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【发明授权】一种植物碰触响应启动子及其应用_北京大学_201910052428.3 

申请/专利权人:北京大学

申请日:2019-01-21

公开(公告)日:2022-09-20

公开(公告)号:CN109750039B

主分类号:C12N15/113

分类号:C12N15/113;C12N15/84;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/20

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2022.09.20#授权;2019.06.07#实质审查的生效;2019.05.14#公开

摘要:本发明公开了一种植物碰触响应启动子及其应用。本发明所提供的特异DNA分子,其核苷酸序列如序列表中序列4所示。实验证明,本发明提供的特异DNA分子可以在碰触如机械压力时启动目的基因如荧光素酶的编码基因的表达,说明该特异DNA分子是一个碰触响应启动子。本发明具有重要的应用价值。

主权项:1.特异DNA分子,为序列表序列4所示的DNA分子。

全文数据:一种植物碰触响应启动子及其应用技术领域本发明属于生物技术领域,具体涉及一种植物碰触响应启动子及其应用。背景技术启动子是位于基因起始密码子ATG上游的一段DNA序列,能够与RNA聚合酶结合并启动基因的转录,相当于基因转录的“开关”。启动子主要包含两个区域:核心启动区和非核心启动区。核心启动区形成普遍性转录结构,通常由一些短的保守序列如转录起始位点、TATA-box、CAAT-box等组成。这些序列的结构特征决定着启动子同RNA聚合酶的识别、结合及起始转录过程。非核心启动区包括近端调控区和远端调控区,往往存在一些特异性的转录因子结合的位点,调控基因转录的时间和空间特异性。根据启动子的转录模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。组成型启动子能在不同类型的细胞及细胞发育的不同阶段,持续高效地驱动基因转录,并且转录活性相对恒定,受组成型启动子驱动的基因往往被称作管家基因housekeepinggene。组织特异型启动子是仅在某些特定类型的细胞组织或细胞组织发育的某一特定阶段高效地转录,其含有决定启动子的特异性的顺式调控元件,要与该组织特异性存在的转录因子相结合,才表现出启动子活性,组织特异性启动子驱动的基因往往与该种类型的细胞组织功能密切相关。诱导型启动子则需要诱导信号刺激,才能启动基因的转录,诱导型启动子在植物中更为常见,它所驱动的基因通常在植物生长发育调节和不良环境应对过程中发挥重要作用。植物在其生命周期中面临着许多复杂多变的环境因子,如维持植物正常生长发育的温度、光照和水分等基本条件变化,除此之外碰触如重力、风吹、雨雪、障碍物的触碰所引起的刺激也是外界环境中的一个重要信号,广泛影响着植物的生长发育过程。植物响应机械刺激进而在形态发育上发生改变的过程称为触发形态发生,其主要体现在机械刺激会使植物叶片面积减少,茎干的径向伸长受到抑制,从而形成矮小粗壮的植物。人们对植物响应机械刺激的兴趣由来已久,最为人熟知的如含羞草叶子的感触性合拢、藤蔓植物卷须的向触性卷曲等。然而,目前对于植物响应机械刺激的研究,主要体现在形态建成、发育模式和生理状态方面的研究,除了组织和器官水平的研究,植物的机械响应也表现在细胞和细胞器水平。然而,关于对植物如何响应并传递机械刺激信号,以及植物响应机械刺激的分子机制研究较少。荧光素酶Luciferase是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称,它能够在生物体内催化荧光素luciferin或脂肪醛fireflyaldehyde氧化发光。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等,其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyralis的萤火虫体内的荧光素酶,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白,是一个61kDa的单体酶,无需表达后修饰,直接具有完全酶活。荧光素酶可以用基因工程的方法生成并已被用于不同实验。编码荧光素酶的基因序列已经鉴定,并且已广泛应用到生物的诸多领域,用于研究基因的调控和表达水平的检测。作为一种荧光标记物,编码荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体或转染到细胞中,用做标记目标蛋白,追踪蛋白的定位及动态过程。常见的为将编码荧光素酶的基因插入待研究基因的启动子下游,并在特定的时空条件下检测编码荧光素酶的基因的表达水平,以此研究目标蛋白的作用模式。荧光素酶标记具有很强的特异性,以酶和底物特异性作用而发光。另外,荧光素酶还具有灵敏度高和稳定性好的特点。因此,荧光素酶在生物学领域研究中具有重要的意义。发明内容本发明的目的是通过碰触如机械压力启动目的基因的表达。本发明首先保护一种特异DNA分子,可为如下a1或a2或a3:a1序列表序列4所示的DNA分子;a2与a1限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有启动子功能的DNA分子;a3在严格条件下与a1或a2限定的核苷酸序列杂交,且具有启动子功能的DNA分子。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的特异DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明提供的特异DNA分子的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸,只要具有启动子功能,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的特异DNA分子的核苷酸序列具有75%或更高,80%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比%表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。含有上述任一所述特异DNA分子的表达盒也属于本发明的保护范围。所述表达盒从5’至3’可包括启动子区由所述特异DNA分子组成、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的类似的,或者,所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的类似的,或者,所述启动子区和或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列,或,如果来自相同物种,则通过刻意的人为干预在组分和或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源,与可操作地连接的目的基因区同源,与宿主同源;或;目的基因区、宿主为外源或异源。