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【发明授权】抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)抗体及其用途_百时美施贵宝公司_201680079209.9 

申请/专利权人:百时美施贵宝公司

申请日:2016-11-17

公开(公告)日:2022-06-21

公开(公告)号:CN108738324B

主分类号:C07K16/28

分类号:C07K16/28;A61K39/00

优先权:["20151119 US 62/257,599","20160304 US 62/303,990"]

专利状态码:有效-授权

法律状态:2022.06.21#授权;2018.12.11#实质审查的生效;2018.11.02#公开

摘要:本申请提供了与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合的抗体或其抗原结合部分。还提供了这些蛋白质在治疗应用中的用途,比如在治疗癌症中的用途。进一步提供了产生抗体的细胞、编码所述抗体的重链和或轻链可变区的多核苷酸、以及包含编码所述抗体的重链和或轻链可变区的多核苷酸的载体。

主权项:1.一种分离的抗体,其与人糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并包含重链恒定区,所述重链恒定区由氨基酸序列SEQIDNO:394,或与氨基酸序列SEQIDNO:394有一个氨基酸的取代、添加或缺失而不同的重链恒定区组成,其中所述一个氨基酸的取代、添加或缺失不是在SEQIDNO:394的氨基酸位置16、20、21、75、76、82、86、97、100、102、104和105处,其中所述抗体包含分别由SEQIDNO:20、21和22组成的重链CDR1、CDR2和CDR3序列和分别由SEQIDNO:23、24和25组成的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。

