋白的重分布使激动传到减慢、路径曲折，最终促进房颤的发生和维持。研究发现房颤自身可引发心房电重构及结构重构，进而表现为“房颤至房颤”效应，且房颤的发作可严重增加致死率、致残率，因此恢复房颤患者的窦性节律意义重大。其中，导管消融使恢复房颤患者窦性心律的重要手段之一。在阵发性房颤患者的电生理检查中标测到90%以上的触发灶均位于肺静脉内部，因此肺静脉电隔离是目前房颤消融最基础、最常用术式。然而，术后早期（3月内）复发率达50%以上，庆幸的是早期复发的房颤在术后3内可自行消失，因此现阶段以消融3个月后作为评价消融非晚期复发与否的判断时间基准。术后晚期（12月内）复发率达25%-40%，且研究显示术消融1年后首次复发的概率极少，因此现阶段术后一年是最常用于评测房颤导管消融术后复发的时间。研究显示术后晚期复发与心房重构的程度具有相关性，且电生理检查中标测显示导管术后晚期复发的机制为肺静脉隔离的再通、肺静脉外触发灶的触发，而既往研究表明TMAO能够通过激活TGFβ–P-SMAD3信号通路进而促进心肌纤维化，通过激活NF-κB信号通路增使心肌细胞有效不应期缩短，因此我们有理由相信，TMAO可能在房颤管消融术后晚期复发中发挥作用。随着对房颤发病机制的不断认识，房颤相关的危害及恢复房颤患者窦性心律逐步受到重视，且目前仍然没有评估房颤导管消融术后晚期复发风险的敏感、特异的生物标志物，因此急需要我们医药界专家学者共同研究一种评估房颤导管消融术后晚期复发敏感性易测、特异性高的方法，用以术前尽早评估术后复发风险，使医师针对患者进行个体化治疗（如在环肺静脉隔离基础上复合术式治疗等）。发明内容本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于房颤导管消融术后复发的评估的试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种试剂盒，包括以下组分：乙腈（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）、TMAO标准品（纯度≥99%）、氘代氧化三甲胺d9-TMAO（纯度≥98%）；其该试剂盒用于检测TMAO的高效液相色谱串联质谱的试剂盒。而该试剂盒用于房颤导管消融术后复发的评估。本发明的发明人通过对房颤患者发病前期到导管消融术后做了深入的研究，实验发现了一种适用于评估房颤导管消融术后晚期复发风险的试剂盒。并且本试剂盒为用于测定血浆TMAO含量的试剂盒，通过对患者血浆中TMAO测定，可有效的评估房颤患者导管消融术后的复发风险，便于医生能在术前评估患者导管消融术后晚期复发风险，进而指定针对性治疗方案，为患者提供及时有效的治疗。本发明中所述的导管消融术后晚期复发的评估试剂盒为通过对患者血浆中TMAO的测定来评估患者术后复发风险。TMAO是由肠道微生物分解食物中的胆碱、卵磷脂及左旋肉碱产生三甲胺，继而经肝门静脉系统吸收入肝经黄素单氧化酶氧化而成。TMAO入血后能够使心血管系统产生多种病理生理改变，如通过激活TGFβ-P-SMAD3信号通路进而促进心肌纤维化；通过激活NF-κB信号通路增加心脏神经节层的炎症因子表达进而使神经节功能及活性增加、有效不应期缩短。本发明人经实验研究发现，通过高效液相色谱串联质谱发测定房颤患者的血浆TMAO的表达，发现血浆TMAO在导管消融术后复发的房颤患者中较导管消融术后非晚期复发组含量明显升高，差距具有统计学意义（预期，P6.18umolL。本研究术后复发组与上述3级水平相似，手术成功组与上述1-2级水平相似，对照组与上述1级水平相似。表1：3组血浆TMAO、TGF-β及LATmsv-SD比较分组对照组非晚期复发组n=41术后复发组n=19血浆TMAOμmolL2.10±0.122.14±0.494.22±0.18*TGF-βngmL24.62±6.11*27.33±9.8134.63±11.98*LATmsv-SD8.1±3.63*12.0±4.8315.5±5.57*注：LATmsv-SD：左房非同步指数。*与非晚期复发组比较P0.05。为进一步评估TMAO对房颤导管消融术后晚期复发的预测价值，以房颤导管消融术后晚期复发为诊断标准，通过计算不同TMAO水平下的灵敏度、特异度指标，绘制ROC曲线，获得TMAO对房颤导管消融术后晚期复发的的ROC曲线下面积为0.875，显示TMAO对房颤导管消融术后晚期复发具有中高度预测价值，见图5。三、结论本发明的发明人经研究发现，血浆TMAO在房颤导管消融术后复发组较非晚期复发组及对照组血浆TMAO含量高，说明在术后复发的房颤中血浆TMAO的含量高有临床研究价值，房颤导管消融术后复发情况与血浆TMAO关系密切。此外，本研究还发现，术后复发患者的血浆TGF-β、左房非同步指数明显高于非晚期复发组，且血浆TMAO与血浆TGF-β、左房同步化指数成正相关，这表明TMAO很可能通过TGFβ–P-SMAD3信号通路进而促进心肌纤维化，进而导致左房非同步化活动，引发房颤导管消融术后晚期复发。本研究通过ROC曲线分析同时发现TMAO对房颤导管消融术后晚期复发具有中高度预测价值。所以血浆TMAO可以作为房颤导管消融术后晚期复发的敏感评估指标。检测血浆TMAO可用于房颤患者术前评估以制定个体化治疗方案。实施例2：实施例1中的具体案例患者一一、临床资料患者，男，53岁，因“心悸半年余”入院，诊断：心房颤动（阵发性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，未发现左房低电压区。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，未见房颤复发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为2.2μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为2.2μmolL（假设），与实施例1中的血浆TMAO1级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率低。患者术后进行了为期1年的定期复查，未有房颤复发。因此，该患者术前低水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险低与预期一致。患者二一、临床资料患者，女，67岁，因“反复心前区不适1月余”入院，诊断：心房颤动（阵发性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，见左房后壁片状低电压区，并行局部基质改良将低电压区隔离。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，于术后9月复查发现房颤再发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为4.19μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为4.19μmolL，与实施例1中的血浆TMAO3级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率高。患者术后进行了为期1年的定期复查，于术后9月复查发现有房颤复发。因此，该患者术前较高水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险高与预期一致。患者三一、临床资料患者，男，63岁，因“反复心悸1年”入院，诊断：心房颤动（持续性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，见左房顶壁片状低电压区及碎裂电位，并行局部基质改良将低电压区隔离。