全文数据:抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体GITR抗体及其用途[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求分别于2015年11月19日和2016年3月4日提交的美国临时申请No.62257,599和62303,990的优先权。将上述申请的内容通过提述并入本文。[0003]序列表[0004]本申请包括已经以电子方式以ASCII格式提交的序列表,,其通过提述完整并入本申请中。该ASCIIgU本创建于2017年11月17日,命名为2016-11-15_MXI-547PC_ST25.txt,大小为1,〇11,555个字节。[0005]背景[0006]糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR是一种共刺激分子,又称TNFRSF18、AITR、⑶357和GITR-D,是TNF受体家族的成员,其最初在用地塞米松处理的鼠T细胞系中被鉴定出Nocentini等人,PNAS1997;94:6216-21JNF受体家族的其他相关成员包括CD40、CD27、4-IBB和0X40。虽然幼稚⑶4+和⑶8+细胞中GITR表达低,但GITR在调节性T细胞中呈组成性表达Tone等人,PNAS2003;100:15059-64。然而,一旦GITR的表达在效应T细胞上被诱导,GITR衔接作用可促进效应T细胞的活化、增殖和细胞因子产生Watts,AnnualReviewsinImmunology2005;23:23-68。关于CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs,Shimizu报道,利用混合培养抑制测定法,GITR衔接抑制了它们的功能Shimizu等人,NatureImmunology2002;3:135-42。然而,Stephans等人JI200415;1738:5008-20的后续工作确定,GITR在效应TTeff细胞上的衔接使所述效应T细胞对Treg抑制较不敏感,从而解释了在Treg-Teff细胞共培养中所观察到的抑制减少。DTA-I大鼠抗小鼠GITR抗体介导的GITR刺激在多种肿瘤模型中促进了抗肿瘤免疫。[0007]GITR-LGITR的配体在抗原呈递细胞例如,B细胞、树突细胞)中以低水平表达,但是在例如通过病毒感染激活后,其在这些细胞中瞬时上调(Suvas等人,JVirol.2005;79:11935-42。[0008]由于面临着改进针对癌症等疾病的策略的需要、人们非常希望从增强的免疫应答特别是T细胞应答,调节GITR活性的新型药剂和方法获益。[0009]概述[0010]本申请提供了分离的抗体,例如单克隆抗体,特别是人单克隆抗体,其特异性结合GITR并且具有期望的功能性质。这些特性包括与人GITR的高亲和力结合、与猴GITR例如,食蟹猴GITR的结合以及刺激抗原特异性T细胞应答的能力。本文所述的抗体可用于刺激抗原特异性T细胞应答,例如在带有肿瘤或带有病毒病毒感染的受试者中刺激抗原特异性T细胞应答,并可用于检测样品中的GITR蛋白。[0011]在一个方面,本申请提供了分离的抗体或其抗原结合部分,其与GITR结合并包含重链恒定区,所述重链恒定区包含(1选自SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列,或(2与氨基酸序列SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543中这样的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。在某些实施方案中,抗体展现以下性质中的至少一项:[0012]a与可溶性人GITR结合;[0013]⑹与膜结合的人GITR结合;[0014]c与膜结合的食蟹猴GITR结合;[0015]d诱导或增强T细胞活化,例如,抗原特异性T细胞活化;[0016]e抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR结合;[0017]f至多部分地抑制GITR配体与活化的T细胞上的GITR结合;[0018]g与成熟人GITRSEQIDN0:4上的构象表位结合;[0019]⑹与0-连接的和N-糖基化的及未糖基化的人GITR结合;[0020]i在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性,但其中与Fc受体的结合进一步增强该激动剂活性;及[0021]j在任一方向或两个方向上与抗体28F3、3C3-l、3C3-2、2G6、8A6、9G7-l、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中的一者或多者竞争结合人GITR。[0022]在某些实施方案中,本文所述抗GITR抗体或其抗原结合部分刺激抗肿瘤免疫应答,例如,抗原特异性T细胞应答。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分增加表达GITR的T细胞中的细胞因子例如,IL-2和或IFN-γ产生和或增加T细胞增殖。[0023]在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分不与Fc受体结合。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分结合一种或多种FcγR,例如活化或抑制性FcγR。[0024]在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分以如通过Biacore测量的IOnM或更小的Kd与可溶性人GITR结合,以如通过Scatchard测量的InM或更小的Kd与膜结合的人GITR结合,以如通过FACS测量的InM或更小的EC5q与膜结合的人GITR结合,以如通过FACS测量的IOnM或更小的EC5q与膜结合的食蟹猴GITR结合,诱导或增强T细胞例如Teff细胞活化而无需多价交联,以如通过FACS测量的lygmL或更小的EC5q抑制GITR配体与GITR结合,和或在成熟人GITRSEQIDN0:4的区域PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDN0:217和CRDYPGEESEQIDNO:218内结合。[0025]本申请提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与GITR特异性地结合,并且包含选自下列的可变重链和可变轻链对中的三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR:[0026]aSEQIDNO:13和14;[0027]⑹SEQIDNO:26和27;[0028]cSEQIDNO:39和40;[0029]dSEQIDNO:52和53;[0030]eSEQIDNO:52和54;[0031]fSEQIDNO:71和72;[0032]gSEQIDNO:84和85;[0033]⑹SEQIDNO:97和98;[0034]⑴SEQIDNO:97和99;[0035]jSEQIDNO:115和116;[0036]⑹SEQIDNO:128和129;[0037]ISEQIDNO:128和130;以及[0038]mSEQIDNO:335和336;并且[0039]包含重链恒定区,所述重链恒定区包含(1选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543或(2与氨基酸序列SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543中这样的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。[0040]本申请提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与GITR结合并且包含:[0041]a分别包含SEQIDN0:20、21和22的重链CDRUCDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID从:23、24和25的轻链001?1、01?2和01?3序列;[0042]⑹分别包含SEQIDN0:33、34和35的重链⑶R1、CDR2和⑶R3序列,和或分别包含SEQIDN0:36、37和38的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;或(c分别包含SEQIDN0:46、47和48的重链CDRUCDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID冊:49、50和51的轻链01?1工01?2和CDR3序列;[0043]⑹分别包含SEQIDN0:62、63和64的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDN0:65、66和67的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列;[0044]e分别包含SEQIDN0:62、63和64的重链⑶R1、CDR2和⑶R3序列,和或分别包含SEQIDN0:68、69和70的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;[0045]f分别包含SEQIDN0:78、79和80的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID从:81、82和83的轻链001?1、01?2和01?3序列;[0046]g分别包含SEQIDN0:91、92和93的重链CDRUCDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID从:94、95和96的轻链01?1、01?2和01?3序列;[0047]⑹分别包含SEQID冊:106、107和108的重链01?1、001?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDN0:109、110和111的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;[0048]⑴分别包含SEQID冊:106、107和108的重链01?1、001?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDN0:112、113和114的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;[0049]j分别包含SEQID冊:122、123和124的重链0«1、001?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDN0:125、126和127的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;[0050]⑹分别包含SEQID冊:138、139和140的重链0«1、001?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDNO:141、142和143的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;[0051]1分别包含SEQID冊:138、139和140的重链0«1、001?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDNO:144、145和146的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;或[0052]m分别包含SEQIDN0:342、343和344的重链CDRUCDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:345、346和347的轻链⑶Rl、OTR2和⑶R3序列,并且包含这样的重链恒定区,所述重链恒定区包含⑴选自下组的氨基酸序列:SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543或⑵与氨基酸序列SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543中这样的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。[0053]本申请提供了与GITR结合并且包含重链和轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列:SEQIDN0:13、26、39、52、71、84、97、115、128和335〇[0054]本申请提供了与GITR结合并且包含重链和轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列:SEQIDN0:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130和336。[0055]本申请提供了与GITR结合并且包含重链和轻链可变区序列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,所述重链和轻链可变区序列与选自下组的氨基酸序列至少85%相同,例如90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同:[0056]a分别为SEQIDNO:13和14;[0057]⑹分别为SEQIDNO:26和27;[0058]c分别为SEQIDNO:39和40;[0059]d分别为SEQIDNO:52和53;[0060]e分别为SEQIDNO:52和54;[0061]f分别为SEQIDNO:71和72;[0062]g分别为SEQIDNO:84和85;[0063]⑹分别为SEQIDNO:97和98;[0064]⑴分别为SEQIDNO:97和99;[0065]j分别为SEQIDNO:Il5和Il6;[0066]⑹分别为SEQIDNO:128和129;[0067]1分别为SEQIDNO:128和130;以及[0068]m分别为SEQIDNO:335和336。[0069]本申请提供了与GITR结合并且包含重链和轻链序列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,所述重链和轻链序列与选自下组的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同:[0070]a分别为SEQIDNO:15和16;[0071]⑹分别为SEQIDNO:17和19;[0072]c分别为SEQIDNO:I8和I9;[0073]d分别为SEQIDNO:28和29;[0074]e分别为SEQIDNO:30和32;[0075]f分别为SEQIDNO:31和32;[0076]g分别为SEQIDNO:41和42;[0077]⑹分别为SEQIDNO:43和45;[0078]⑴分别为SEQIDNO:44和45;[0079]j分别为SEQIDNO:55和56;[0080]⑹分别为SEQIDNO:55和57;[0081]1分别为SEQIDNO:58和60;[0082]m分别为SEQIDNO:59和60;[0083]η分别为SEQIDNO:58和61;[0084]⑹分别为SEQIDNO:59和61;[0085]p分别为SEQIDNO:73和74;[0086]q分别为SEQIDNO:75和77;[0087]r分别为SEQIDNO:76和77;[0088]s分别为SEQIDNO:86和87;[0089]⑴分别为SEQIDNO:88和9〇;[0090]u分别为SEQIDNO:89和90;[0091]V分别为SEQIDNO:102和104;[0092]w分别为SEQIDNO:103和104;[0093]X分别为SEQIDNO:100和101;[0094]y分别为SEQIDNO:100和371;[0095]z分别为SEQIDNO:1〇2和1〇5;[0096]za分别为SEQIDNO:103和105;[0097]zb分别为SEQIDNO:117和118;[0098]zc分别为SEQIDNO:119和121;[0099]zd分别为SEQIDNO:120和121;[0100]ze分别为SEQIDNO:131和132;[0101]zf分别为SEQIDNO:134和136;[0102]zg分别为SEQIDNO:135和136;[0103]zh分别为SEQIDNO:131和133;[0104]zi分别为SEQIDNO:134和137;[0105]zj分别为SEQIDNO:135和137;[0106]zk分别为SEQIDNO:337和338;[0107]zl分别为SEQIDNO:339和341;以及[0108]zm分别为SEQIDNO:340和341。[0109]在某些实施方案中,分离的单克隆抗体或其抗原结合部分(a与28F3、19D3、18E10、3C3-l、3C3-2、2G6、9G7-l、9G7-2、14E3、19H8-l、19H8-2和或6G10结合GITR上的相同表位,并且⑹将28F3、19D3、18E10、3C3-l、3C3-2、2G6、9G7-l、9G7-2、14E3、19H8-l、19H8-2、和或6G10与活化T细胞上的GITR的结合抑制至少50%、60%、70%、80%或90%,如通过例如FACS所测量的。[0110]在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分在成熟人GITRSEQIDNO:4的区域PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDN0:217和CRDYPGEESEQIDN0:218内结合。在一些实施方案中,本文所述的抗GITR抗体或其抗原结合部分与人GITR和食蟹猴GITR两者都结合。[0111]在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分为IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其变体。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分包含无效应子的effectorlessIgGlFc,例如具有以下突变的无效应子IgGlFc:L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分包含这样的Fe:其与活化性FeγR结合,或具有增强的(例如相对于野生型IgGlFc与活化性FeγR的结合。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分的CDR区中的甲硫氨酸残基被不受氧化的氨基酸残基取代。在某些实施方案中,抗GITR抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。[0112]本申请提供了与GITR结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含修饰的重链恒定区,所述修饰的重链恒定区包含IgG2铰链和非IgG2同种型的CHl、CH2和CH3中的至少一者,其中所述抗GITR抗体相对于相同但具有非IgG2铰链的抗GITR抗体具有增强的激动剂活性。[0113]在某些实施方案中,修饰的重链恒定区包括:包含选自SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列的重链恒定区,或与SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区。[0114]在某些实施方案中,重链包括:选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361和362,或与氨基酸序列SEQIDN0:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361和362有至多10个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链。[0115]在某些实施方案中,轻链包括:选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341和371,或与氨基酸序列SEQIDN0:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341和371有至多10个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链。[0116]本申请提供了双特异性分子,其包含抗GITR抗体及与之连接的具有第二结合特异性的分子。[0117]本申请提供了编码抗GITR抗体或其抗原结合部分的重链和或轻链可变区的核酸、包含核酸分子的表达载体以及用所述表达载体转化的细胞。[0118]本申请提供了免疫缀合物,其包含本文所述的抗GITR抗体以及与之连接的药剂。[0119]本申请提供了包含抗GITR抗体或其抗原结合部分和载体的组合物。本文还提供了包含抗GITR抗体或其抗原结合部分及使用说明书的试剂盒。[0120]本申请提供了制备抗GITR抗体的方法,其包括使抗GITR抗体在细胞中表达并从所述细胞中分离所述抗体。[0121]本申请提供了刺激抗原特异性T细胞应答的方法,其包括使T细胞与抗GITR抗体或其抗原结合部分接触,从而刺激抗原特异性T细胞应答。[0122]本申请提供了活化或共刺激T细胞(例如,效应T细胞)的方法,其包括使细胞(例如,效应T细胞与抗GITR抗体或其抗原结合部分和CD3接触,其中效应T细胞被活化或共刺激。[0123]本申请提供了增加T细胞中IL-2和或IFN-γ产生和或T细胞增殖的方法,其包括使T细胞与有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分接触。[0124]本申请提供了增加受试者中T细胞中a-2和或IFN-γ产生的方法,其包括施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、包含抗GITR抗体的双特异性分子或缀合物、或包含抗GITR抗体的组合物,以增加T细胞的IL-2和或IFN-γ产生。[0125]本申请提供了减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中的调节T性细胞的数目的方法,其包括施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或缀合物,以减少肿瘤中的调节T性细胞的数目,其中抗体或其抗原结合部分具有效应子功能或增强的效应子功能。[0126]本申请提供了刺激受试者中的免疫应答的方法,其包括向受试者施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或缀合物,使得受试者中的免疫应答被刺激。在一些实施方案中,受试者患有肿瘤并且针对肿瘤的免疫应答被刺激。[0127]本申请提供了抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法,其包括向受试者施用抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或缀合物,使得受试者中的肿瘤生长被抑制。[0128]本申请提供了治疗癌症,例如通过免疫疗法治疗癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、包含抗GITR抗体的双特异性分子或缀合物、或包含抗GITR抗体的组合物,以治疗癌症。在某些实施方案中,癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。在某些实施方案中,癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。[0129]在某些实施方案中,本文所述的方法进一步包括与抗GITR抗体例如,抗PDl抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体和或I3D-Ll抗体一起施用一或多种另外的治疗剂。[0130]本申请提供了检测样品中GITR的存在的方法,其包括在容许在抗体或其抗原结合部分与GITR之间形成复合物的条件下使样品与抗GITR抗体或其抗原结合部分接触,并检测复合物的形成。[0131]本申请提供了本文所述的抗GITR抗体用于治疗癌症、刺激受试者中的免疫应答、刺激抗原特异性T细胞应答、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的IL-2和或IFN-γ产生和或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中的调节性T细胞的数目和或抑制肿瘤细胞生长的用途。本文中还提供了本文所述的抗GITR抗体用于制备用于刺激受试者中的免疫应答、刺激抗原特异性T细胞应答、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的IL-2和或IFN-γ产生和或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中的调节性T细胞的数目和或抑制肿瘤细胞生长的药剂的用途。[0132]本公开的其他特征和优点在下面的详细说明和实施例的基础上是不言自明的,这些详细说明和实施例不应解释为限制本发明。[0133]附图简述[0134]图1显示了单克隆抗体28F3分别为SEQIDN0:13和14、18E10分别为SEQIDΝ0:39和40和19D3分别为SEQIDΝ0:26和27的重链和轻链可变区的氨基酸序列。28F3的VH和VLCDR加下划线。[0135]图2Α显示了28F3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:147和氨基酸序列(SEQIDN0:13。描绘了CDR1SEQIDN0:20、CDR2SEQIDN0:21和CDR3SEQIDN0:22区并且指示了V、D和J种系来源。[0136]图2B显示了28F3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:148和氨基酸序列(SEQIDN0:14。描绘了CDR1SEQIDN0:23、CDR2SEQIDN0:24和CDR3SEQIDN0:25区并且指示了V和J种系来源。[0137]图3A显示了18E10人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:158和氨基酸序列(SEQIDN0:39。描绘了CDR1SEQIDN0:46、CDR2SEQIDN0:47和CDR3SEQIDN0:48区并且指示了V、D和J种系来源。[0138]图3B显示了18E10人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:159和氨基酸序列(SEQIDN0:40。描绘了CDR1SEQIDN0:49、CDR2SEQIDN0:50和CDR3SEQIDN0:51区并且指示了V和J种系来源。[0139]图4A显示了19D3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:154和氨基酸序列(SEQIDN0:26。描绘了CDR1SEQIDN0:33、CDR2SEQIDN0:34和CDR3SEQIDNO:35区并且指示了V、D和J种系来源。[0140]图4B显示了19D3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:155和氨基酸序列(SEQIDN0:27。描绘了CDR1SEQIDN0:36、CDR2SEQIDN0:37和CDR3SEQIDN0:38区并且指示了V和J种系来源。[0141]图5A显示了3C3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:162和氨基酸序列(SEQIDN0:52。描绘了CDR1SEQIDN0:62、CDR2SEQIDN0:63和CDR3SEQIDNO:64区并且指示了V、D和J种系来源。[0142]图5B显示了3C3人单克隆抗体的κ轻链可变区(VKl的核苷酸序列(SEQIDNO:163和氨基酸序列(SEQIDN0:53。描绘了CDR1SEQIDN0:65、CDR2SEQIDN0:66和⑶R3SEQIDN0:67区并且指示了V和J种系来源。[0143]图5C显示了3C3人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2的核苷酸序列(SEQIDNO:164和氨基酸序列(SEQIDN0:54。描绘了CDR1SEQIDN0:68、CDR2SEQIDN0:69和⑶R3SEQIDN0:70区并且指示了V和J种系来源。[0144]图6A显示了2G6人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:168和氨基酸序列(SEQIDN0:71。描绘了CDR1SEQIDN0:78、CDR2SEQIDN0:79和CDR3SEQIDNO:80区并且指示了V、D和J种系来源。[0145]图6B显示了2G6人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:169和氨基酸序列(SEQIDN0:72。描绘了CDR1SEQIDN0:81、CDR2SEQIDN0:82和CDR3SEQIDN0:83区并且指示了V和J种系来源。[0146]图7A显示了8A6人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:172和氨基酸序列(SEQIDN0:84。描绘了CDR1SEQIDN0:91、CDR2SEQIDN0:92和CDR3SEQIDNO:93区并且指示了V、D和J种系来源。[0147]图7B显示了8A6人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:173和氨基酸序列(SEQIDN0:85。描绘了CDR1SEQIDN0:94、CDR2SEQIDN0:95和CDR3SEQIDNO:96区并且指示了V和J种系来源。[0148]图8A显示了9G7人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:176和氨基酸序列(SEQIDN0:97。描绘了CDR1SEQIDN0:106、CDR2SEQIDN0:107和CDR3SEQIDN0:108区并且指示了V、D和J种系来源。[0149]图8B显示了9G7人单克隆抗体的κ轻链可变区(VKl的核苷酸序列(SEQIDNO:177和氨基酸序列(SEQIDN0:98。描绘了CDR1SEQIDN0:109、CDR2SEQIDN0:110和⑶R3SEQIDNO:111区并且指示了V和J种系来源。[0150]图8C显示了9G7人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2的核苷酸序列(SEQIDNO:178和氨基酸序列(SEQIDNO:99。描绘了CDRlSEQIDNO:112、CDR2SEQIDNO:113和⑶R3SEQIDNO:114区并且指示了V和J种系来源。[0151]图9A显示了14E3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:182和氨基酸序列(SEQIDN0:115。描绘了CDR1SEQIDN0:122、CDR2SEQIDN0:123和CDR3SEQIDN0:124区并且指示了V、D和J种系来源。[0152]图9B显示了14E3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:183和氨基酸序列(SEQIDN0:116。描绘了CDR1SEQIDN0:125、CDR2SEQIDN0:126和CDR3SEQIDN0:127区并且指示了V和J种系来源。[0153]图10A显示了19H8人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDNO:186和氨基酸序列(SEQIDN0:128。描绘了CDR1SEQIDN0:138、CDR2SEQIDN0:139和CDR3SEQIDN0:140区并且指示了V、D和J种系来源。[0154]图10B显示了19H8人单克隆抗体的κ轻链可变区(VKl的核苷酸序列(SEQIDNO:187和氨基酸序列(SEQIDN0:129。描绘了CDR1SEQIDN0:141、CDR2SEQIDN0:142和⑶R3SEQIDN0:143区并且指示了V和J种系来源。[0155]图10C显示了19H8人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2的核苷酸序列(SEQIDNO:188和氨基酸序列(SEQIDN0:130。描绘了CDR1SEQIDN0:144、CDR2SEQIDN0:145和⑶R3SEQIDN0:146区并且指示了V和J种系来源。[0156]图IlA显示了6G10人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQIDN0:353和氨基酸序列(SEQIDN0:335。描绘了CDR1SEQIDN0:342、CDR2SEQIDN0:343和CDR3SEQIDN0:344区并且指示了V、D和J种系来源。[0157]图IlB显示了6G10人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQIDN0:354和氨基酸序列(SEQIDN0:336。描绘了CDR1SEQIDN0:345、CDR2SEQIDN0:346和CDR3SEQIDN0:347区并且指示了V和J种系来源。[0158]图12显示了28F3的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:13与人种系Vh3-33、3-10和JH6氨基酸序列分别为SEQIDN0:192、193和196的比对。[0159]图13显示了28F3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:14与人种系VkL18和JK2氨基酸序列分别为SEQIDN0:204和205的比对。[0160]图14显示了18E10的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:39与人种系Vh3-33、6-19和JH6氨基酸序列(分别为SEQIDN0:192、199和197的比对。[0161]图15显示了18E10的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:40与人种系VkL15和JK2氨基酸序列(分别为SEQIDN0:207和205的比对。[0162]图16显示了19D3的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:26与人种系VH3-33、3-16和JH6氨基酸序列分别为SEQIDN0:192、200和198的比对。[0163]图17显示了19D3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:27与人种系VkL15和JK2氨基酸序列(分别为SEQIDN0:207和205的比对。[0164]图18显示了3C3的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:52与人种系VH4-34和JH3氨基酸序列(分别为SEQIDN0:201和202的比对。[0165]图19A显示了3C3的轻链可变区(VKl的氨基酸序列(SEQIDNO:53与人种系VkL15和JK2氨基酸序列分别为SEQIDN0:207和205的比对。[0166]图19B显示了3C3的轻链可变区(VK2的氨基酸序列(SEQIDN0:54与人种系VkL20和JK2氨基酸序列分别为SEQIDN0:208和206的比对。[0167]图20显示了2G6的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:71与人种系VH3-33和JH6氨基酸序列分别为SEQIDNO:192和197的比对。[0168]图21显示了2G6的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:72与人种系VkL15和JK2氨基酸序列(分别为SEQIDN0:207和205的比对。[0169]图22显示了8A6的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:84与人种系VH3-33、3_10和JH6氨基酸序列分别为SEQIDN0:192、193和197的比对。[0170]图23显示了8A6的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:85与人种系VkL18和JK2氨基酸序列分别为SEQIDN0:204和205的比对。[0171]图24显示了9G7的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:97与人种系VH3-15、3-10和JH6氨基酸序列(分别为SEQIDN0:203、194和198的比对。[0172]图25A显示了9G7的轻链可变区(VKl的氨基酸序列(SEQIDN0:98与人种系VkA27和JKl氨基酸序列分别为SEQIDN0:209和210的比对。[0173]图25B显示了9G7的轻链可变区(VK2的氨基酸序列(SEQIDN0:99与人种系VkA27和JK5氨基酸序列分别为SEQIDN0:209和212的比对。[0174]图26显示了14E3的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:115与人种系VH4-34和JH3氨基酸序列分别为SEQIDN0:201和202的比对。[0175]图27显示了14E3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:116与人种系VkL15和JKl氨基酸序列分别为SEQIDN0:207和211的比对。[0176]图28显示了19H8的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:128与人种系VH3-33、3-10和JH6氨基酸序列(分别为SEQIDN0:192、195和196的比对。[0177]图29A显示了19H8的轻链可变区(VKl的氨基酸序列(SEQIDNO:129与人种系VkL18和JKl氨基酸序列分别为SEQIDN0:204和211的比对。[0178]图29B显示了19H8的轻链可变区(VK2的氨基酸序列(SEQIDN0:130与人种系VkL6和JK4氨基酸序列分别为SEQIDN0:213和214的比对。[0179]图30显示了6G10的重链可变区的氨基酸序列(SEQIDN0:335与人种系VH3-33、3-10和JH6氨基酸序列(分别为SEQIDN0:192、195和196的比对。[0180]图31显示了6G10的轻链可变区(VKl的氨基酸序列(SEQIDN0:336与人种系VkL18和JK2氨基酸序列分别为SEQIDN0:204和205的比对。[0181]图32显示了通过FACS评估的各种抗GITR抗体对于活化的人T细胞的结合亲和力以nM表示),其中无抗体、IgGl和hIgG2抗体作为对照。[0182]图33显示了通过FACS评估的各种抗GITR抗体对于活化食蟹猴T细胞的结合亲和力以nM表示),其中无抗体、hIgG1和hIgG2抗体作为对照。[0183]图34A和34B显示了各种抗GITR抗体抑制GITR配体GITR-L与GITR3A9细胞结合的能力,其中hIgGI、hIgG2、无抗体以及仅有细胞作为对照。[0184]图34C显示了重组GITR-L与活化人⑶4及⑶8T细胞的结合。[0185]图34D显示,GITR-L部分地阻断了28F3-hIgGl与活化人CD4+T细胞的结合。28F3-hlgGl在0.5ygmL的固定浓度下与活化T细胞的结合被预结合的GITR-L以0.0024ygmL的IC50部分阻断。[0186]图34E显示,28F3-hIgGl不阻断0.6ygml的GITR-L与活化的人T细胞的结合。在将GITR-L以0.6mgmL、约90%饱和度添加至CD4+T细胞时,在100mgmL至0.00056mgmL范围内的预结合的28F3-hIgGl不能阻断GITR-L。[0187]图34F显示,28F3-hIgGl部分地阻断0.02ygml的GITR-L与活化的人T细胞的结合。GITR-L在20ngmL的固定浓度下与活化T细胞的结合被预结合的28F3-hIgGl以0.075ygmL的IC50部分阻断。[0188]图35A显示了Western印迹,其展示抗GITR抗体28F3与天然人GITR结合而不与变性的人GITR结合,并且该结合不受N-连接糖基化的存在或不存在的影响。“+”符号指示经N-糖酰胺酶PNGaseF处理以去除N-连接糖基化的样品。[0189]图35B为考马斯蓝Coomassieblue染色的凝胶,其显示在转移至硝基纤维素上用于Western印迹分析之前所有形式的人GITR的存在。[0190]图36厶-368显示了28?3和303抗体与通过用蛋白内切酶厶作-01、蛋白内切酶1^8-C2、胰蛋白酶3、蛋白内切酶Glu-C4或蛋白内切酶Asp-N⑸消化生成的天然GITR片段的结合。[0191]图37显示了抗GITR抗体28F3与利用蛋白内切酶Glu-C和胰蛋白酶(“Glu-C和胰蛋白酶”)、蛋白内切酶Arg-C“Arg-C”)、蛋白内切酶Lys-C和胰蛋白酶(“Lys-C和胰蛋白酶”)、胰蛋白酶、或蛋白内切酶Asp-N和蛋白内切酶Glu-C“AspN和GluC”)消化天然人GITR蛋白生成的人GITR肽片段的结合的热图视图,从而鉴定与28F3抗体结合的表位的位置加框区)。人GITR的成熟细胞外结构域的氨基酸序列以深灰色显示,连接于其C端的小鼠Fc的序列以浅灰色显示。[0192]图38A显示了在包被28F3的珠子与来自天然人GITR的胰蛋白酶消化产生的肽温育之后的流过级分中的肽。[0193]图38B显示了两种主要的28F3结合肽(以星号指示)。[0194]图38C显示通过LC-MS将图34B中的两个峰中的第一个鉴定为对应于具有所示的序列并且没有0-连接糖基化的N端肽。[0195]图38D显示通过LC-MS将图34B中的两个峰中的第二个鉴定为对应于具有所示的序列并且在T20上具有0-连接糖基化的N端肽。[0196]图38E显示了与28F3—起温育过的较长肽在用蛋白内切酶Asp-N原位消化后剩余的GITR肽。[0197]图39A显示了重组人GITRFc以及重组人GITRFc与28F3IgGl的蛋白复合物的胃酶解肽的列表,其对GITR的N端区的序列覆盖率达到86%。[0198]图398显示了在28?31861!1^13“61了1?.6”)不存在存在下通过肋乂质谱]\^的氘摄取水平。[0199]图39C描绘了如通过HDXMS确定的成熟人GITR中被28F3结合的两个区。[0200]图40显示了在板结合的抗⑶3抗体存在下各种激动剂抗GITR抗体对3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的作用。[0201]图41A显示了激动剂抗GITR抗体18EKK13H2与28F3相同)和28F3对由特异性抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的作用。[0202]图41B显示了激动剂抗GITR抗体3C3显示为“GITR.3”)、28F3、19D3和18E10对由特异性抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的作用。[0203]图42A显示了各种激动剂抗GITRHuMab抗体对经CH0-0KT3细胞(S卩,表达0KT3scfv的CHO细胞刺激的T细胞的干扰素γIFN-γ分泌的作用。[0204]图42Β显示了激动剂抗GITR抗体28F3对经表达0ΚΤ3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IL-2分泌的作用,其中T细胞来自第一供体。[0205]图42C显示了抗GITR抗体28F3对经表达0ΚΤ3的CHO细胞刺激的⑶4+Τ细胞的IFN-γ分泌的作用,其中T细胞来自第一供体。[0206]图42D显示了抗GITR抗体28F3对经表达0ΚΤ3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IL-2分泌的作用,其中T细胞来自第二供体。[0207]图42Ε显示了抗GITR抗体28F3对经表达0ΚΤ3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IFN-γ分泌的作用,其中T细胞来自第二供体。[0208]图43显示了在HEL48-63肽存在下抗GITR抗体28F3IgG2、28F3-Fab’)2片段和28F3-Fab对经LK35.2细胞刺激的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的作用。[0209]图44显示了使用单克隆抗体28F3-FITC的人扁桃体标本的免疫组织化学。[0210]图45A-45D显示了大鼠抗小鼠GITR抗体DTA-1的不同同种型在MC38结肠腺癌模型中对抗肿瘤活性的影响,所述抗肿瘤活性通过经这些同种型治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来加以度量:(图45A对照小鼠IgGl抗体(10mgkg;图45BDTA-1大鼠IgG2b10mgkg;图45CDTA-1小鼠IgGl10mgkg;图45DDTA-1小鼠IgG2a10mgkg。针对10只小鼠的每个组显示每组无肿瘤TF小鼠的数目。[0211]图46A和46B显示了在经不同同种型的DTA-1抗体(IOmgkg治疗的小鼠组中的MC38肿瘤的平均肿瘤体积(图46A和中位肿瘤体积(图46B的变化。[0212]图47六-47?显示了经不同抗61了1?饥4-1和抗:1'1^-4909同种型以及指示的对照抗体治疗的荷MC38肿瘤的小鼠的脾淋巴细胞(图47A-47C和肿瘤浸润淋巴细胞TIL图47D-47F的流式细胞分析。(图47A脾中的CD8+T细胞的百分比;(图47B脾中的CD4+细胞的百分比;(图47C脾中亦为Foxp3+的⑶4+细胞的百分比;(图47DTIL中CD8+T细胞的百分比;图47ETIL中⑶4+细胞的百分比;(图47FTIL中亦为Foxp3+的⑶4+细胞的百分比。[0213]图48A-48F显示了经重新改造以使聚集最小化的大鼠抗小鼠GITR抗体DTA-I称为“mGITR.7”)的不同同种型在MC38模型中对抗肿瘤活性的影响,所述抗肿瘤活性通过经这些同种型治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来加以度量:(图48A对照小鼠IgGl抗体;(图48BmGITR.7mIgGl;图48CmGITR.7mIgGl-D265A;图48DmGITR.7mIgG2a;图48EmGITR.7mIgG2b;图48FmGITR.7大鼠IgG2b。针对9只小鼠的每个组显示每组TF小鼠的数目。[0214]图49A和49B显示了在经不同同种型的重新改造的DTA-I抗体治疗的小鼠组中的MC38肿瘤的平均肿瘤体积(图49A和中位肿瘤体积(图49B的变化。[0215]图50A和50B显示了不同DTA-I经重新改造的“mGITR”DTA-l或最初改造的“DTA-Γ抗体和抗CTLA-49D9同种型对荷MC38肿瘤的小鼠的脾(图50A和TIL图50B中的Foxp3+⑶4+Treg的影响的流式细胞分析。[0216]图51A-51E显示了不同的小鼠DTA-1同种型在SaIN纤维肉瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性,所述抗肿瘤活性通过在经这些同种型治疗的小鼠个体中的肿瘤体积的变化来度量:图51A对照小鼠IgGl抗体;(图51BDTA-1小鼠IgG2a;图51CDTA-1大鼠IgG2b;图51DDTA-1小鼠IgG1;图5IEDTA-1小鼠IgG1-D265A。针对至多10只小鼠的每个组显示每组TF小鼠的数目。[0217]图52A和52B显示了在经不同同种型的DTA-I抗体治疗的小鼠组中的SalN肿瘤的平均肿瘤体积图52A和中位肿瘤体积图52B的变化。[0218]图53A和53B显示了不同DTA-I和抗CTLA-49D9同种型对荷SalN肿瘤的小鼠的脾图53A和TIL图53B中的Foxp3+CD4+Treg的影响。[0219]图54A-54D显示了使用分期的MC38结肠腺癌模型的大鼠抗GITR抗体DTA-1对肿瘤体积的影响。在第7、10和14天用(图54A对照mlgGl、(图54BmlgG+DTA-l、(图54CmlgG+PD-1和(图54DPD-1+DTA-1治疗小鼠。针对10只小鼠的每个组显示每组无肿瘤TF小鼠的数目。[0220]图55A和55B显示了抗GITR抗体28F3中的VHCDR3的突变的各种组合对与3A9-hGITR细胞结合的影响。[0221]图56A-56F显示了在板结合的抗⑶3存在下抗GITR抗体28F3中的VH⑶R3的突变的各种组合对3A9-hGITR细胞的IL-2分泌水平的影响。[0222]图57显示了指示的抗GITR抗体对活化T细胞的结合亲和力。所测试的抗体包含以下重链恒定区中的一者:IgGl恒定区(“抗GITR.gif”)、无效应子的IgGl恒定区(“抗GITR.gl.lf”)、IgG2恒定区(“抗GITR-G2”)、IgG2铰链及IgGlFc结构域(“抗GITR.G2.Glf’)以及IgG2铰链及无效应子IgGlFc结构域(“抗GITR.G2.Gl.If”)。[0223]图58A-58C显示了用具有不同重链恒定区的可溶性抗人GITR抗体刺激的供体⑶4T细胞的IFN-γ和IL-2的分泌。图58A显示了用表达0KT3的CHO细胞和不同浓度的具有IgG2-IgGl恒定区的抗人GITR抗体刺激的供体⑶4T细胞的IFN-γ分泌。图58B显示了用表达0KT3的CHO细胞和不同浓度的IgGl重链恒定结构域或IgG2-IgGl杂合重链恒定结构域刺激的供体⑶4T细胞的IL-2分泌。图58C显示了用表达0KT3的CHO细胞和不同浓度的图55A和B中的抗体的无效应子型式IgGl.1刺激的供体⑶4T细胞的IL-2分泌。[0224]图59显示了在板结合的抗CD3存在下指示的抗GITR抗体对3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的比较。[0225]图60A-60D显示了28F3.IgGl和28F3.IgGl·1对Treg及Teff细胞的增殖的影响。[0226]图61A-61F显示了28F3·IgGl“GITR.6IgGl”)和28F3·IgGl·I“GITR.6IgGl·Γ对来自两种不同供体的活化CD4+细胞、CD8+细胞和Treg富集细胞的NK细胞诱导的溶解(NKcellinducedanalysis的影口向。[0227]图62A-62C显示了对照hlgGl抗体、28F3.IgGl“抗GITRIgGl”)和28F3.IgGl.1“抗GITRIgGl·Γ对MC38肿瘤生长的影响。[0228]图63A和63B分别显示了用对照hIgG1抗体、28F3.IgG1“抗GITRIgGΓ和28F3.IgGl.I“抗GITRIgGl.Γ治疗的小鼠中的MC38肿瘤的平均体积和中位体积。[0229]图64Α和64Β分别显示了用对照hlgGl抗体、28F3.IgGl“抗GITRIgGl”)和28F3.IgGl.1“抗GITRIgGl.Γ治疗的具有MC38肿瘤的小鼠的体重变化的均值%和体重变化中位值%。[0230]图65显示了在MC38肿瘤模型中28F3.IgGl“GITRIgGl”)相对于同种型对照对Treg细胞耗竭的影响。[0231]图66显示了在MC38肿瘤模型中28F3.IgGl“GITRIgGl”)相对于同种型对照对CD8+T细胞的百分比的影响。[0232]图67显示了可溶性交联28F3·IgGl“GITR.6IgGl”)和28F3·IgGl·1“GITR.6IgGl·Γ对在与CH0-0KT3和CH0-0KT3-CD32a细胞共培养时的T细胞的IFN-γ分泌的影响。[0233]图68显示了可溶性交联的28卩3.1861“61丁1?.61861”)和28卩3.1861.1“GITR.6IgGl.l”)对在与CH0-0KT3和CH0-0KT3-CD32a细胞共培养时的T细胞的增殖的影响。[0234]图69显示了在具有指示的恒定区的抗GITR抗体存在下与CH0-0KT3细胞共培养的⑶4+T细胞分泌的IL-2的水平。[0235]图70显示了抗体与抗his抗体Fab捕获的FcγR-his蛋白的结合。假定1:lmAb:FcγR结合化学计量,将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。按照幻灯片底部的颜色图例提供的顺序显示每种抗体的条形图。[0236]图71显示了抗体与抗his抗体Fab捕获的FcgR-his蛋白的结合。假定1:lmAb:FcγR结合化学计量,将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。按照幻灯片底部的颜色图例提供的顺序显示每种抗体的条形图。[0237]图72显示了抗GITR抗体的内化时程分析。[0238]图73Α显示了在零时间的GITR和早期内体标志物ΕΕΑ2共定位分析。[0239]图73Β显示了在时间30分钟和120分钟的GITR和早期内体标志物ΕΕΑ2共定位分析。[0240]图73C显示了在图73Α和73Β中所示的内体共定位的定量结果,将其绘制为共定位像素强度相对于总染色的比率。[0241]图74Α显示了用指示的抗GITR抗体处理的⑶8+Τ细胞中的NFkB信号转导激活。[0242]图74Β显示了用指示的抗GITR抗体处理的⑶4+T细胞中的NFkB信号转导激活。[0243]图75显示了用指示的抗GITR抗体处理的⑶4+T细胞中的Ρ38活化。[0244]图76Α显示了在具有指示的恒定区的不同浓度的抗GITR抗体存在下与CH0-0KT3细胞共培养的⑶4+T细胞分泌的IL-2的水平。[0245]图76B显示了在具有指示的恒定区的5ygml的抗GITR抗体存在下与CH0-0KT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2的水平与图76A中的实验相同)。[0246]图76C显示了在具有指示的恒定区的1.25ygml的抗GITR抗体存在下与CH0-0KT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2的水平与图76A中的实验相同)。[0247]图76D显示了在具有指示的恒定区的0.313ygml的抗GITR抗体存在下与CH0-0KT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2的水平与图76A中的实验相同)。[0248]发明详述[0249]本文中描述了与GITR特异性地结合、且由此激活下游GITR信号转导的分离的抗体“激动剂抗GITR抗体”),尤其是单克隆抗体,例如人单克隆抗体。在某些实施方案中,本文所述的抗体衍生自特定的重链和轻链种系序列和或含有包含特定氨基酸序列的特定结构特征,比如CDR区。本申请提供了分离的抗体、制造这样的抗体的方法、包含这样的抗体的免疫缀合物和双特异性分子以及经配制为含有所述抗体的药物组合物。本文中还提供了单独地或与其他免疫刺激剂例如,抗体和或癌症疗法联合使用所述抗体用于免疫应答增强的方法。因此,本文所述的抗GITR抗体可用于多种治疗应用中的治疗,包括例如抑制肿瘤生长和治疗病毒感染。[0250]定义[0251]为了更易于理解本说明,首先对某些术语进行了定义。其他定义在整个详细说明中进行阐述。[0252]如本文中使用的术语“糖皮质激素诱导的TNF受体”或“GITR”是指一种与GITR配体GITR-L结合的受体,其为TNF受体超家族的成员。GITR也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18TNFRSF18、AITR和⑶357。术语“GITR”包括由细胞天然表达的GITR的任何变体或同等型。因此,本文所述的抗体可与来自除了人以外的物种的GITR例如,食蟹猴GITR交叉反应。或者,抗体对人GITR可以是特异的,而与其他物种可能不展现出任何交叉反应性。GITR或其任何变体和同等型可以分离自天然表达它们的细胞或组织,或使用本领域熟知的技术和或本文所述的技术以重组方式产生。[0253]已经鉴定了人GITR的三个同等型,三者均共有相同的细胞外结构域,但C端部分除夕卜。变体1登录号NP_004186;SEQIDN0:1由241个氨基酸组成,代表最长的转录物。与变体2相比,其含有导致移码的额外编码区段。与同等型2相比,所得的蛋白质(同等型1含有不同的较短的C端。变体2登录号NP_683699;SEQIDN0:2编码最长的蛋白质(同等型2,其由255个氨基酸组成,且是可溶的。与变体2相比,变体3登录号NP_683700;SEQIDNO:3含有导致移码的额外编码区段。与同等型2相比,所得的蛋白质(同等型3含有不同的较短的C端,且由234个氨基酸组成。[0254]以下是三个已知的人GITR同等型、食蟹猴GITR和GITR-L的氨基酸序列。[0255]人GITR同等型1登录号NP_004186;SEQIDN0:1;由具有登录号NM_004195.2的核苷酸序列编码):[0256]MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMffPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLffV[0257]人GITR同等型2登录号NP_683699.1;SEQIDN0:2;由具有登录号NM_148901.1的核苷酸序列编码):[0258]MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCCffRCRRRPKTPEAASSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEPGRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRPGPCSSAAAAGPCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS[0259]人GITR同等型3登录号NP_683700.1;SEQIDN0:3;由具有登录号NM_148902.1的核苷酸序列编码):[0260]MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLffV[0261]同等型1-3的信号序列对应于氨基酸1-25。