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，术后未见房颤再发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为3.17μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为3.17μmolL，与实施例1中的血浆TMAO2级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率较低。患者术后进行了为期1年的定期复查，术后无房颤复发。因此，该患者术前较低水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险低与预期一致。患者四一、临床资料患者，男，64岁，因“心悸1年”入院，诊断：心房颤动（持续性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，未见低电压区。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，与术后6月发现房颤再发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为4.32μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为4.32μmolL（假设），与实施例1中的血浆TMAO3级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率高。患者术后进行了为期1年的定期复查，术后6月发现房颤复发。因此，该患者术前高水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险高与预期一致。患者五一、临床资料患者，女，59岁，因“发作性心悸4年”入院，诊断：心房颤动（阵发性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，未见低电压区。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，未发现房颤再发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为1.89μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为1.89μmolL，与实施例1中的血浆TMAO1级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率低。患者术后进行了为期1年的定期复查，术后6月发现房颤复发。因此，该患者术前低水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险低与预期一致。患者六一、临床资料患者，男，47岁，因“阵发性心悸5年”入院，诊断：心房颤动（阵发性），行环肺静脉隔离术，术中基质标测，未见低电压区。术后恢复窦性节律。分别于术后3月、6月、9月、12月复查，术后12月复查时发现房颤复发。二、血浆TMAO的测定：TMAO高效液相色谱串联质谱试剂盒测定方法：（1）采集患者术前空腹静脉血3ml，置于EDTA抗凝剂真空管，4℃3500r离心l0min，分离出血浆，置-80℃冰箱保存。（2）取出试剂盒配置标准品：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用。除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用。（3）配置标准曲线：将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min。取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）取出患者血标本，置于室温解冻。取20μL血浆样本，加入80μL除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min。取上清转移至进样瓶，准备上机检测。（5）调节色谱条件：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈。采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃。（6）调节质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325℃，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV。（7）检测TMAO：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到患者血浆样本TMAO浓度。结果如图3所示结果，利用此试剂盒测量出该房颤患者术前空腹血浆TMAO含量为4.33μmolL。三、结论患者术前血浆TMAO含量为4.33μmolL，与实施例1中的血浆TMAO3级水平相似，预测患者导管消融术后的晚期复发率高。患者术后进行了为期1年的定期复查，术后12月发现房颤复发。因此，该患者术前高水平的血浆TMAO评估术后晚期复发风险高与预期一致。综上所述，本发明所提出的试剂盒，其对于用于房颤导管消融术后复发有着积极的意义。

权利要求：1.一种试剂盒，其特征在于包括以下组分：乙腈（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）、TMAO标准品（纯度≥99%）、氘代氧化三甲胺d9-TMAO（纯度≥98%）。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测TMAO的高效液相色谱串联质谱的试剂盒。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于房颤导管消融术后复发的评估。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中用于房颤导管消融术后复发的评估的试剂盒使用方法为：A、标准品的配置：母液：超纯水配置1mgml的标准TMAO储备液，-20℃冰箱储存备用，除蛋白液：超纯水配置0.7mgml的d9-TMAO内标准溶液，并用乙腈稀释500倍，-20℃冰箱储存备用；B、标准曲线的配置：检测前将TMAO母液逐级稀释，配置成不同浓度的标准溶液（50、125、250、500、1250、2500、5000ngmL），加入A中的除蛋白液，漩涡震荡1min，在4℃，13000rpm离心15min，取上清液进样检测，绘制以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线；C、血浆样本的处理：取20μL血浆样本，加入80μL上述A中的除蛋白液放入离心管中，震荡1min充分混合均匀，4℃，13000rpm离心15min，取上清转移至进样瓶，准备上机检测；D、色谱条件的调节：使用1502.1mm，1.7μm的亲水色谱柱；流动相A：水5mmol乙酸铵；流动相B：乙腈，采用梯度程序洗脱，梯度条件：0-5min，50%A；5-10min，50%A-80%，10-15min，80%A，运行总时间15min；流速：0.3mLmin；进样量：3μL；柱温：30℃；E、质谱条件的调节：离子源：电喷雾离子源ESI，正离子模式；高纯氮气纯度99.999%作为干燥气，干燥气温度325C，干燥气流速10Lmin；扫描方式：多反应监测模式MRM，定量离子对：TMAOmz76→58，d9-TMAOmz85→66；定性离子：TMAOmz42，d9-TMAOmz46；碰撞能量：TMAO20eV，d9-TMAO25eV；F、TMAO检测：以d9-TMAO作为同位素内标进行定量，通过流动A、B相，得到质谱图，峰面积经计算机转化为色谱数据得到待测血浆样本TMAO浓度。

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