因此,成熟同等型1、2和3分别由氨基酸26至241、255或234组成。成熟GITR的细胞外结构域由氨基酸26-162组成且具有以下氨基酸序列:[0262]QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPSEQIDNO:4[0263]食蟹猴GITR蛋白序列(SEQIDNO:5:[0264]MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIILLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLffV[0265]人GITR-L蛋白序列(登录号NP_005083.2;SEQIDN0:6:[0266]MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS如本文中使用的术语“抗体”包括全抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中,“抗体”是指包含由二硫键互连的至少两条重⑹链和两条轻L链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH和重链恒定区。在某些天然存在的抗体中,重链恒定区包含三个结构域CHl、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中,每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VD和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CLJh区和I区可以进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR,互补决定区与更为保守的被称为框架区FR的区域间隔。Vh和Vl各自由3个CDR和4个FR组成,按下列顺序从氨基端到羧基端排列:FRl、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞例如,效应细胞和经典补体系统的第一组分Clq结合。[0267]抗体一般以高亲和力与其同源抗原特异性结合,反映在解离常数Kd上为HT5到HT11M或更低。大于约HT4M的任何Kd通常被认为指示非特异性结合。如本文中使用的,与抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和力与抗原及基本上相同的抗原结合的抗体,高亲和力意味着Kd为HT7M或更低、优选地HT8M或更低、甚至更优选地5XHT9M或更低、最优选地在HT8M和HT1t3M之间或更低,但是不会以高亲和力与无关抗原结合。如果一种抗原相对于给定抗原展现出高度的序列同一性,例如如果它相对于给定抗原的序列展现出至少80%、至少90%、优选地至少95%、更优选地至少97%、或者甚至更优选地至少99%的序列同一性,则该抗原与给定抗原“基本上相同”。作为举例,与人GITR特异性结合的抗体也可以和来自某些灵长类物种的GITR抗原(例如,食蟹猴GITR具有交叉反应性,但是不会和来自其他物种的GITR抗原、或者与除GITR之外的抗原交叉反应。[0268]免疫球蛋白可来自公知的同种型中的任一者,包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM1JgG同种型在某些物种中分成亚类:在人类中为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4,在小鼠中为IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。在某些实施方案中,本文所述的抗GITR抗体属IgGl或IgG2亚型。免疫球蛋白(例如,IgGl存在若干同种异型,这些同种异型以至多少数个氨基酸而彼此不同。作为举例,“抗体”包括天然和非天然抗体;单克隆和多克隆抗体;嵌合和人源化抗体;人和非人抗体;全合成抗体;以及单链抗体。[0269]如本文中使用的,术语抗体的“抗原结合部分”是指保留与抗原(例如,人GITR特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。这样的“片段”的长度是,例如,约8个至约1500个氨基酸,适合的长度是约8个至约745个氨基酸,适合的长度是约8个至约300,例如约8个至约200个氨基酸,或者约10个至约50或100个氨基酸。已经显示,抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。术语抗体例如,本文所述的抗GITR抗体)的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括:⑴Fab片段,由Vl、Vh、CL和CHl结构域组成的单价片段;(iiFab’)2片段,包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iiiFd片段,由Vh和CHl结构域组成;(ivFv片段,由抗体单臂的Vl和Vh结构域组成;(VdAb片段Ward等人,(1989Nature341:544-546,其由Vh结构域组成;和vi分离的互补决定区(CDR或vii两个或更多个分离的CDR的组合,它们可以任选地通过合成接头连接。此外,尽管Fv片段的两个结构域Vl和Vh由单独的基因编码,但可使用重组方法通过合成接头将它们连接,使它们能够以单个蛋白链的形式产生,其中Vl区和Vh区配对形成单价分子称作单链FvscFv;参见,例如,Bird等人,(1988Science242:423-426;Huston等人,(1988Proc.Natl.Acad.Sci·USA85:5879-5883。这样的单链抗体预期也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段,并通过与完整抗体相同的方式筛选具有实用性的片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生、或通过完整免疫球蛋白的酶切割或化学切割产生。[0270]“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生,包括杂交瘤融合或Fab’片段的连接。参见,例如,SongsivilaiLachmann,Clin·Exp·Immunol.79:315-3211990;Kostelny等人,J.Immunol·148,1547-15531992。[0271]如本文中使用的,术语“单克隆抗体”是指对抗体的特定表位或组合物展示单一结合特异性和亲和力的抗体,其中所有抗体都对特定表位展示单一结合特异性和亲和力。因此,术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性且具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的抗体或抗体组合物。在一个实施方案中,人单克隆抗体由杂交瘤产生,所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自转基因非人动物(例如,转基因小鼠)的B细胞,所述B细胞的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。[0272]如本文中使用的,术语“重组人抗体”包括所有通过重组手段制备、表达、创建或分离的人抗体,例如a从针对人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物例如,小鼠)或从此类动物制备的杂交瘤分离的抗体,〇3从被转化而表达该抗体的宿主细胞,例如从转染瘤分离的抗体,(c从重组、组合人抗体文库分离的抗体,和⑹通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的方法而制备、表达、创建或分离的抗体。这样的重组人抗体包含这样的可变区和恒定区,它们利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列,但包括在例如抗体成熟期间发生的后续重排和突变。如本领域中已知的(参见,例如,Lonberg2005NatureBiotech.23⑼:1117-1125,可变区含有由多个基因编码的抗原结合结构域,这些基因发生重排以形成外来抗原特异性的抗体。除了重排之外,可以进一步通过多个单氨基酸改变称为体细胞突变或超突变修饰可变区,以增加抗体与外来抗原的亲和力。恒定区会进一步响应于抗原而改变(即,同种型转换)。因此,响应于抗原的编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的经过重排和体细胞突变的核酸分子与原始的核酸分子可能不具有序列同一性,而是基本上相同或者相似即,具有至少80%的同一性)。[0273]“人”抗体HuMAb是指具有如下可变区的抗体,其中框架区和CDR区都衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外,如果抗体含有恒定区,则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本文所述的抗体可以包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基例如,通过体外随机诱变或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而,如本文中使用的,术语“人抗体”不意图包括这样的抗体:其中源自另一个哺乳动物物种种系例如小鼠的CDR序列被移植到人框架序列上。术语“人”抗体和“全人”抗体可作为同义词使用。[0274]“人源化”抗体是指这样的抗体,其中非人抗体CDR结构域外部的一些、大多数或全部氨基酸被衍生自人免疫球蛋白的相应氨基酸代替。在人源化抗体形式的一个实施方案中,CDR结构域外部的一些、大多数或全部氨基酸被来自人免疫球蛋白的氨基酸代替,而一个或多个CDR区域内的一些、大多数或全部氨基酸没有改变。少量氨基酸的添加、缺失、插入、取代或修饰也允许的,只要它们不会消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。[0275]“嵌合抗体”是指这样的抗体:其中可变区衍生自一个物种而恒定区衍生自另一个物种,比如这样的抗体:其中可变区衍生自小鼠抗体而恒定区衍生自人抗体。[0276]如本文中使用的,“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如,IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE抗体)。[0277]“同种异型”指特定同种型组内的天然变体,所述变体有少数氨基酸不同(例如,参见Jefferis等人(2009mAbs1:1。本文所述的抗体可属于任何同种异型。如本文中使用的,称为“IgGlf”或“IgGl.If”同种型的抗体分别是同种异型“f”的IgGl抗体及无效应子的IgGl.l抗体,即根据如Kabat中的EU索引具有214R、356E和358M,正如例如SEQIDN0:7中所示参见表15的SEQIDNo:7中的加下划线的残基)。[0278]短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性地结合的抗体”互换使用。[0279]如本文中使用的“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体例如,与GITR特异性地结合的分离的抗体基本上不含与除GITR以外的抗原特异性地结合的抗体)。然而,与GITR的表位特异性结合的分离的抗体可与来自不同物种的其他GITR蛋白具有交叉反应性。[0280]如本文中使用的,“抑制GITR-L与GITR结合”的抗体意指在本领域公认的方法例如,本文所述的基于FACS的结合测定)中,例如在使用3A9-hGITR细胞的结合测定中,以如下EC50抑制GITR-L与GITR结合的抗体:约lygmL或更小,比如约0·9ygmL或更小、约0·85ygmL或更小、约0.8ygmL或更小、约0.75ygmL或更小、约0.7ygmL或更小、约0.65ygmL或更小、约O·6ygmL或更小、约O·55ygmL或更小、约O·5ygmL或更小、约O·45ygmL或更小、约O·4ygmL或更小、约O·35ygmL或更小、约O·3ygmL或更小、约O·25ygmL或更小、约O·2ygmL或更小、约O·15ygmL或更小、或约O·lygmL或更小。[0281]“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或因其产生的生物化学事件。示例性的“效应子功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒作用CDC、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(比如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用ADCP和细胞表面受体例如,B细胞受体;BCR的下调。这样的效应子功能通常需要Fc区与结合结构域例如,抗体可变结构域组合。[0282]“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包括FcγR家族的受体,包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种活化性受体(小鼠中为FcγRI、FcγRIII和FcγRIV;人类中为FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA及一种抑制性受体FeγRIIB组成。表1中总结了人FeγR的各种性质。大多数先天效应细胞类型共表达一或多种活化性FeγR和抑制性FeγRIIB,而小鼠和人类中的自然杀伤NK细胞选择性地表达一种活化性Fe受体小鼠中为FeγRIII,人类中为FeγRIIIA而不表达抑制性FeyRIIB。人IgGl与大部分人Fe受体结合,且就其结合的活化性Fe受体的类型而言被认为等同于鼠IgG2a。[0283]表1.人FcyR的性质[0284][0285]“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链C端的区域,其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合包括与位于免疫系统的各种细胞例如,效应细胞上的Fc受体或与经典补体系统的第一组分Clq结合)。因此,Fc区包含抗体的恒定区,但第一恒定区免疫球蛋白结构域例如,CHl或CL除外。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中,Fc区包含衍生自抗体的两条重链的第二Ch2和第三Ch3恒定结构域的两个相同的蛋白质片段;IgM和IgEFc区在每一多肽链中包含三个重链恒定结构域Ch结构域2-4。对于IgG而言,Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3及以及在Cγ1与Cγ2之间的铰链。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化,但通常将人IgG重链Fc区定义为从位置C226或Ρ230处的氨基酸残基或这两个氨基酸之间的氨基酸延伸至重链的羧基端,其中编号的根据是如Kabat中的EU索引。人IgGFc区的Ch2结构域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340,而Ch3结构域位于Fc区中的Ch2结构域的C端侧上,S卩,其从IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文中使用的,Fc区可以是天然序列Fc包括任何同种异型变体或变体Fc例如,非天然存在的FeAc还可以是指这个区域处于分离状态或处于包含Fe的蛋白多肽的背景下,所述包含Fe的蛋白多肽例如“包含Fe区的结合蛋白”,也称为“Fc融合蛋白”(例如,抗体或免疫粘附素)。[0286]“天然序列Fe区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe区包括天然序列人IgGlFc区;天然序列人IgG2Fc区;天然序列人IgG3Fc区;和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。天然序列Fe包括Fe的各种同种异型例如,参见Jefferis等人2009mAbs1:1。[0287]“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”是指重链恒定区中将CHl结构域与CH2结构域连接的结构域,其包括铰链的上部、中间及下部部分(R〇uX等人,J.Immuno1.1998161:4083。铰链提供在抗体的结合区与效应子区之间的不同程度的柔性,并且还提供在两个重链恒定区之间的分子间二硫键合位点。如本文中使用的,对于所有IgG同种型而言,铰链始于Glu216且止于Gly237Roux等人,1998JImmunol161:4083。野生型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4铰链的序列示于表2和表9中。[0288]表2·[0289]铰链区氨基酸[0290][0292]*CH1结构域的C端氨基酸序列。[0293]术语“铰链”包括野生型铰链如在表15列出的那些)以及其变体例如,非天然存在的铰链或修饰的铰链)。例如,术语“IgG2铰链”包括如表15中所示的野生型IgG2铰链以及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和或至多5、4、3、2或1个突变例如,取代、缺失或添加)的变体。示例性IgG2铰链变体包括其中1、2、3或全部4个半胱氨酸C219、C220、C226及C229变为另一个氨基酸的IgG2铰链。在特定实施方案中,IgG2包含C219S取代。在某些实施方案中,铰链是包含来自至少两个同种型的序列的杂合铰链。例如,铰链可包含来自一个同种型的上部、中间或下部铰链,且铰链的其余部分来自一个或多个其他同种型。例如,铰链可以是IgG2IgGl铰链,且可包含,例如,IgG2的上部和中间铰链以及IgGl的下部铰链。铰链可具有效应子功能或丧失效应子功能。例如,野生型IgGl的下部铰链提供效应子功能。[0294]术语“CH1结构域”是指重链恒定结构域中将可变结构域与铰链连接的重链恒定区域。如本文中使用的,CHl结构域始于Al18且止于V215。术语“CH1结构域”包括野生型CHl结构域例如,对于IgGl,具有SEQIDN0:278;对于IgG2,具有SEQIDN0:279;表15以及其变体例如,非天然存在的CHl结构域或修饰的CHl结构域)。例如,术语“CH1结构域”包括野生型CHl结构域以及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个和或至多5、4、3、2或1个突变例如,取代、缺失或添加)的变体。示例性CHl结构域包括具有改变抗体的生物活性比如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CHl结构域。本申请提供了影响抗体的生物活性的CHl结构域的修饰。[0295]术语“CH2结构域”是指重链恒定结构域中将铰链与CH3结构域连接的重链恒定区域。如本文中使用的,CH2结构域始于P238且止于K340。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域例如,对于IgGl,具有SEQIDN0:280;对于IgG2,具有SEQIDN0:297;表15以及其变体例如,非天然存在的CH2结构域或修饰的CH2结构域)。例如,术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域以及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个和或至多5、4、3、2或1个突变例如,取代、缺失或添加)的变体。示例性CH2结构域包括具有改变抗体的生物活性比如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH2结构域。在某些实施方案中,CH2结构域包含降低效应子功能的取代A330SP331S。本申请提供了影响抗体的生物活性的CH2结构域的其他修饰。[0296]术语“CH3结构域”是指重链恒定结构域中在CH2结构域C端的重链恒定区域。如本文中使用的,CH3结构域始于G341且止于K447。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域例如,对于IgGl,具有SEQIDNO:282;对于IgG2,具有SEQIDNO:298;表15以及其变体(例如,非天然存在的CH3结构域或修饰的CH3结构域)。例如,术语“CH3结构域”包括野生型CH3构域以及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个和或至多5、4、3、2或1个突变例如,取代、缺失或添加的变体。示例性CH3结构域包括具有改变抗体的生物活性比如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH3结构域。本申请提供了影响抗体的生物活性的CH3结构域的修饰。[0297]“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGlFc区;天然序列人IgG2Fc区;天然序列人IgG3Fc区;和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型例如,参见Jefferis等人2009mAbs1:1。[0298]术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体与其特异性地结合的抗原例如,GITR上的位点。表位可由蛋白质的连续氨基酸形成通常是线性表位),或者由通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成通常是构象表位)。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常会但不总是保留,而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会丧失。表位一般包括处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定什么表位被给定抗体结合的方法S卩,表位作图)是本领域熟知的,并且包括,例如,免疫印迹测定法和免疫沉淀测定法,其中测试了重叠或连续肽例如,来自GITR的)与给定抗体例如,抗GITR抗体的反应性。确定表位空间构象的方法包括本领域和本文中描述的那些技术,例如,X射线晶体学、2维核磁共振和HDX-MS参见,例如,EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,Vol·66,G·E·Morris,Ed·1996〇[0299]术语“表位作图”是指鉴定抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。[0300]关于两种或更多种抗体的术语“与相同表位结合”意指所述抗体与相同的氨基酸残基区段结合,正如通过给定方法所确定。确定抗体与本文所述的抗体是否结合“GITR上的相同表位”的技术包括,例如,表位作图方法,例如抗原:抗体复合物的晶体的X射线分析,其提供表位的原子解析,以及氢氘交换质谱HDX-MS。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合,其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失经常被认为是表位组分的指示。另外,还可以使用表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。预期具有相同VH和VL或相同CDRl、2和3序列的抗体结合相同的表位。[0301]“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体是指抑制(部分或完全地)另一抗体与靶标结合的抗体。可使用已知的竞争实验确定两个抗体是否彼此竞争结合靶标,即,一个抗体是否抑制另一抗体与靶标的结合及其抑制程度。在某些实施方案中,抗体与另一抗体竞争结合靶标且使另一抗体与靶标的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。抑制或竞争的程度可取决于哪个抗体是“阻断抗体”(即,先与靶标一起温育的冷抗体)而不同。竞争测定法可如下所述进行:例如,EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarbProtoc;2006;doi:10.1101pdb.prot4277或“UsingAntibodies”的第11章,EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,USA1999。竞争性抗体结合相同的表位、重叠表位或相邻表位例如,如通过空间位阻所证明)。[0302]其他的竞争性结合测定法包括:固相直接或间接放射免疫测定RIA、固相直接或间接酶免疫测定EIA、夹心竞争测定(参见Stahli等人,MethodsinEnzymology9:2421983;固相直接生物素-亲和素EIA参见Kirkland等人,J.Immunol.137:36141986;固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress1988;使用1-125标记物的固相直接标记RIA参见Morel等人,Mol.Immunol.251:71988;固相直接生物素-亲和素EIACheung等人,Virology176:5461990;和直接标记RIAMoldenhauer等人,Scand.J.Tmmunol.32:771990〇[0303]如本文中使用的,术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”、和“特异性地结合”是指抗体与预定抗原上的表位的结合。一般来说,抗体i在通过例如在BIAC0RE2000仪器中使用预定抗原例如,重组人GITR作为分析物和抗体作为配体的表面等离子体共振SPR技术、或抗体与抗原阳性细胞的结合的Scatchard分析测定时,以约低于10_7M、比如约低于1〇-8Μ、1Γ9Μ或HT1t3M或甚至更低的平衡解离常数KD结合,及(ii结合预定抗原的亲和力较其与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原例如,BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍。因此,“与人GITR特异性地结合”的抗体是指以HT7M或更低,例如约低于10-8M、HT9M或HT1t3M或甚至更低的Kd与可溶性或细胞结合的人GITR结合的抗体。“与食蟹猴GITR交叉反应”的抗体是指以KT7M或更低,例如约低于10-8M、HT9M或KT1t3M或甚至更低的Kd与食蟹猴GITR的结合的抗体。在某些实施方案中,这些不与来自非人物种的GITR交叉反应的抗体在标准结合测定中基本上未显示可检测出的针对这些蛋白质的结合。[0304]如本文中使用的,术语“kassoc”或“ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率,而如本文中使用的,术语“kdis”或“kd”意指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文中使用的,术语%”意指解离常数,其从kAka的比值卿,kdka获得,并表示为摩尔浓度M。可使用本领域良好建立的方法确定抗体的Kd值。用于确定抗体Kd的优选方法借助于使用表面等离子体共振,优选地使用诸如:BiaeoreI系统的生物传感器系统或流式细胞术和Scatchard分析。[0305]如本文中使用的,对于IgG抗体,术语“高亲和力”是指对靶抗原具有HT8M或更低,更优选地HT9M或更低,甚至更优选地10_1M或更低的Kd的抗体。然而,“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可能有变化。例如,对于IgM同种型,“高亲和力”结合是指具有HT7M或更低,更优选地IT8M或更低的Kd的抗体。[0306]在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的背景下,术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分诱导出最大反应的50%S卩,最大反应与基线之间的半程的反应时的浓度。[0307]术语“与固定的GITR结合”是指本文所述的抗体与GITR结合,例如与在细胞表面上表达的或附接在固体支持物上的GITR结合的能力。[0308]如本文中使用的,术语“交叉反应”是指本文所述的抗体与来自不同物种的GITR结合的能力。例如,结合人GITR的本文所述的抗体也可以结合另一个物种的GITR例如,食蟹猴GITR。如本文中使用的,通过检测在结合测定例如,SPR、ELISA中与纯化抗原的特异反应性、或检测与生理上表达GITR的细胞结合或在功能上的相互作用,可以测量交叉反应性。用于确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定,例如借助于使用Biacore™2000SPR仪器BiacoreAB,Uppsala,Sweden的Biacore™表面等离子体共振SPR分析、或流式细胞技术。[0309]如本文中使用的适用于客体的术语“天然存在”是指这样的事实,即所述客体可以在自然界中找到。例如,可以从自然界的来源分离但是尚未在实验室中被人有意修饰的存在于生物包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。[0310]“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链,链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰,例如但不限于,糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白质”可包含一个或多个多肽。[0311]如本文中使用的,术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,并且可以是cDNA。[0312]还提供了在本文中(例如,表15中)列出的序列比如在SEQIDN0:13-191中的“保守序列修饰”,即,不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。这样的保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸取代、以及核苷酸及氨基酸添加和缺失。例如,可通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变)向表15中的序列例如SEQIDNO:13-191中引入修饰。“保守氨基酸取代”包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸例如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,抗GITR抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基置换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(例如,参见Brummell等人,Biochem.32:1180-11871993;Kobayashi等人,ProteinEng.1210:879-8841999;和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-4171997。或者,在另一个实施方案中,可以例如通过饱和诱变沿着抗GITR抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变,并且可以筛选所得的修饰的抗GITR抗体的结合活性。[0313]对于核酸而言,术语“实质同源性”表明,两个核酸或它们的指定序列在最佳比对和比较其中适当插入或缺失核苷酸时有至少约80%的核苷酸、通常至少约90%至95%且更优选至少约98%至99.5%的核苷酸相同。或者,当多个区段在选择性杂交条件下将会与链的互补物杂交时,存在实质同源性。[0314]对于多肽而言,术语“实质同源性”表明,两个多肽或它们的指定序列在最佳比对和比较其中适当插入或缺失氨基酸时有至少约80%的氨基酸、通常至少约90%至95%且更优选至少约98%至99.5%的氨基酸相同。[0315]考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度,两个序列之间的同一性百分比是序列所共有的相同位置的数目的函数(即,同源性%=相同位置#总位置#χ100。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成,如下文的非限制性实施例所述。[0316]可以使用GCG软件包(可在http:www.gcg.com获得)中的GAP程序,使用NWSgapdna·CMP矩阵,空位权重40、50、60、70、或80,长度权重1、2、3、4、5、或6,确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用纳入ALIGN程序2.0版)中的E.Meyers和W.MillerCABI0S,4:11-171989的算法,使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、和空位罚分4,确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外,可以使用纳入GCG软件包可在http:www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和WunschJ.Mol.Biol·48:444-4531970算法,使用犯〇881111162矩阵或?41250矩阵,空位权重16、14、12、10、8、6、或4,长度权重1、2、3、4、5、或6,确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。[0317]本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”针对公共数据库进行搜索,以便例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人,(1990J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序2.0版进行这样的搜索。可以用NBLAST程序以得分=100、字长=12进行BLAST核苷酸搜索,以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序以得分=50、字长=3进行BLAST蛋白质搜索,以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较的目的,为了获得带空位的比对,可以如Altschul等人,(1997NucleicAcidsRes.2517:3389-3402所述利用带空位的BLAST。当利用BLAST和带空位的BLAST程序时,可以使用对应程序(例如,XBLAST和NBLAST的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov.[0318]核酸可存在于全细胞中,存在于细胞溶解物中,或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术将核酸与其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸例如染色体的其他部分或蛋白质)纯化分离时,核酸是“分离的”或“基本上纯化的”,所述标准技术包括碱SDS处理、CsCl显带法、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他方法。参见,F.Ausubel等人编辑,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork1987〇[0319]可根据标准技术使核酸(例如cDNA突变以提供基因序列。对于编码序列,这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。具体地说,构思了与天然V、D、J、恒定、开关序列、以及本文所述的其他这类序列基本上同源、或衍生自这些序列的DNA序列(其中“衍生”是指序列与另一个序列相同或从另一个序列修饰而得)。[0320]如本文中使用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”,其指的是另外的DNA区段可连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体能够在其中引入它们的宿主细胞中自主复制。其他载体例如,非附加型哺乳动物载体可以在引入到宿主细胞中之后整合到所述宿主细胞的基因组中,由此与宿主基因组一起复制。而且,某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简单地称为“表达载体”)。一般而言,用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换地使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,还包括具有等同功能的其他形式的表达载体,比如病毒载体例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。[0321]如本文中使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指这样的细胞,所述细胞包含非天然存在于所述细胞中的核酸,并且可以是其中已引入重组表达载体的细胞。应当理解,这样的术语不仅意指特定的受试细胞,还意指此类细胞的后代。由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生一些修饰,事实上这样的后代可能与亲本细胞不同,但是仍然包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。[0322]如本文中使用的,术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质,例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可以是GITR或其片段。抗原也可以是肿瘤抗原,其中针对它的保护或治疗性免疫应答是期望的,例如由肿瘤细胞表达的抗原例如,在与抗GITR抗体组合的疫苗中)。抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于包含以下的序列的全部或一部分的序列:PhCG、gpl00或Pme117、HER2neu、WTl、间皮素、CEA、gpl00、MARTl、TRP-2、黑色素-A、NY-ES0-1、NY-BR-1、NY-C0-58、MNgp250、独特型、MAGE-I、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-I抗原及生殖细胞衍生的肿瘤抗原。肿瘤相关抗原还包括血型抗原,例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-I、B-2抗原。或者,在构建体中可包括多于一种的抗原。例如,可将MAGE抗原与其他抗原例如黑色素A、酪氨酸酶和gplOO以及佐剂比如GM-CSF或a-12组合,并与抗APC抗体连接。[0323]上述抗原的序列是本领域熟知的。例如,MAGE-3cDNA序列的实例提供于US6,235,525LudwigInstituteforCancerResearch中;NY-ES0-1核酸和蛋白质序列的实例提供于US5,804,381和US6,069,233LudwigInstituteforCancerResearch中;黑色素-A核酸和蛋白质序列的实例提供于US5,620,886和US5,854,203LudwigInstituteforCancerResearch中;NY-BR-I核酸和蛋白质序列的实例提供于US6,774,226和US6,911,529LudwigInstituteforCancerResearch中并且NY-C0-58核酸和蛋白质序列的实例提供于WO02090986LudwigInstituteforCancerResearch中;HER-2neu蛋白质的氨基酸序列的实例可以GENBANK®登录号AAA58637获得;并且人癌胚抗原样1CEA-1的核苷酸序列mRNA可以GENBANK®登录号NM020219获得。[0324]“免疫应答”是指脊椎动物内针对外来物质的生物应答,所述应答保护生物抵抗这些物质和由它们引起的疾病。免疫应答由免疫系统的细胞例如,T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞及由这些细胞中的任一者或肝产生的可溶性大分子包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导,其导致脊椎动物体内的入侵病原体、病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和或消除。免疫应答包括例如T细胞例如,效应T细胞或Th细胞比如CD4+或CD8+T细胞的活化或抑制或Treg细胞的抑制。[0325]“免疫调制剂”或“免疫调节剂”是指可能涉及调制、调节或修饰免疫应答的作用剂,例如信号转导通路的组分。“调制”、“调节”或“修饰”免疫应答指免疫系统的细胞或这些细胞例如,效应T细胞)的活性的任何改变。这样的调制包括免疫系统的刺激或抑制,其可表现为各种细胞类型的数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低、或可在免疫系统内发生的任何其他变化。已经鉴定了抑制性和刺激性免疫调制剂,其中一些在肿瘤微环境中可具有增强的功能。在优选的实施方案中,免疫调制剂位于T细胞表面上。“免疫调制性靶标”或“免疫调节性靶标”是被某种物质、作用剂、模块、化合物或分子靶向结合,且其活性通过所述结合而被改变的免疫调制剂。免疫调制性靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调制性受体”)和受体配体(“免疫调制性配体”)。[0326]术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答在内的方法治疗罹患疾病或处于患上疾病或遭受疾病复发风险的受试者。[0327]“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指引起受试者中的免疫应答增加诱导或增强)以便例如治疗癌症的疗法。[0328]“增强内源性免疫应答”意指增加受试者中现有的免疫应答的有效性或效力。这种有效性和效力的增加可通过例如克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制来实现。[0329]“效应T”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞例如,CD4+和⑶8+T细胞)以及T辅助Th细胞,其分泌细胞因子且激活和指导其他免疫细胞,但不包括调节性T细胞Treg细胞)。本文所述的抗GITR抗体激活Teff细胞,例如⑶4+和⑶8+Teff细胞。[0330]刺激免疫应答或免疫系统的能力提高可以来自T细胞共刺激受体的激动剂活性增强和或抑制性受体的拮抗剂活性增强。可以在测量免疫应答的测定法中,例如在测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性在靶细胞上直接测定或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定)以及增殖方面的变化的测定法中,通过EC5q或最大活性水平的倍数增加反映刺激免疫应答或免疫系统的能力提高。刺激免疫应答或免疫系统活性的能力可增强至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多。[0331]在某些实施方案中,包含修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含修饰的重链恒定区的相同抗体具有更有效力的激动剂活性。例如,可以如实施例中所示通过例如测量与抗体接触过的T细胞的IFN-γ或IL-2的分泌水平来确定抗体的激动剂活性增强。激动剂活性可增强至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多,正如通过以下所定义:效应T细胞的细胞因子释放增加或增殖增加;调节性T细胞活性的降低(如果Treg上的衔接降低Treg功能的话);或Treg耗竭增加。例如,T细胞用包含修饰的重链恒定区的抗体刺激后分泌的IFN-γ或IL-2的量,与用不包含修饰的重链恒定区的相同抗体刺激过的T细胞相比,可以高至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多。[0332]如本文中使用的,术语“连接”是指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价或非共价的。连接也可以是遗传的(即,重组融合)。这样的连接可以使用多种本领域公认的技术来实现,比如化学缀合和重组蛋白生产。[0333]如本文中使用的,“给药”或“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将包含治疗剂的组合物以物理方式引入到受试者中。本文所述的抗体的优选给药途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径例如通过注射或输注)。如本文中使用的短语“肠胃外给药”是指通常通过注射而不是肠内和局部给药的给药方式,包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。或者,本文所述的抗体可经由非肠胃外途径给药,比如局部、表皮或粘膜给药途径,例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。还可以例如一次、多次、和或经一个或多个延长的时期进行给药。[0334]如本文中使用的术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞包括效应T细胞例如,CD8+细胞和辅助T细胞例如,CD4+细胞)介导的应答。T细胞介导的应答包括例如T细胞细胞毒性和增殖。[0335]如本文中使用的术语“细胞毒性T淋巴细胞CTL应答”指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由⑶8+T细胞介导。[0336]如本文中使用的,术语“抑制”或“阻断”(例如,在提及抑制阻断GITR-L与细胞上的GITR的结合时)可互换使用,并且涵盖部分和完全抑制阻断。在一些实施方案中,例如,正如本文中进一步描述所确定的,抗GITR抗体将GITR-L与GITR的结合抑制至少约50%,例如约60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%。在一些实施方案中,例如,正如本文中进一步描述所确定的,抗GITR抗体将GITR-L与GITR的结合抑制不超过50%,例如约40%、30%、20%、10%、5%或1%。[0337]如本文中使用的,术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的降低,例如,肿瘤生长抑制至少约10%,例如至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约99%或100%。[0338]如本文中使用的,“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的广泛的疾病。不受调节的细胞分裂和生长可以导致恶性肿瘤或细胞的形成,所述恶性肿瘤或细胞侵袭邻近组织并且可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。[0339]如本文中使用的术语“治疗”(“treat”)、“治疗”(“treating”)和“治疗”“treatment”)是指为了逆转、减轻、改善、抑制、或减缓或预防与疾病相关的症状进展、发展、严重性或复发、并发症、病症或生化标记而对受试者进行的或施用活性剂的任何类型的干预或过程。治疗可针对患有疾病的受试者或无疾病的受试者例如,用于预防)。[0340]“血液恶性肿瘤”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤以及脾和淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤B细胞血液癌)和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大部分非霍奇金淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞白血病重叠)、套细胞淋巴瘤MCL、伯基特淋巴瘤Burkitt’slymphoma、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。血液恶性肿瘤还包括白血病,例如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病和急性淋巴母细胞白血病。血液恶性肿瘤进一步包括骨髓瘤,例如但不限于多发性骨髓瘤和冒烟型多发性骨髓瘤。术语血液恶性肿瘤涵盖其他血液和或B细胞-或T细胞-相关的癌症。[0341]术语“有效剂量”或“有效药量”被定义为足以实现或者至少部分实现期望效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物的在单独或与其他治疗剂联合使用时能够促进疾病消退的任何量,其中疾病消退的证据是疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加、或防止由于疾病痛苦导致的损害或失能。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”,这是药物的在向具有疾病发生风险或正在遭受疾病复发的受试者单独或与其他治疗剂联合给药时能够抑制疾病发生或复发的任何量。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发生或复发的能力可以使用多种技术人员已知的方法进行评估,例如在临床试验期间的人类受试者中,在预测在人体内效力的动物模型系统中,或者通过体外测定法中测定药剂的活性。[0342]作为举例,抗癌剂是促进受试者体内癌症消退的药物。在优选的实施方案中,药物的治疗有效量促进癌症消退直至癌症消除。“促进癌症消退”是指有效量的药物单独给药或与抗肿瘤剂联合给药导致肿瘤生长降低或大小变小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加、防止由于疾病痛苦导致的受损或失能、或者以其他方式缓解患者的疾病症状。另外,对于治疗而言,术语“有效的”和“有效性”既包括药理有效性也包括生理安全性。药理有效性是指药物促进患者体内癌症消退的能力。生理安全性是指毒性水平或其他的由于药物施用导致的细胞、器官和或生物体水平上的不良生理效应不良作用)的水平。[0343]作为肿瘤治疗的实例,相对于未治疗的受试者,治疗有效量或治疗有效剂量的药物优选抑制细胞生长或肿瘤生长的至少约20%,更优选地至少约40%,甚至更优选地至少约60%,并且还更优选地至少约80%。在最优选的实施方案中,治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长,即,优选地抑制细胞生长或肿瘤生长的100%。化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下文描述的测定法进行评价。或者,组合物的这种特性可以通过检验所述化合物抑制细胞生长的能力加以评价,这种抑制可以通过本领域技术人员已知的测定法进行体外测量。在本文所述的其他优选的实施方案中,肿瘤消退可以观察到,并且持续的时期为至少约20天,更优选地至少约40天,或甚至更优选地至少约60天。[0344]术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。[0345]如本文中使用的,术语“受试者”包括任何人或非人类的动物。例如,本文所述的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。[0346]如本文中使用的,术语“ug”和“uM”可与“yg”和“μΜ”互换使用。[0347]在以下小节中进一步详细描述本文所述的各个方面。[0348]I·抗GITR抗体[0349]本文中描述了其特征在于特定功能特征或性质的抗体,例如全人抗体。例如,抗体特异性地结合人GITR。另外,抗体可与来自一种或多种非人灵长类动物的GITR如食蟹猴GITR交叉反应。[0350]除了与可溶性和或膜结合的人GITR特异性地结合以外,本文所述的抗体展现以下功能性质中的一者或多者:[0351]a与食蟹猴GITR结合;[0352]⑹刺激或增强免疫应答;[0353]c激活T细胞如通过例如增强的细胞因子分泌和或增殖证明的);[0354]d抑制GITRL与3A9-hGITR细胞上的GITR结合;[0355]e至多部分地抑制GITR配体与活化的T细胞上的GITR结合;[0356]f与人GITR的N端部分中的构象表位结合;[0357]g与糖基化的和未糖基化人GITR结合;以及[0358]h在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性,但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性。[0359]优选地,抗GITR抗体以高亲和力,例如以HT7M或更低、HT8M或更低、HT9M或更低、HTlqM或更低、HT11M或更低、HT12M或更低、HT12M至10_7M、HT11M至10_7M、HTlqM至HT7M或10_9M至HT7M的Kd与GITR结合。在某些实施方案中,如通过Biacore所测定,抗GITR抗体例如以HT7M或更低、HT8M或更低、HT9MInM或更低、10_1°M或更低、HT12M至10_7M、HT11M至10_7M、HTiqM至10_7M、KT9M至HT7M或KT8M至KT7M的Kd与可溶性人GITR结合。在某些实施方案中,如通过流式细胞术和Scatchard图所测定,抗GITR抗体例如以KT7M或更低、KT8M或更低、HT9MInM或更低、HTiqM或更低、HT12M至10_7M、HT11M至10_8M、HTiqM至10_8M、HT9M至10_8M、10—11M至HT9M或HT1t3M至HT9M的Kd与例如活化的人T细胞上的结合的(例如,细胞膜结合的)人GITR结合。在某些实施方案中,如通过FACS所测定,抗GITR抗体例如以HT7M或更低、HT8M或更低、HT9MInM或更低、KTiqM或更低、HT12M至10_7M、KT11M至10_8M、KTiqM至10_8M、KT9M至IT8M、IT11M至IT9M或10_1M至IT9M的EC5q与例如活化的人T细胞上的结合的(例如,细胞膜结合的)人GITR结合。在某些实施方案中,抗GITR抗体以HT7M或更低、HT8M或更低、HT9M111]\〇或更低、10_1或更低、10_12]\1至10_7]\1、10_11]\1至10_7]\1、10_1至10_7]\1、10_9]\1至10_7]\1、或10、至HT7M的Kd与可溶性人GITR结合,并且以HT7M或更低、HT8M或更低、HT9MInM或更低、HTiqM或更低、HT12M至10_7M、HT11M至10_8M、HTiqM至10_8M、KT9M至10_8M、HT11M至HT9M或10至HT9M的Kd或EC5q与细胞膜结合的人GITR结合。[0360]如例如通过FACS测量的(例如,如实施例中所述),抗GITR抗体可以例如以IOOnM或更低、IOnM或更低、IOOnM至0.OlnM、IOOnM至0.InM、IOOnM至InM、或IOnM至InM的EC5Q与食蟹猴GITR结合,例如与膜结合的食蟹猴GITR结合。[0361]抗GITR抗体可刺激或增强免疫应答,例如通过激活Teff细胞、限制Treg细胞对效应T细胞的抑制、耗竭和或抑制肿瘤Treg细胞和或激活例如肿瘤中的NK细胞。例如,抗GITR抗体可激活或共刺激Teff细胞,如通过例如增强的细胞因子例如,IL-2和IFN-γ分泌和或增强的增殖证明的。在某些实施方案中,还提供了CD3刺激。在某些实施方案中,GITR抗体使IL-2分泌增加50%、100%S卩,2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的因数,任选地最大值为至多10倍、30倍、100倍,正如例如在原代人T细胞或表达人GITR的T细胞上所测量的(例如,如实施例中进一步描述)。在某些实施方案中,GITR抗体使IFN-γ分泌增加50%、100%S卩,2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的因数,任选地最大值为至多10倍、30倍、100倍,如例如在原代人T细胞或表达人GITR的T细胞上所测量的例如,如实施例中进一步描述的)。[0362]抗GITR抗体可以例如以10ygml或更低、lygml或更低、0·0lygml至10ygml、0·1ygml至10ygml或O.lygml至lygml的EC5q抑制人GITRL与细胞例如,表达人GITR的3A9细胞上的人GITR结合参见实施例5。[0363]在某些实施方案中,抗GITR抗体仅仅至多部分地抑制人GITRL与细胞例如,活化T细胞上的人GITR结合参见实施例5。[0364]抗GITR抗体可结合表位,例如人GITR的N端部分中的构象表位,例如位于成熟人GITR的氨基酸1至39内的表位(参见实施例9,如例如通过抗体与人GITR的片段(例如人GITR的天然(S卩,非变性片段的结合确定的。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸1至20或位于这些氨基酸内的表位,如例如通过抗体与人GITR的片段[例如,人GITR的天然(即,非变性片段]结合,随后的酶切割或HDX所确定的分别参见实施例11和12。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸3至20PTGGPGCGPGRLLLGTGT,SEQIDN0:217或这些氨基酸内的表位。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸3至20和氨基酸33至40S卩,氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDNO:217和CRDYPGEESEQIDNO:218或这些氨基酸内的表位。在某些实施方案中,抗GITR抗体与糖基化的和未糖基化的人GITR结合。在某些实施方案中,抗GITR抗体结合氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDNO:217和CRDYPGEESEQIDNO:218,如例如使用实施例中列出的方案通过HDX确定的。[0365]抗GITR抗体可与包含本文所述的CDR或可变区的抗GITR抗体例如28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10和或6G10竞争结合GITR或抑制后者的结合)。在某些实施方案中,抗GITR抗体使28F3、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8、19D3、18E10和或6G10与人GITR的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些实施方案中,28卩3、3〇3-1、303-2、266、8厶6、967-1、967-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10和或6G10使抗GITR抗体与人GITR的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些实施方案中,抗GITR抗体使28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10和或6G10与人61了1?的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%,并且28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10和或6G10使抗GITR抗体与人GITR的结合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%例如,双向竞争)。[0366]在某些实施方案中,抗GITR抗体诱导或增强T细胞活化而无需多价交联,如通过例如并不需要FcR结合确定的。在某些实施方案中,抗GITR抗体是多价的,例如二价。在某些实施方案中,抗GITR抗体不是单价的。本文中已显示F’(ab2片段比Fab片段更有效地激活T细胞参见实施例)。[0367]在某些实施方案中,抗GITR抗体的激动剂活性无需经由Fc受体的交联,然而,所述抗GITR抗体与Fc受体的交联相对于未结合Fc受体的相同抗体增强了它们的激动剂活性。[0368]在某些实施方案中,抗GITR抗体具有以下特征中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或12个:[0369]1与可溶性人GITR结合,例如以IOnM或更低(例如,0.OlnM至IOnM的Kd,如例如通过Biacore测量的;[0370]2与膜结合的人GITR结合,例如以InM或更低(例如,0.OlnM至InM的KD,如例如通过Scatchard测量的;[0371]3与膜结合的人GITR结合,例如以InM或更低例如,0.OlnM至InM的EC5Q,如例如通过FACS测量的;[0372]4与食蟹猴GITR结合,例如与膜结合的食蟹猴GITR结合,例如以IOnM或更低(例如,0.OlnM至IOnM的EC5q,如例如通过FACS测量的;[0373]5诱导或增强T细胞活化,比如在CD3衔接存在下例如,在次最佳抗CD3浓度存在下),如通过⑴在表达GITR的T细胞中的IL-2和或IFN-γ产生增加和或(iiT细胞增殖增强证明的;[0374]⑹诱导或增强T细胞活化而无需多价交联;[0375]7在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性,但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性;[0376]⑻抑制GITR配体与GITR结合,例如以lygmL或更低的EC5Q,如例如在利用3A9-hGITR细胞的测定中通过FACS测量的;[0377]⑼至多部分地抑制GITR配体与活化的T细胞上的GITR结合;[0378]10结合成熟人GITRSEQIDNO:4上的构象表位,例如在氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDN0:217和CRDYPGEESEQIDN0:218内的不连续表位;[0379]11与0-连接的和N-连接的糖基化的及未糖基化的人GITR结合;以及[0380]12在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-l、3C3-2、2G6、8A6、9G7-l、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10和或6G10竞争结合人GITR。[0381]抗GITR抗体还可以诱导GITR例如在10分钟、30分钟或60分钟内在活化T细胞例如⑶4+和⑶8+T细胞)中内化以及后续的信号转导,例如p65NF-kB和p38MAP激酶的激活(S卩,磷酸化)。[0382]因此,应理解,如根据本领域已知和本文所述的方法确定的,相对于在抗体不存在时(例如,或在具有不相关特异性的对照抗体存在时观察到的活性,展现这些功能性质中的一者或多者例如,生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性等)的抗体涉及特定活性的统计学显著性差异。优选地,抗GITR抗体诱导的测量参数例如,T细胞增殖、细胞因子产生)的增加实现了所述测量参数在统计学上显著增加至少10%,更优选至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%卿,2倍)、3倍、5倍或10倍,并且在某些优选实施方案中,本文所述的抗体可使测量参数增加大于92%、94%、95%、97%、98%、99%、100%即,2倍)、3倍、5倍或10倍。相反,抗GITR抗体诱导的测量参数例如,肿瘤体积、GITR-L与GITR的结合、肿瘤中的调节性T细胞的量的降低实现了所述测量参数在统计学上显著降低至少10%,更优选至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%,并且在某些优选实施方案中,本文所述的抗体可使测量参数降低大于92%、94%、95%、97%、98%或99%〇[0383]评价抗体对不同物种的GITR的结合能力的标准测定法是本领域已知的,包括例如ELISA、Western印迹和RIA。适合的测定法详细描述于实施例中。还可以通过本领域已知的标准测定法比如通过Biacore分析评估抗体的结合动力学例如,结合亲和力)。评价抗体对GITR的功能性质(例如,配体结合、T细胞增殖、细胞因子产生)的影响的测定法进一步详细描述于下文和实施例中。[0384]在某些实施方案中,抗GITR抗体不是天然抗体、或者不是天然存在的抗体。例如,抗GITR抗体具有不同于天然存在的抗体的翻译后修饰,例如具有更多、更少或不同类型的翻译后修饰。[0385]II·示例性的抗GITR抗体[0386]本文所述的特定抗体是具有如实施例1中所述分离并在结构上表征的抗体28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8和6G10的CDR和或可变区序列的抗体(例如,单克隆抗体),以及与这些抗体的可变区或⑶R序列具有至少80%同一性例如,至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性)的抗体。28F3、19D3、18E10、3C33C3-1和3C3-2、2G6、8A6、9G79G7-1和9G7-2、14E3、19H819H8-1和19H8-2和6G10的Vh氨基酸序列分别列于SEQIDNO:13、26、39、52、71、84、97、115、128*335ψ2区,其中I区具有最显著的氘摄取变化,并且2区是统计学显著的。[1231]实施例13:抗GITR抗体诱导T细胞的IL-2和IFN-γ分泌[1232]通过测量与抗体一起温育的T细胞所分泌的IL-2和IFN-γ来测试抗GITR抗体增强体外T细胞活性的能力。[1233]在渐增量的19D3、18E10和28F3抗体存在下,在抗⑶3单克隆抗体包被的平板上培养异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3Α9细胞系(3A9-hGITR。在用lygml抗CD3抗体克隆145-2C11;BDBiosciences包被的板上培养5xl04个3A9-hGITR细胞,并用指示浓度的抗体处理24小时。如图40中所示,抗体3C3GITR.3、28F3、19D3和18E10都以剂量依赖性方式增强T细胞的IL-2分泌。如预期地,对照hlgGl和hIgG2抗体未增加3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。[1234]鉴于在刺激性⑶3信号存在下抗GITR抗体增强了3A9-hGITR细胞的IL-2分泌,测试了抗体增强用特异性抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的能力。在0.4μΜHEL48-63肽和指示的抗体存在下,将51104个349-1^几1?细胞与2.51104个135.2抗原呈递细胞共培养24小时。如图41Α和41Β中所示,抗体18ΕΠΚ13Η2与28F3相同的抗体)、28F3、3C3和19D3以剂量依赖性方式增强了3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。[1235]在进一步的实验中,在用表达抗⑶3scFv0KT3的CHO细胞刺激的人供体T细胞上测试了28F3对T细胞的IL-2和IFN-γ分泌的影响。所述CHO细胞表达低水平的0KT3以促进次最佳刺激,以便能够观察抗GITR抗体的激动作用。在一组实验中,用表达0ΚΤ3的CHO细胞和抗GITR抗体刺激来自一个供体的⑶3+Τ细胞,并测量IFN-γ分泌,在第二组实验中,用表达0ΚΤ3的CHO细胞和抗GITR抗体刺激来自2个供体不同于⑶3+Τ细胞的供体)的⑶4+T细胞,并测量IL-2和IFN-γ分泌。如下进行实验。根据制造商的方案,利用PanT细胞分离试剂盒Miltenyi编号130-091-156,从分离自Ficoll梯度AmershamBioscience17-1440-03的人PBMC获得全T细胞。对于⑶4+T细胞的实验,根据制造商的方案,利用RosetteSep人⑶4+T细胞富集混合物StemCellTechnology编号15062从人PBMC供体1和2获得CD4+T细胞。将表达抗⑶3scFv0KT3的CHO细胞CH0-0KT3用RPMI培养基洗涤两次并使其经受50KRad剂量的照射。收获细胞并将其以2.5xl05mL重悬于培养基RPMI-1640,补充有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、55ηΜβ-巯基乙醇、ImM丙酮酸钠和lOOUmL青霉素链霉素)中。在96孔TC级平底板Costar中每孔接种2.5xl04个CH0-0KT3细胞和IxlO5个T细胞。将细胞与以20ygmL开始的8点3倍滴定的GITR抗体一起温育。添加20ygmL的无关hlgGl作为同种型对照。包括一个仅有细胞的样品,用来表示没有任何处理的基线活性。在第2天收获每一样品的上清液用于IL-2测量仅针对利用CD4+T细胞的测定法)(BDoptEIAHumanIL-2ELISA试剂盒;BDBioscience编号555190,并且在第3天收获每一样品的上清液用于IFN-γ测量BDoptEIAhumanIFN-gELISA试剂盒;BDBioscience编号555142。[1236]图42B-E中所示的结果表明,来自两个供体的⑶4+T细胞的IL-2和IFN-γ分泌都呈28F3剂量依赖性增加。[1237]还展示了用其他抗GITR抗体刺激的供体T细胞的IFN-γ分泌。如上文所述进行测定。如图42Α中所示,抗体28F3、3C3、19D3和18Ε10都以剂量依赖性方式增强⑶3+Τ细胞的IFN-γ分泌,其中抗体28F3和3C3在这些测试抗体中显示出最大效应。[1238]在另一个实验中,在混合淋巴细胞反应(MLR中观察在抗GITR抗体(具体而言28F3存在下的T细胞增殖。[1239]总的来说,这些数据表明,抗体18E10、19D3和28F3发挥激动性抗GITR抗体的功能,其增强T细胞的细胞因子分泌。[1240]实施例14:抗GITR抗体体外激活T细胞应答不依赖于FcR相互作用[1241]已报导激动性抗TNFR抗体的体内活性需要FcγRIIB共衔接Li等人,Ce11CycIe2012;11:3343-3344。为了确定这种需要是否也适用于抗GITR抗体,如实施例13中所述将3A9-hGITR细胞与LK35.2细胞和HEL48-63肽共培养,用全长抗GITR抗体28F3hIgG2、28F3的Fab’)2片段或28F3的Fab片段处理,并评估mIL-2产生。在图43中列出的结果显示,全长28F3和28F3的Fab’)2片段增强了mIL-2产生,但28F3的Fab片段的作用较弱,从而表明二价衔接而非单价衔接促成了抗GITR抗体28F3的作用。这些结果共同表明,虽然激动性抗GITR抗体的体外T细胞增强作用无需FcγRIIB共衔接,但衔接FcγRIIB受体可增强激动剂活性。可将抗GITR抗体工程改造以增加与FcγRIIB受体的结合,从而增进其激动作用。[1242]实施例15:抗GITR抗体28F3标记人扁桃体中的淋巴细胞[1243]为了确定哪些组织表达GITR,使用抗GITR抗体28F3对各种组织中的GITR进行免疫组织化学检测。在非淋巴组织包括心脏、肝、肺、肾、皮肤、周围神经、甲状腺、睾丸、前列腺)中未发现特异性染色。仅在淋巴样组织包括扁桃体、脾和胸腺和富含淋巴的组织结肠、胃、子宫的固有层)中的淋巴细胞和或单核细胞的离散亚群中观察到阳性染色。在扁桃体中的染色示于图44中。在滤泡间滤泡旁区和生发中心中的离散淋巴细胞中观察到阳性染色。离散的单核细胞簇在上皮下方和上皮浸润淋巴细胞也呈阳性染色。[1244]实施例16:变体抗GITR同种型在MC38肿瘤模型中的抗肿瘤活性[1245]DTA-1是一种激动性大鼠抗小鼠GITR抗体(Shimizu等人,2002;eBioscience,SanDiego,CA。已显示这种IgG2b抗体在B16黑色素瘤治疗过程中调节Treg和Teff。另外,DTA-I的全部效应需要Teff和Treg两者的GITR表达。Cohen等人(2010表明,虽然通过DTA-I的GITR连接并不全局消除1^抑制活性,但它可减弱1^肿瘤浸润,并导致肿瘤内Treg内的Foxp3表达丧失,提示局部化的抑制消除。净结果是肿瘤内Teff:Treg比率提高以及肿瘤内更好的Teff活化和功能。DTA-I阻断GITR与GITR配体GITRL之间的相互作用,并且这种可溶性抗体在促进体外细胞应答中有效。它还在各种肿瘤模型中有效抑制肿瘤生长例如,参见Turk等人,2004;Cohen等人,2010。[1246]a实验MC38第1号[1247]在分期的MC38结肠腺癌肿瘤模型中评估不同抗GITRDTA-I同种型的抗肿瘤活性。给各只C57BL6小鼠皮下注射2XIO6个MC38肿瘤细胞。7天后,将小鼠随机分成5个治疗组,且在第7、10和14天如下所述IP施用200yg剂量的200μ1体积的测试抗体:组1:小鼠1861对照(186;组2:抗61了1?大鼠1862匕六130了六-冗213;组3:抗61了1?小鼠1861六130了六1161;和组4:抗GITR小鼠IgG2aAbDTA-mG2a。在第15天收获肿瘤和脾脏。[1248]图45C显示,IgGl抗GITR治疗的肿瘤与用小鼠IgGl对照治疗的肿瘤(图45A以相当的速率生长,到监测小鼠结束时,10只小鼠没有一只是无肿瘤的(TF。然而,DTA-rG2b图45B和DTA-mG2a图45D显著降低了肿瘤生长的速率,其中10只小鼠中分别有3只和2只是无肿瘤的TF。[1249]用不同的抗GITR同种型治疗的组的小鼠的平均肿瘤体积和中位肿瘤体积的变化绘制在图46A和46B中。这些绘图证实在图45中所示的小鼠个体数据:抗GITR抗体的IgG2b同种型对MC38肿瘤生长展现最有效的抑制作用,IgG2a同种型的效力仅仅略弱。IgGl同种型显示很小的肿瘤生长抑制作用,其中平均和中位肿瘤体积类似于用小鼠IgG对照治疗的小鼠。[1250]还确定了抗GITR同种型对TIL和脾中的MC38T细胞亚群的作用。比较了用不同的抗GITR同种型治疗的小鼠的MC38TIL和脾中的T细胞亚群的群体。在脾中,DTA-m2a和DTA-r2b引起⑶8+细胞水平轻度降低,而9D9-m2a抗CTLA-4抗体和DTA-ml未改变⑶8+T细胞水平图47A。测试的同种型变体对脾中的⑶4+或⑶4+F〇xp3+细胞的百分比均无显著影响(图47B和47C〇[1251]在TIL中,9D9-m2a相比于两个小鼠IgGl对照引起⑶8+细胞的百分比增加至少2倍图47DdTA-n^a具有较不显著的作用,其使⑶8+细胞的百分比增加约50%,而DTA-ml和DTA-r2b与小鼠IgGl同种型对照相比并未引起⑶8+细胞百分比增加,或仅引起⑶8+细胞百分比略微增加(图47D。与小鼠IgGl同种型对照相比,9D9-m2a引起⑶4+细胞百分比小量增加,而DTA-ml未引起⑶4+变化(图47E。相比之下,与两个小鼠IgGl同种型相比,DTA-m2a和DTA-r2b两者都使CD4+百分比降低40%至50%图47E。[1252]对于TIL中的⑶4+Foxp3+Treg水平观察到最显著的影响。虽然DTA-ml对这个T细胞群没有影响,但与IgGl同种型和DTA-ml相比,9D9-m2a和DTA-m2a诱导了CD4+Foxp3+Treg水平降低约6倍(图47F。这些数据证明,抗GITR的IgG2a变体明确地降低了肿瘤环境中的Treg水平。因此,IgG2a抗GITR同种型诱导了肿瘤部位的CD8+Teff增加和W咸少,导致Teff与Treg的比率升高,该比率指示了稳健的抗肿瘤活性。与IgGl对照相比,DTA-r2b也诱导了CD4+F〇xp3+Treg水平显著降低,但不如由9D9_m2a和DTA_m2a诱导的降低那样显著,这与大鼠IgG2bFe区与鼠活化性FcγR的结合较低是一致的。这些数据证明,激动剂抗GITR抗体的耗竭活性需要活化性FcγR的衔接。[1253]对MC38TIL和脾中T细胞的不同亚群的GITR表达水平的流式细胞术测量显示,GITR在肿瘤部位的Treg上表达最高,表达水平高于外周中的Treg或肿瘤部位的CD8+Teff上的表达水平,肿瘤部位的CD8+Teff进而比外周中CD8+或CD4+Teff展现更高的表达。在肿瘤部位的CD4+Teff上观察到GITR表达的最低相对水平。这些数据提示了这样一种机制,通过该机制,T细胞耗竭活性有助于刺激T细胞应答并由此增强Fc融合蛋白的抗肿瘤效能,条件是Fc融合蛋白的靶标在肿瘤部位的Tre3g上相对于靶标在肿瘤部位的Trff上的表达是高表达的,并且Fc融合蛋白与介导靶细胞耗竭的活化性FcR结合。[1254]b实验MC38第2号[1255]由于DTA-I变体遇到了聚集作用(商业获得的初始形式的DTA_r2b除外),重新工程改造了新一组同种型变体,以获得不会聚集的DTA-I抗体。经追查,观察到的聚集作用是由于在工程改造的同种型变体的轻链中无意掺入了一个额外的氨基酸,通过去除这个外来氨基酸解决了这个问题。在这个2号实验中使用经重新工程改造的抗体。使用分期的MC38模型评估经重新工程改造的抗GITRDTA-1;GITR.7系列)同种型的抗肿瘤活性。给各只C57BL6小鼠皮下植入2XIO6个MC38细胞。7天后,将小鼠随机分成7个治疗组以便具有相当的约148mm32的平均肿瘤体积,在第7、10和14天如下以20^8剂量例外的是111186对照以20^8的剂量施用)IP施用测试抗体:组1:小鼠IgGl对照OnIgG或“同种型;组2:抗GITR小鼠IgGlAbmGITR.7.mgl;组3:抗GITR小鼠IgGlD265A同种型(mGITR.7.mgl-D265A;组4:抗61丁1?小鼠1862厶1311161了1?.7.11^2;组5:抗61丁1?小鼠1862匕厶1311161了1?.7.11^213;和组6:抗61丁1?大鼠186264131116111?.71213或014-1-冗213。在第15天收获肿瘤和脾脏。[1256]图48B和48C显示,IgGl和IgGl-D265A抗GITR治疗的肿瘤与用小鼠IgGl对照治疗的肿瘤以相当的速率生长(图48A。在每种情况下,到移植后35天监测小鼠结束时,9只小鼠都不是为TF。然而,类似于1号MC38实验中的结果,mGITR.7.mg2a图48D诱导了最大的肿瘤生长抑制,其中9只小鼠中的2只为TF。小鼠和大鼠抗GITR-2b抗体也以相似的程度显著降低了肿瘤生长速率(图48E和48F,不过在移植后35天时,大鼠2b抗体产生了1只TF小鼠,而小鼠2b抗体未产生任何TF小鼠。[1257]平均肿瘤体积和中位肿瘤体积变化显示在图49A和49B中。趋势类似于MC38实验1中所观察到的,不同之处在于IgG2a抗GITR同种型是抑制MC38肿瘤生长最有效的,而IgG2b同种型展现显著,但较前者为低,的抑制肿瘤生长的效力。与小鼠IgG对照相比,IgGl和IgGl-D265A同种型显示低水平的肿瘤生长抑制。[1258]不同的抗GITR同种型对经治疗小鼠的TIL和脾中Treg群体的影响显示在图50中。如1号实验中所观察到的,测试的同种型变体对脾中CD4+FOXP3+T的百分比均无巨大影响:最强的影响是用大鼠抗GITRIgG2b同种型治疗诱导的小于40%的增加,而小鼠抗GITRIgG2b同种型略微降低了CD4+F〇Xp3+Tre^百分比。测试的其他抗GITR同种型和抗CTLA-4IgG2a9D9-mG2a抗体略微增加了1^的百分比(图50A。[1259]相比之下,在TIL中,除IgGl同种型(其与同种型对照相比未引起变化之外,测试的所有抗体都诱导了显著的Treg百分比降低。与IgGl同种型相比,抗CTLA-4抗体9D9-mG2a引起CD4+F〇xp3+IWK平降低约4倍;抗GITR小鼠2a和2b同种型以及大鼠2b同种型都使将IWK平降低约2倍,并且IgGl-D265A突变体引起略微较低的降低(图50B。这些数据证实了在1号实验中观察到的影响,证明抗GITRmG2a、mG2b和rG2b同种型在肿瘤环境中诱导了显著的与肿瘤生长抑制相关的Tre3g耗竭。[1260]在2号MC38实验中获得的数据与在1号实验中获得的数据大体上一致,这表明抗体的聚集并未过度干扰抗体的活性。聚集的抗体可能在小鼠中被快速清除,因此抗体聚集在本发明的体内测定法中可能不是很重要的问题。[1261]实施例17:变体抗GITR同种型在分期的SalN肿瘤模型中的抗肿瘤活性[1262]还在AJ小鼠SaIN肉瘤模型中评估了抗GITR的抗肿瘤活性。每植入给小鼠皮下注射2XIO6个SalN细胞。7天后,确定肿瘤体积并将小鼠随机分到治疗组中以便具有相当的平均肿瘤体积约75mm32。在第7、10和12天以20^8剂量1?施用如实施例10的1号1^38实验中所述的工程改造为具有不同的同种型的抗GITRDTA-I抗体。[1263]对肿瘤生长的影响显示在图51中。用IgG2a抗GITR抗体治疗完全抑制了肿瘤生长,且到植入后约第20天时所有10只小鼠都为TF图51B,并且大鼠IgG2b同种型具有类似作用,其中到约第20天时10只小鼠中的9只为TF图51C。与IgGl同种型对照治疗的肿瘤的未抑制生长(图51A相比,IgGl图51D和IgGlD265A图51E同种型以一定的程度抑制肿瘤,但比用mIgG2a和rIgG2b同种型观察到的抑制小得多。图52A和52B中所示的平均肿瘤体积和中位肿瘤体积变化证实了mIgG2a和rIgG2b抗体对肿瘤生长的几乎完全的抑制作用,与之相比,mlgGl和mIgGl-D265A同种型展现的肿瘤生长抑制低得多。[1264]总的来说,图51和52中的数据确证了用MC38肿瘤模型(实施例10获得的数据,其显示,抗GITRmIgG2a和rIgG2b同种型展现强有力的抗肿瘤活性,而与之相比,mlgGl和mIgGl-D265A同种型展现的抗肿瘤活性低得多。mlgGl和D265A变体抗体在SalN模型中的抗肿瘤活性与没有Treg耗竭的GITR的激动作用一致。[1265]不同的抗GITR同种型对经治疗小鼠的SalNTIL和脾中Treg群体的影响显示在图53中。测试的所有抗GITR同种型变体均诱导了脾中⑶4+F〇Xp3+TreyK平的约20-40%的相对较小的增加。用小鼠抗GITRIgG2a同种型治疗诱导的增加最高,该同种型治疗引起的增加与用抗CTLA-4IgG2b9D9-G2b和IgGl-D265A9D9-G1-D265A抗体治疗相同(图53A。在这项GITR研究中使用后一种抗CTLA-4同种型作为阳性对照,因为先前已用IgG2b同种型观察了Treg耗竭。[1266]与在外周中的Treg效应相比,抗GITRm2a和r2b同种型以及抗CTLA-42b同种型全都使肿瘤部位的Treg水平降低至少3.5倍(图53B。抗GITRIgGl同种型和IgGl-D265A突变体两者都诱导了较小的约35%的Treg百分比降低,而抗CTLA-4IgGl-D265A突变体未引起TIL中Treg百分比变化(图53B。因此,如在MC38肿瘤模型中观察到的,抗GITRmG2a和rG2b同种型在肿瘤环境中诱导了显著的远远超过IgGl和IgGl-D265A抗体所诱导的Treg耗竭,这与肿瘤生长抑制相关。[1267]实施例18:抗GITR抗体和抗H1拮抗剂抗体联合的协同活性[1268]为了确定是否可通过将DTA-I抗体与拮抗PD-I—种提供抗肿瘤机制的抑制信号的分子的抗体联合获得协同抗肿瘤作用,使用分期的MC38结肠腺癌模型评估了抗体组合对肿瘤体积的影响。在第7、10和14天将小鼠用㈧对照mlgGl、⑻mlgG+DTA-l、⑹mlgG+PD-1克隆4H2,BMS和⑼PD-1+DTA-1治疗。[1269]对肿瘤生长的影响显示在图54中。用DTA-I抗体或抗PD-I抗体治疗在一定程度上单独地抑制了肿瘤生长,其中10只小鼠中的2只为TF。相比之下,到第30天时,DTA-I抗体与抗PD-I抗体联合大幅增加了TF小鼠的数目,其中10只小鼠中的7只为TF。如预期的那样,施用对照mlgG的小鼠中无TF小鼠。[1270]这些结果表明,激动性抗GITR抗体与拮抗性抗Η-1抗体的联合以协同方式起作用来抑制肿瘤生长。[1271]实施例19:CDR氨基酸突变对结合亲和力的影响[1272]这个实施例显示,28F3的VH⑶R3中的某些氨基酸残基可突变成另一氨基酸而不显著影响其结合亲和力。[1273]通过使VH⑶R3中的以下氨基酸中的一个或多个突变产生了28F3的48个突变体:M102、D106和Mill根据SEQIDN0:13编号),并测试了以下活性:与3A9-hGITR细胞的结合、及在平板结合的抗CD3存在下3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。如上文所述进行实验。[1274]结果显示在图55A和55B与3A9-hGITR细胞的结合)、图56A-FIL-2分泌)以及表7中。[1275]表7:CDR氨基酸突变对结合亲和力的影响[1279]结果表明,几种突变体具有与28F3相当的结合及活性,而其他突变降低了结合和或IL-2分泌。以下突变体具有相当的结合和活性数据:M98V;M98VD106E;M98LD106E;M98ID160EjPM98AD106E。[1280]实施例20:恒定区修饰对GITR抗体激动剂活性的影响[1281]这个实施例证明,包含IgG2铰链的GITR抗体相对于具有IgGl铰链的相同抗体具有增加的诱导T细胞的IL-2和IFN-γ分泌的能力。[1282]在上述CH0-0KT3和3Α9测定中已观察到,相比于其中重链恒定区转换成IgGl或无效应子IgGlIgGl.1的重链恒定区的相同抗体,具有IgG2恒定区的杂交瘤衍生的抗体更强有力地刺激细胞因子分泌。因此,在这些测定中进一步测试了IgG2恒定区或铰链对抗GITR抗体的影响。[1283]将抗人GITR抗体的重链可变区与以下重链恒定区连接:[1284]表8:例示的抗GITR抗体的恒定区构型[1285][1287]首先,比较这些GITR抗体的结合亲和力与具有IgG1铰链的GITR抗体的结合亲和力。如实施例2中所述确定结合亲和力。如图57中所示,所有三种具有IgG2铰链的GITR抗体对活化T细胞的亲和力与具有IgGl或IgGl.1恒定区的两种GITR抗体相似。[1288]其次,测试了具有IgGl恒定区或IgG2铰链IgGlFc结构域的GITR抗体诱导用表达OKT3的CHO细胞刺激的T细胞的IL-2和IFN-γ分泌的能力,如实施例13中所述。如图58A和58Β中所示,具有IgG2铰链IgGlFc结构域的抗体(“抗GITR.G2.gif”)比具有IgGl恒定区的抗体(“抗GITR.gif”)以更高的程度诱导了T细胞的IFN-γ和IL-2分泌。利用这些恒定结构域的无效应子型式获得了相似的结果图58C。[1289]为了进一步证实包含IgG2铰链的抗GITR抗体增加了T细胞活化,以不同的实验形式测试了IL-2分泌。在这个实验中,测试了GITR抗体诱导3A9-hGITR细胞异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系)的IL-2分泌的能力,如实施例13中所述。如图59中所示,所有具有IgG2铰链的抗体抗GITR.g2、抗GITR.g2.gif和抗GITR.g2.gl.If相比于其含有IgG1恒定区的对应物(“抗GITR.gIf和抗GITR.gI.If”)均以更高的程度诱导了3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。[1290]这些结果共同提示,具有IgG2铰链和g1或g1.1恒定区的抗GITR抗体比具有IgGl铰链的相同抗体更有效力。一种可能的机理可以解释含有IgG2铰链的GITR抗体的效果的改善,即:相对于包含IgGl铰链的相同抗体,这些抗体在细胞表面的内化增加和或复合物形成增加。[1291]实施例21:抗GITR抗体诱导的增殖是Teίΐ细胞固有的[1292]GITR在小鼠和人调节性TTreg细胞上表达。文献中的数据已显示,激动性抗GITR抗体在Treg细胞存在下驱动小鼠⑶4+Foxp3-效应TTeff细胞增殖。另外,已经表明,这种效应的驱动主要借助于抗GITR抗体与TefT细胞的结合,而不是对Treg细胞抑制功能的直接作用。其他出版物显示,抗GITR抗体驱动Treg细胞增殖,并且可诱导以Foxp3丧失为特征的Treg细胞谱系不稳定性。[1293]为了检验抗GITR抗体对Treg细胞功能的影响,进行了小鼠Treg细胞抑制测定,其中在APC和滴定数目的Treg细胞存在下用抗⑶3和抗小鼠GITRmAbDTA-1的各种同种型刺激Teff细胞。结果显示,与同种型对照相比,DTA-I抗体治疗增加了增殖。此外,IgGl、2a、2b和惰性IgGlD265A同种型在增加Teff细胞增殖中都有效,由此证明FcR结合对于这个系统中的抗GITR抗体功能是不需要的。[1294]根据前述实验,尚不清楚增加的Teff增殖是否是由于作用于Treg和或Teff细胞的抗GITR抗体所致。为了解决这个问题,使用人GITR“敲入”(huGITRKI小鼠。在这些小鼠中,编码小鼠GITR的基因Tnfrsfl8被替换为人TNFRSF18基因,并且以类似于野生型小鼠中的muGITR的方式表达人GITR;人GITR在Teff和Treg细胞上都表达,其中在后者上的水平较高。发现抗人GITRmAb28F3能够驱动huGITRKI小鼠的Teff细胞的增殖。由于28F3结合人GITR而非小鼠GITR,故有可能设定一种Treg抑制测定系统,其中Teff和Treg细胞上的GITR可被有差别地靶向。这个系统也允许检验28F3与人IgGl或惰性IgGl.IFc区之间的功能差异。[1295]基于huGITRKI和WT小鼠的CD4和CD25表达,分选Treg和Teff细胞。将WT和huGITRTreg及Teff细胞混合组合,所述组合允许用28F3进行Treg或Teff细胞huGITRKITeff细胞与野生型Treg细胞等)的单区室革E向(unicompartmentaltargeting。作为对照,包括其中28F3可与Treg和Teff细胞两者都结合、或都不结合的情况。在APC以及28F3IgGl、28F3IgGl.1或同种型对照存在下,用抗⑶3刺激含有TefT和Treg细胞的培养物。[1296]结果提供在图60中。如预期地,当28F3可结合Treg和Teff细胞两者时,观察到TefT细胞增殖增加,并且这种效应在28F3仅可结合Teff细胞的条件下得以维持。相比之下,当28F3仅能够结合Treg细胞时,Teff增殖相对于同种型对照没有增加。关于同种型,在28F3显示作用的条件下,IgGl与IgGl.IFc之间没有差异。这与上述显示抗GITR激动作用无需Fc交联的数据一致。总的来看,在这个系统中,抗GITR抗体主要通过其调节TefT细胞功能的能力起作用,而不是通过抑制Treg细胞阻遏物的能力起作用。然而,这并不排除GITR信号转导对体内Treg细胞的作用,因为抗GITR抗体可驱动Treg细胞增殖或为ADCC或ADCP提供Treg特异性靶标。[1297]实施例22:抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC[1298]使用NK92CD16细胞或原代NK细胞作为效应子评估28F3.IgGlf和28F3.IgGl.If的体外ADCC活性,使用多种已知表达GITR的细胞作为靶标。[1299]在测定之前三天,通过阴性选择分离靶⑶4+和⑶8+T细胞亚群,并通过⑶25阳性选择从⑶4+T细胞进一步分离Treg。将T细胞亚群中的每一者用⑶2⑶3⑶28珠子MiltenyiBiotec刺激三天以诱导GITR上调。在测定之前一天,通过阴性选择(StemCellTechnologies公司)从新鲜PBMC分离原代NK细胞,并在补充有500IUmL重组IL-2RDSystems和IuM氢化可的松(StemCell的MyeloCultH5100培养基(StemCell中温育过夜。在测定当天,在lugmL28F3.IgGlf和28F3.IgGl.If存在下将效应细胞原代NK细胞或NK92⑶16与钙黄绿素AM标记的活化T细胞以指定的效靶比温育。[1300]使用原代NK细胞或NK92CD16细胞作为效应子,28F3.IgGl诱导了活化CD4+效应T细胞和Treg细胞溶解,而观察到较少的活化CD8+T细胞溶解(图61。如预期,使用NK92或原代NK细胞作为效应子,28F3.IgGl.1未介导任何靶细胞的ADCC。由此可见,28F3.IgGl诱导了活化CD4+效应T细胞和Treg细胞溶解,并且诱导了较低程度的活化CD8+T细胞溶解,并且由28F3.IgGl诱导的溶解水平似乎与靶细胞上的GITR表达水平成正比。[1301]实施例23:人GITR敲入小鼠中28F3.IgGl抗体的活性[1302]本实施例显示,在具有人免疫系统和人GITR蛋白的C57BL6小鼠中的MC38肿瘤中,28F3.IgGl和28F3IgGl.1具有抗肿瘤活性,并且28F3.IgGl的抗肿瘤活性较强。[1303]人GITR敲入小鼠的生成:对C57BL6小鼠进行遗传工程改造以表达人GITR细胞外结构域ECD而不是小鼠GITRECD,从而保持小鼠跨膜及细胞质序列完整。通过用抗人GITR抗体对抗CD3CD28活化的脾细胞进行染色证实人小鼠嵌合GITR的表达。[1304]在具有10%热灭活胎牛血清FBS、2mML-谷氨酰胺、4.5gL45%葡萄糖(IOmLL和ImM丙酮酸钠(IOmLL的DMEM培养基中培养MC38细胞。将细胞每2天以1:10分装。使用两个小鼠群组,且对于两个群组而言,均使用Ι-cm3注射器和25号半英寸针在每只小鼠的右胁腹皮下植入在〇.2mLPBS中的75万个MC38细胞。对于群组1,在植入后第7天,根据肿瘤体积LXWXH2将40只小鼠随机分成3个组,每组12-13只小鼠。所有组都具有约174mm32的平均肿瘤体积。在第7、10和14天,以10mgkg施用媒介物对照或mAb。对于群组2,在植入后第7天,根据肿瘤体积LXWXH2将10只小鼠随机分成2个组,每组5只小鼠。所有组都具有约6911111132的平均肿瘤体积。在第7、10和14天,以1〇11^1^施用媒介物对照或28?3.]^111^13。[1305]以表9中概述的浓度和日期向小鼠腹膜内(IP给药。[1306]表9·[1308]每周两次测量肿瘤和体重直至研究终止。利用Fowler电子数字卡尺62379-531型;FredV.Fowler公司,Newton,MA以3维测量肿瘤,且使用来自StudylogSystems公司SouthSanFrancisco,CA的StudyDirector软件以电子方式记录数据。[1309]在这项肿瘤研究中,在植入后第52天将群组1终止。使用MicrosoftExcel计算肿瘤体积和体重的平均值、标准偏差SD和中位值。分别在100%和至少60%的研究动物保留在每个治疗组中时计算平均值和中位值。在第15天从群组2中的小鼠采集肿瘤。[1310]结果表明,在肿瘤植入后第22天,即在研究中的所有小鼠均存活时的最后一天,与同种型对照抗体相比,1〇11^1^剂量的28?3.1861对此38异种移植物显示出67%的平均肿瘤生长抑制(TGI。按照治疗组将肿瘤TGI总结在表10中。按照治疗组将肿瘤生长曲线显示在图62A-62C中。按照治疗组将平均和中位肿瘤生长曲线提供在图63A-63B中。在任何治疗组中的毒性都不明显,因为平均和中位体重变化小于20%。随着时间过去的小鼠体重和百分比变化显示在图64A-64B中。[1311]表10.[1312][1313]结果显示,在植入后第22天,28F3.IgGl具有67%的TGI,而28F3.IgGl.If具有22%的TGI,表明两种抗体都降低了在MC38肿瘤模型中的肿瘤生长。另外,结果提示,28F3.IgGl的Fc结合在MC38肿瘤模型中增强了抗肿瘤效力。[1314]为了研究28F3.IgGl对T细胞群体具有的影响,在植入后第15天从每个治疗组中的5只小鼠米集组织。在86111:16麻03031:〇0丨88〇^1:〇11¥1;[]^6115^,3110丨68〇,0六)上处理脾和肿瘤。使用流式细胞术(FACS对单细胞悬液进行T细胞标志物染色。在FortessaBDBiosciences,SanJose,Ca上通过流式细胞术检测抗体焚光,并且用计算机程序FlowjoFlowjo,LLC,Ashland,OR分析结果。[1315]在图65和66中所示的结果显示了相对于同种型对照的降低的Treg细胞百分比,这与用28F3.IgGl治疗的小鼠中的耗竭一致(图65。相反,在28F3.IgGl组中的⑶8+T细胞百分比有增加(图66。[1316]因此,与同种型对照相比,在用28F3.IgGl治疗的小鼠中的免疫监测提示,可通过Treg耗竭和⑶8+T细胞增加来介导TGI。[1317]实施例24:交联28F3.IgGl增加其效力[1318]本实施例显示,交联28F3.IgGl可增加其增强T细胞的IFN-γ分泌和促进T细胞增殖的效力。[1319]在不同浓度的抗GITR抗体或对照试剂存在下,将T细胞与CH0-0KT3细胞或CHO-0ΚΤ3-⑶32a®共培养,并测量干扰素-γIFN-γ分泌和细胞增殖的水平。CH0-0KT3-⑶32®细胞系具有很高水平的Fc受体CD32a、以及相比于其亲本CH0-0KT3克隆的稍微较高的0ΚΤ3表达。[1320]如下进行测定。根据制造商的方案,利用CD4T细胞分离试剂盒Lifetechnologies,目录号113.31D和CD25微珠Miltenyi,目录号130-092-983,从分离自Ficoll梯度AmershamBioscience17-1440-03的人PBMC获得应答T细胞。将表达抗CD3scFv0KT3的CHO细胞CH0-0KT3或表达抗CD3scFv和CD32a的CHO细胞用RPMI培养基洗涤两次并使其经受50KRad剂量的照射。收获细胞并将其以2.5xl05mL重悬于培养基RPMI-1640,补充有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、55ηΜβ-巯基乙醇、ImM丙酮酸钠和lOOUmL青霉素链霉素)中。在96孔TC级平底板Costar中每孔接种2.5χ104个CHO细胞和IxlO5个T细胞。将细胞与以20ygmL开始的8点4倍滴定的GITR抗体一起温育。添加20ygmL的无关hlgGl作为同种型对照。包括一个仅有细胞的样品,用来表示没有任何处理的基线活性。在第3天从每个样品采集上清液用于IFN-γ测量BDoptEIAhumanIFN-gELISA试剂盒;BDBioscience编号555142。通过3H-胸苷掺入评估最后8小时温育的细胞增殖。在图67和68中所示的结果表明,在28F3.IgGl存在下,相对于那些与CH0-0KT3细胞共培养的细胞,与CH0-0KT3-CD32aS共培养的T细胞分泌更多的IFN-γ图67。如预期,对于无效应子28F3.IgGl.If抗体其不与⑶32a结合未观察到显著差异。另外,在28F3.IgGl存在下,相对于那些与CH0-0KT3细胞共培养的细胞,在与CH0-0KT3-CD32a®共培养的T细胞中观察到更多的T细胞增殖;对于无效应子28F3.IgGl.If抗体并未观察到这种效应(图68。因此,交联28F3.IgGl增加了其增强T细胞的IFN-γ分泌和促进T细胞增殖的效力。利用表达较低水平的CD32a的CH0-0KT3细胞也观察到这种对T细胞增殖的增强效应。与GITR.6gl.If可溶时相比,其在交联时显示更高的IFN-γ水平。这可能是0KT3在CH0-0KT3-CD32aS细胞上相对于CH0-0KT3细胞稍微较高的表达水平的反映。用交联的GITR.6glf观察到的增加大于用惰性同种型所观察到的增加,提示了交联的正面益处。在可溶性抗体展示很小的相对于背景的激动作用的情况下,Glf型式即使在低剂量下也促进了高水平的IFN-γ,再次提示了交联的正面作用。[1321]由此可见,28F3.IgGl和无效应子28F3.IgGl抗体两者都可刺激IFN-γ产生并刺激T细胞增殖,然而,交联28F3.IgGl进一步增进了其增强T细胞的IFN-γ分泌和促进T细胞增殖的效力。[1322]实施例25:IgG2CHl增强GITRAb诱导的CD4+T细胞的IL-2分泌[1323]本实施例显示,相对于具有IgGl同种型的CHl结构域的抗体,IgG2同种型的CHl结构域增强了抗GITR抗体诱导的T细胞活性。[1324]将表11中所示的修饰的重链恒定区与抗GITR抗体的可变区连接。将供体⑶4+T细胞与表达〇KT3-SCFv的CHO细胞和各种抗GITR抗体一起温育,并测量分泌的IL-2的水平。过程如实施例20所述。[1325]表11:修饰的重链恒定区:[1326][1327]图69中所示的结果表明,除了IgG2同种型的铰链之外,具有IgG2同种型的CHl结构域的所有抗GITR抗体在刺激⑶4+T细胞的IL-2分泌方面比具有IgGl铰链和CHl者更有效。[1328]因此,本实施例显示,相对于不具有IgG2同种型的铰链和或CHl结构域的相同抗体,激动性抗GITR抗体中IgG2铰链和IgG2CHl结构域的存在进一步增强了该抗体的激动剂活性。相对于具有IgG2同种型铰链但非IgG2同种型CHl的抗体,具有IgG2同种型的铰链与CHl结构域的抗体具有更强的激动剂作用。另外,相比于具有来自IgGl同种型的CHl结构域的抗体,具有来自IgG2的CHl结构域的抗体具有更强的激动剂活性。相比于具有来自IgGl同种型的CHl与铰链的抗体,具有来自IgG2的铰链和来自IgGl的CHl结构域的抗体具有更强的激动剂活性。[1329]实施例26:Fc受体与具有工程改造的恒定结构域的抗体结合[1330]本实施例证明,对于具有包含IgG2的CHl和铰链的修饰的重链恒定区的抗体,当所述抗体含有IgGl的CHl和CH3结构域时,其与FcγR结合。[1331]除了通过可变结构域结合抗原之外,抗体还可以通过与恒定结构域的相互作用来衔接Fc-γ受体FcgR。这些相互作用介导效应子功能,比如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用ADCP。对于IgGl同种型而言,效应子功能活性高,但对IgG2和IgG4很低或不存在,因为这些同种型对FcgR具有较低的亲和力。另外,可以通过恒定区内的氨基酸残基突变来修饰IgGl的效应子功能,以改变FcgR亲和力和选择性。[1332]使用包括Biacore表面等离子体共振SPR和Fortebio生物层干涉测量法BLI的生物传感器技术来研究抗体与Fcγ受体FeγR或FcgR的结合。在25°C下在BiacoreTlOO仪器GEHealthcare上进行SPR研究。使用EDCNHS将来自鼠抗6xHis抗体的Fab片段以约3000RU的密度固定在CM5传感器芯片上。使用30秒的接触时间通过C末端his标签以IOulmin捕获各种带his标签的FcgR7ugml,并且在IOmMNaP04、130mMNaCl、0.05%p20PBS-TpH7.1的运行缓冲液中评估I.ΟμΜ抗体的结合。用于这些实验的FcgR包括⑶64FcgRI、CD32a-H131FcgRIIa-H131、CD32a-R131FcgRIIa-R131、CD32bFcgRIIb、CD16a-V158FcgRIIIa-V158、CD16b-NAlFcgRIIIb-NAl和CD16B-NA2FcgRIIIb-NA2。在IOmMNaP04、130mMNaCl、0.05%p20PBS-TpH7.1中,在FortebioOctetRED仪器(Pall,Fortebio上在25°C进行BLI实验。在蛋白A包被的传感器上从未稀释的表达上清液中捕获抗体,随后与ΙμΜ1^032-!1131、1^0323-1?131、1^03213、11〇163-¥158或0.1以]\111〇64分析物结合。[1333]首先,制造含有修饰的IgGlFc结构域的抗体,其包含取代S267ESE和S267EL328FSELF以及被称为¥4、¥7、¥8、¥9和¥12的突变卩2380、卩2716、!12680、厶3301?、62370、E233D的各种组合。通过BiacoreSPR研究这些抗体的结合,与IgGlf、IgG2.3IgG2-C219S和IgG4.1IgG4-S228P抗体以及经过工程改造以降低与所有FcgR结合的IgGl.If进行比较。图70中所示的结果证明了IgGlf、IgG2.3和IgG4.1以及突变的IgGl抗体的预期FcgR结合特性,其包括:SE和SELF的CD32a-H131、CD32a-R131和CD32b结合增加,以及相对于CD32a-H131和CD32a-R131,¥4、¥7、¥8、¥9和¥12突变体对〇3213的选择性增加(图70。[1334]使用下一组构建体将效应子功能工程改造为效应子功能阴性的IgG2同种型。对于这项研究,在IgG2.3恒定区或称为IgG2.3G1-AY的IgG2.3IgGlf杂合体的背景下引入上述突变表12。抗体以小规模表达为上清液的形式,并使用FortebioOctet生物层干涉测量法生物传感器技术测试抗体与FcgR的结合。由于抗体在上清液中以低浓度存在,所以通过使用蛋白A包被的传感器从上清液中捕获抗体,然后在溶液中结合FcgR分析物来进行实验。还包括纯化的上清液对照IgGlf包括野生型IgGl、SE、P238D、V4和V12抗体用于比较,这些对照抗体中的每一种均显示预期的FcgR结合特性(图71JgG2.3抗体也显示出预期的结合谱,仅与CD32a-H131有明显的结合。然而,将S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D或E233D突变引入IgG2.3的所有突变都不能概括相应的工程改造的IgGlmAb的FcgR亲和力(图71。相比之下,IgG2.3Gl-AY构建体能够完全保留野生型IgGl的FcgR结合特性,同时保留IgG2.3的CHl和铰链区。另外,含有S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D和E233D的所有IgG2.3Gl-AY突变体均显示与含有相同突变的IgGl型mAb相当的FcgR结合特性(图71。这证明了具有与野生型或突变型IgGl的效应子功能相结合的IgG2的CHl和铰链区的抗体的成功工程改造。[1335]表12:工程改造的IgG2构建体[1336][1337]通过如下方式进一步探索这个工程改造策略:产生具备IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-S267EIgG2·3G1-AY-V27以及IgG2-B型变体(IgG2·5G1-AY和IgG2·5G1-AY-V27格式的其他抗体、以及含有IgGl和IgG2恒定结构域的不同组合的其他杂合抗体,并且使用BiacoreSPR技术测试这些抗体与抗hisFab捕获的带有his标签的FcgR的结合。与Octet上清液数据一致,SPR数据显示,尽管IgG2·3G1-AY和IgG2·3G1-AY-V27抗体含有A型IgG2抗体(IgG2·3的CHl和铰链区,但分别具有与IgGlf和IgGlf-S267E相当的FcgR结合特性(表13。使用IgG2.5G1-AY和IgG2.5G1-AY-V27抗体也获得相似的数据,证明具有IgGlf或修饰的IgGlf样效应子功能的B型IgG2抗体(含有C131S突变,称为IgG2.5的工程改造是成功的。具有IgG2·3GI-AY、IgG2·3GI-AY-V27、IgG2·5GI-AY或IgG2·5GI-AY-V27恒定区但可变区不同的其他几种抗体的数据表明,这个工程策略广泛适用于与可变结构域无关的其他抗体(表13。证明IgGlf样FcgR结合特性的其他构建体是IgGl-G2.3Gl-AY和IgGlSTHT,而几个修饰的恒定区构建体不能保留IgGlf样FcgR结合特性,所述恒定区构建体包括IgG2.3Gl-KH、IgG2·5G1-KH、IgG2·3加THT、IgG2·5加THT和IgG2·3加GGG构建体表13。[1338]表13:IuM抗体与抗hisFab捕获的FcgR-his蛋白结合的R%最大值[1340][1341]总之,这些数据显示,在IgGl中,在铰链区中保守的CPPCPAPSEQIDNO:479基序紧邻C端的序列赋予了FcgR介导的效应子功能,而抗体的CHl和铰链上部可以被IgG2或修饰的IgG2序列替换,从而可能将IgGl和修饰的IgGl的效应子功能与含有IgG2CHl和或铰链区的抗体的优越的内化或信号转导特性相结合。[1342]实施例27:在具有IgG2铰链和CHl结构域的抗体中GITR激动剂抗体内化作用增强[1343]为了诱导GITR表达,将细胞与20ngml抗CD3+1000ngmlCD28在37°C下温育72小时。作为T细胞活化的替代方法,通过三阶段培养方案制备大批量的活化的CD4+T细胞。简言之,用补充有lygml可溶性⑶28的平板结合的⑶31.5ygml将⑶4+T细胞在37°C下刺激72小时,在20umlIL-2存在下扩大培养14天,最后通过添加10ygmlPHA、2umlIL-2和lygml⑶28在37°C下进行72小时的另一轮激活。将刺激过的T细胞接种到384孔TOL成像板中2小时使细胞粘附,在4°C冷却15分钟,然后分别加入Alexa488标记的GITR抗体,保持1小时。最后通过HCS将平板成像并将数据报告为每细胞的总强度。[1344]已经使用上述T细胞活化方法评价了三种不同的GITR抗体。它们是作为Gl同种型的GITR.6抗体和不能与Fc受体结合的惰性IgGl.1同种型,以及具有IgG2铰链而不是IgGl铰链的嵌合体。[1345]使用Alexa淬灭测定法格式评估在⑶3刺激的⑶4+T细胞中的GITR抗体诱导的内化。在如上所述的条件下温育新鲜获得的CD4阳性T细胞以诱导GITR表达。刺激后,将细胞重悬于新鲜培养基中,并接种在平板上以便如下进行内化测定。如上所述将细胞与抗体温育,用温热培养基洗涤并在固定和淬灭之前在37°C温育指定的时间。将内化的抗体量度为在零时间观察到的在小的在不能淬灭的信号之上的荧光增加,然后针对最初与细胞结合的总荧光“未淬灭的对照”进行标准化。如图72中所示,对于每种测试的抗体,GITR连接导致内化在30-60分钟之间快速达到峰值,而发现对照抗体维持定位于质膜。结果表明,IgG2铰链区增强了GITR连接诱导的内化。[1346]为了进一步剖析内化和相关动力学的详细机理,分析了进入早期内体区室的抗体胞吞作用和递送。在本实验中,用未标记的抗体对细胞进行脉冲追踪分析。固定后,将细胞渗透化处理并用早期内体标记EEAlCellSignalingTechnology染色,洗涤,然后用Alexafluor-488缀合的抗兔二级抗体EEAl和Alexafluor-647缀合的抗人抗体GITR加以检测。在具有60X水浸物镜的Opera共焦系统上将板成像。结果表明在膜结合的抗GITR抗体染色与细胞内EEAl信号之间的明确分离。在将培养物加温后,检测到看起来与内体蛋白共定位的一些抗体的聚类。使用HCSStudioSoftware进行内体共定位的定量,并将结果绘制为共定位的像素强度相对于总染色的比率(图73A-CAITR抗体和早期内体的共定位在30分钟时最突出。在此测试时间点,GITR.6.G2.Glf显示出比GITR.6.Glf抗体更高的共定位分数。共定位结果与使用上述Alexa淬灭方法进行的观察结果相关,并且支持一个这样的模型:该模型提示G2铰链相对于Gl诱导GITR内化具有潜在优势。[1347]实施例28:在T细胞受体激活的⑶4+和⑶8+T细胞中的GITR激动剂抗体信号转导在具有IgG2铰链和CHl结构域的抗体中得到增强[1348]为了进一步研究抗GITR激动剂抗体的机制,监测了参与T细胞活化的几种信号转导途径,比如NFkB和P38信号转导途径。[1349]用包被平板的0.4ygml抗⑶3和0.4ygml抗⑶28激活来自健康供体M6576的⑶4+和CD8+T细胞。3天后,收集细胞并接种在384孔板上用于信号转导激活。细胞在平板上沉降2小时后,将它们用抗GITR抗体处理15分钟,并通过向测定板中添加甲醛至最终10%来终止信号转导事件。然后将细胞渗透化处理并用磷光体-P65NFKB抗体染色以便进行信号转导检测。如图74厶和748中所示,与004+和〇08+1'细胞中的61了1?.6.61€相比,61了1?.6.62和GITR.6.G2.Glf抗体具有更高的信号转导反应。虽然没有将内化与信号通路激活关联的直接证据,但有趣的是注意到与GITR的IgGl相比,G2同种型似乎改善了抗体功能活性的两个方面。[1350]为了将每种抗体的信号转导活性定量,计算了每种抗体的EC50和Emax,因为这两个参数对于捕获信号转导事件的全范围是关键的。选择GITR.6.G2.Glf的反应水平作为100%对照,将所有其他抗体针对它进行标准化。如表14中对于被抗CD3和抗CD28抗体激活的⑶4+和⑶8+T细胞群所示,就效力EC50和效能Emax%两者而言,GITR抗体的活性有一定范围。虽然GITR.6.G2、GITR.6.G2.Glf和GITR.6.Glf在约IOnM范围内显示出相似的效力EC50,但不同的同种型的效能Emax是完全不同的,这表明Gl抗体的信号转导不如G2或嵌合同种型那样有效。[1351]表14.GITRHuMab在TCR激活的⑶4+和⑶8+T细胞中的NFKB信号转导活性总结[1352][1353]为了进一步证实如果GITR.6.G2和GITR.6.G2.Glf相比于GITR.6.Glf的信号转导差异仅限于NFkB信号转导,或者如果它也适用于其他信号转导事件,则探索P38MAPK信号转导读出。如图75中所示,在CD4+细胞p38MAPK活化测定中,与GITR.6.Glf抗体相比,GITR.6.G2和GITR.6.G2.Glf抗体具有更高的信号转导反应。由此可见,GITR.6G2同种型相比于Gl同种型的更好信号转导活性并不仅限于NFkB信号转导。[1354]实施例29:IgG2CHl和铰链中的某些氨基酸残基在改善T细胞上的GITR激动中的相关性[1355]制备具有28F3重链恒定区的抗GITR抗体GITR.6,并在如实施例25所述的IL-2产生测定中进行测试,但其中上清液的收获时间是在40小时而不是48小时。结果显示在图76A-D中。[1356]表15:序列表总结[1458][1459]表15提供了成熟可变区以及重链和轻链的序列及在标明的情况下)具有信号肽的序列。在其C端显示有K或GK的重链也可以在没有K或GK的情况下使用。[1460]等同方案:[1461]本领域技术人员将认识到、或能够确定使用不超出常规的实验、本文中公开的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案预期被下列权利要求涵盖。

权利要求:1.一种分离的抗体或其抗原结合片段,其与人糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并包含重链恒定区,所述重链恒定区包含⑴选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543或(2与氨基酸序列SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543中这样的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体刺激抗肿瘤免疫应答。3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体刺激抗原特异性T细胞应答。4.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体增加表达GITR的T细胞中的IL-2和或IFN-γ产生。5.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体增加T细胞增殖。6.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体不与Fc受体结合。7.权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体与一种或多种活化性FeYR结合。8.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体以如通过Biacore测量的IOOnM或更低的Kd与可溶性人GITR结合。9.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体以如通过Scatchard测量的InM或更低的Kd与膜结合的人GITR结合。10.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体以如通过FACS测量的InM或更低的EC5q与膜结合的人GITR结合。11.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体以如通过FACS测量的IOnM或更低的EC5q与膜结合的食蟹猴GITR结合。12.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体诱导或增强T细胞活化而无需多价交联。13.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体以如通过FACS测量的lygmL或更低的EC5q抑制GITR配体与GITR结合。14.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体结合成熟人GITRSEQIDN0:4W9PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDN0:217*CRDYPGEESEQIDN0:218。15.权利要求1-14中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR特异性地结合,并且包含选自下组序列的可变重链和可变轻链对中的三个可变重链⑶R和三个可变轻链⑶R:aSEQIDNO:13和14;⑹SEQIDNO:26和27;cSEQIDNO:39和40;dSEQIDNO:52和53;eSEQIDNO:52和54;fSEQIDNO:71和72;gSEQIDNO:84和85;⑹SEQIDNO:97和98;iSEQIDNO:97和99;jSEQIDNO:115和116;⑹SEQIDNO:128和129;lSEQIDNO:128和130;以及mSEQIDNO:335和336。16.权利要求1-14中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合,其包含:a分别包含SEQIDN0:20、21和22的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID从:23、24和25的轻链01?1、01?2和01?3序列;⑹分别包含SEQIDN0:33、34和35的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQID从:36、37和38的轻链001?1、01?2和01?3序列;c分别包含SEQIDN0:46、47和48的重链⑶R1XDR2和⑶R3序列,和或分别包含SEQID从:49、50和51的轻链〇1?1、〇1?2和〇1?3序列;⑹分别包含SEQIDN0:62、63和64的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:65、66和67的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;e分别包含SEQIDN0:62、63和64的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:68、69和70的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;f分别包含SEQIDN0:78、79和80的重链CDR1、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:81、82和83的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;g分别包含SEQIDNO:91、92和93的重链CDRl、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:94、95和96的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;⑹分别包含SEQID冊:106、107和108的重链0«1工01?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDN0:109、110和111的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;⑴分别包含SEQID冊:106、107和108的重链01?1工01?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDN0:112、113和114的轻链CDRUCDR2和CDR3序列;j分别包含SEQID冊:122、123和124的重链〇«1工01?2和〇1?3序列,和或分别包含SEQIDN0:125、126和127的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列;⑹分别包含SEQID冊:138、139和140的重链0«1工01?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDNO:141、142和143的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;⑴分别包含SEQID冊:138、139和140的重链0«1工01?2和01?3序列,和或分别包含SEQIDNO:144、145和146的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列;或m分别包含SEQIDNO:342-344的重链CDRl、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:345-347的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列。17.权利要求16的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包含分别包含SEQIDNO:20、21和22的重链CDRl、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:23、24和25的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列。18.权利要求16的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包含分别包含SEQIDNO:33、34和35的重链CDRl、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:36、37和38的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列。19.权利要求16的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包含分别包含SEQIDN0:46、47和48的重链CDRl、CDR2和CDR3序列,和或分别包含SEQIDNO:49、50和51的轻链CDRl、CDR2和CDR3序列。20.—种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并包含重链及轻链可变区,其中所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列:SEQID勵:13、26、39、52、71、84、97、115、128和335,并且其包含重链恒定区,所述重链恒定区包括:⑴选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543或(2与氨基酸序列SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543中如下所述的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。21.—种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并包含重链及轻链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列:SEQID勵:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130和336,并且所述重链包含重链恒定区,所述重链恒定区包括:(1选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543或(2与氨基酸序列SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区,其中氨基酸修饰不位于SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543中中如下所述的特定氨基酸处:所述特定氨基酸在天然存在的人重链恒定区中不存在。22.—种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并且包含与选自下组的氨基酸序列至少85%相同的重链和轻链可变区序列:a分别为SEQIDNO:13和14;⑹分别为SEQIDNO:26和27;c分别为SEQIDNO:39和40;d分别为SEQIDNO:52和53;e分别为SEQIDNO:52和54;f分别为SEQIDNO:71和72;g分别为SEQIDNO:84和85;⑹分别为SEQIDNO:97和98;⑴分别为SEQIDNO:97和";j分别为SEQIDNO:115和116;⑹分别为SEQIDNO:128和129;⑴分别为SEQIDNO:128和130;以及m分别为SEQIDNO:335和336。23.权利要求22的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链和轻链可变区包含与选自a-m的重链和轻链可变区至少90%相同的氨基酸序列。24.权利要求23的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链和轻链可变区包含与选自a-m的重链和轻链可变区至少95%相同的氨基酸序列。25.权利要求24的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链和轻链可变区包含选自(a-m的重链和轻链可变区。26.权利要求25的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包括:包含在SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的重链可变区、和包含在SEQIDNO:14中列出的氨基酸序列的轻链可变区。27.权利要求25的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包括:包含在SEQIDNO:26中列出的氨基酸序列的重链可变区、和包含在SEQIDNO:27中列出的氨基酸序列的轻链可变区。28.权利要求25的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包括:包含在SEQIDNO:39中列出的氨基酸序列的重链可变区、和或包含在SEQIDN0:40中列出的氨基酸序列的轻链可变区。29.—种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其与糖皮质激素诱导的TNF受体GITR结合并且包含与选自下组的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%相同的重链和轻链序列:a分别为SEQIDNO:15和16;⑹分别为SEQIDNO:17和19;c分别为SEQIDNO:18和19;d分别为SEQIDNO:28和29;e分别为SEQIDNO:30和32;f分别为SEQIDNO:31和32;g分别为SEQIDNO:41和42;⑹分别为SEQIDNO:43和45;⑴分别为SEQIDNO:44和45;j分别为SEQIDNO:55和56;⑹分别为SEQIDNO:55和57;⑴分别为SEQIDNO:58和6〇;m分别为SEQIDNO:59和60;η分别为SEQIDNO:58和61;⑹分别为SEQIDNO:59和61;P分别为SEQIDNO:73和74;q分别为SEQIDNO:75和77;r分别为SEQIDNO:76和77;s分别为SEQIDNO:86和87;⑴分别为SEQIDNO:88和90;u分别为SEQIDNO:89和90;V分别为SEQIDNO:102和104;w分别为SEQIDNO:103和104;X分别为SEQIDNO:100和101;y分别为SEQIDNO:100和371;z分别为SEQIDNO:102和105;za分别为SEQIDNO:103和105;zb分别为SEQIDNO:117和118;zc分别为SEQIDNO:119和121;zd分别为SEQIDNO:120和121;ze分别为SEQIDNO:131和132;zf分别为SEQIDNO:134和136;zg分别为SEQIDNO:135和136;zh分别为SEQIDNO:131和133;zi分别为SEQIDNO:134和137;zj分别为SEQIDNO:135和137;zk分别为SEQIDN0:337和338;zl分别为SEQIDNO:339和341;以及zm分别为SEQIDNO:340和341。30.权利要求29的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链包含选自下组的的氨基酸序列:SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543。31.权利要求30的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包括:包含选自SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列的重链、和包含在SEQIDNO:19中列出的氨基酸序列的轻链。32.权利要求30的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包含重链和轻链,所述重链包含在SEQIDN0:18中列出的氨基酸序列中涵盖的可变结构域和包含选自SEQIDN0:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列的恒定区,所述轻链包含在SEQIDNO:19中列出的氨基酸序列。33.—种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其a与权利要求25的抗体结合GITR上的相同表位,(b将权利要求25的抗体与活化T细胞上的GITR的结合抑制至少90%,如通过FACS测量的。34.权利要求15-33中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体结合成熟人GITRSEQIDN0:4W9PTGGPGCGPGRLLLGTGTSEQIDN0:217*CRDYPGEESEQIDN0:218。35.权利要求15-34中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体与人和食蟹猴GITR两者都结合。36.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体选自下组:IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。37.权利要求36的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体是IgGl抗体。38.权利要求36的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体包含无效应子IgGlFc。39.权利要求38的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或其抗原结合部分包含含有以下突变的无效应子IgGlFc:L234A、L235E、G237A、A330S*P331S。40.权利要求36的抗体,其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有增强的与活化性FeγR结合的Fe。41.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中CDR区中的甲硫氨酸残基被不受氧化的氨基酸残基取代。42.权利要求15-41中任一项的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。43.—种双特异性分子,其包含与具有第二结合特异性的分子连接的前述权利要求中任一项的抗体。44.一种核酸,其编码权利要求1-42中任一项的抗体或其抗原结合部分的重链和或轻链可变区。45.—种表达载体,其包含权利要求44的核酸分子。46.—种细胞,其经权利要求45的表达载体转化。47.—种免疫缀合物,其包含与药剂连接的权利要求1-42中任一项的抗体。48.—种组合物,其包含权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫缀合物,以及载体。49.一种试剂盒,其包含权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子或免疫缀合物,以及使用说明书。50.—种制备抗GITR抗体或其抗原结合部分的方法,其包括:在权利要求46的细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分,并从所述细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。51.—种刺激抗原特异性T细胞应答的方法,其包括使T细胞与权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物接触,从而刺激抗原特异性T细胞应答。52.—种活化或共刺激效应T细胞的方法,其包括使效应T细胞与权利要求1-43和47中任一项的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,以及CD3接触,其中所述效应T细胞被活化或共刺激。53.—种增加T细胞中IL-2和或IFN-γ产生的方法,其包括使T细胞与有效量的权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物接触。54.—种增加T细胞增殖的方法,其包括使所述细胞与有效量的权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物接触。55.—种增加受试者的T细胞中IL-2和或IFN-γ产生的方法,其包括施用有效量的权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,以增加所述T细胞的IL-2和或IFN-γ产生。56.—种减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中的调节性T细胞的数目的方法,其包括施用有效量的权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,其中所述抗体或其抗原结合部分具有效应子功能或增强的效应子功能,以减少肿瘤中调节性T细胞的数目。57.—种刺激受试者中的免疫应答的方法,其包括向受试者施用权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,使得受试者中的免疫应答被刺激。58.权利要求57的方法,其中所述受试者患有肿瘤,并且针对该肿瘤的免疫应答被刺激。59.—种抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法,其包括向受试者施用权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,从而抑制受试者中的肿瘤的生长。60.—种治疗癌症的方法,其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-43和47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫缀合物,从而治疗所述癌症。61.权利要求60的方法,其中所述癌症选自下组:膀胱癌、乳腺癌、子宫子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。62.权利要求60或61的方法,其中所述癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。63.权利要求56-62中任一项的方法,其进一步包括施用一种或多种另外的治疗剂。64.权利要求63的方法,其中所述另外的治疗是抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体或PD-Ll抗体。65.—种检测样品中的糖皮质激素诱导的TNF受体GITR的存在的方法,其包括使样品与权利要求1-42中任一项的抗体或其抗原结合部分在允许在所述抗体或其抗原结合部分与GITR之间形成复合物的条件下接触,并检测复合物的形成。66.—种分离的抗GITR抗体,其包含修饰的重链恒定区,所述修饰的重链恒定区包含IgG2铰链和下述至少一者:不属于IgG2同种型的CHI、CH2和CH3,其中所述抗GITR抗体相对于除了具有非IgG2铰链之外相同的抗GITR抗体具有增强的激动剂活性。67.权利要求66的分离的抗GITR抗体,其中所述修饰的重链恒定区包括:包含选自SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列的重链恒定区,或与SEQIDNO:223-226、283-290、383-446和480-543的氨基酸序列有至多5个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链恒定区。68.权利要求67的分离的抗GITR抗体,其中所述重链包括:选自下组的氨基酸序列:SEQIDN0:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361和362,或与氨基酸序列SEQIDN0:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361和362有至多10个氨基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%相同的重链。

百度查询: 百时美施贵宝公司 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)抗体及其用途

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