所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。在制备表达盒时,可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的,可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换,例如转换和颠换。所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。含有上述任一所述特异DNA分子的重组质粒也属于本发明的保护范围。所述重组质粒可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒,得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒的多克隆位点,得到的重组质粒。所述重组质粒可包括上述任一所述含有所述特异DNA分子的表达盒。所述重组质粒具体可为实施例提及的重组质粒pLUC-TCH3p。所述重组质粒pLUC-TCH3p为将重组质粒pLUC的限制性内切酶HindIII和BamHI之间的DNA小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子,得到的重组质粒。含有上述任一所述特异DNA分子的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。所述转基因细胞系可为转基因植物细胞系。所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述特异DNA分子转化受体植物得到的第一代转基因植物,也包括其子代。对于转基因植物,可以在该物种中繁殖所述特异DNA分子,也可用常规育种技术将所述特异DNA分子转移进入相同物种的其它品种,特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。在本发明的一个实施例中,所述植物可为十字花科植物。所述十字花科植物具体可为拟南芥。所述拟南芥具体可为野生型拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0亚型。上述任一所述特异DNA分子作为启动子或碰触响应启动子的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述特异DNA分子、上述任一所述表达盒或上述任一所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还保护表达目的基因的方法。本发明所保护的表达目的基因的方法,具体可为方法一,所述方法一可为以上述任一所述特异DNA分子作为启动子或碰触响应启动子来启动目的基因的表达。本发明所保护的表达目的基因的方法,具体可为方法二,所述方法二可包括如下步骤:将上述任一所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游,以此来启动目的基因的表达。本发明所保护的表达目的基因的方法,具体可为方法三,所述方法三可包括如下步骤:将目的基因插入上述任一所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游,由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。本发明所保护的表达目的基因的方法,具体可为方法四,所述方法四可包括如下步骤:将目的基因插入上述任一所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游,由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。上述任一所述目的基因的表达具体可为碰触如机械压力时目的基因的表达。上述任一所述特异DNA分子可以作为启动子具体可为碰触响应启动子可在植物中表达基因如外源基因。所述植物可为十字花科植物。所述十字花科植物具体可为拟南芥。所述拟南芥具体可为野生型拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0亚型。上述任一所述目的基因可为荧光素酶的编码基因。所述荧光素酶的氨基酸序列可如序列表中序列2所示。所述荧光素酶的编码基因可如序列表中序列1所示。上述任一所述碰触可为机械压力。在本发明的一个实施例中,所述机械压力可由在植物具体可为拟南芥表面覆盖一定厚度如5mm的石英砂形成。在本发明的另一个实施例中,所述机械压力可由在植物具体可为拟南芥表面覆盖一定厚度如5mm的玻璃板形成。覆盖时间可为20min以上如30min。实验证明,本发明提供的特异DNA分子可以在碰触如机械压力时启动目的基因如荧光素酶的编码基因的表达,说明该特异DNA分子是一个碰触响应启动子。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为TCH1p和TCH3p驱动荧光素酶的发光检测结果。图2为CaMV35S启动子驱动荧光素酶的发光检测结果。图3为野生型拟南芥碰触刺激前后TCH1基因和TCH3基因的转录水平的检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。野生型拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0亚型记载于如下文献中:KimH,HyunY,ParkJ,ParkM,KimM,KimH,LeeM,MoonJ,LeeI,KimJ.AgeneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughFVEinArabidopsisthaliana.NatureGenetics.2004,36:167-171。野生型拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0亚型在下文中简称野生型拟南芥或拟南芥。下述实施例中,光暗交替培养即光培养和暗培养交替条件为:22±2℃;16h光照培养8h黑暗培养;光照培养时的光照强度为80~100μEm2s。下述实施例中,石英砂的砂粒直径均为1-2mm。实施例1、拟南芥碰触响应基因的筛选本发明的发明人采用RNA-seq方法检测拟南芥在碰触刺激后的差异表达基因,进而筛选获得拟南芥的碰触响应基因。具体步骤如下:1、取拟南芥种子,用含0.05%vvtritonX-100的75%vv乙醇水溶液灭菌15min,然后用灭菌水清洗3-5次。2、完成步骤1后,将拟南芥种子播种于12MS固体培养基,4℃春化3d。3、将完成步骤2的12MS固体培养基置于培养箱,光暗交替培养5d,得到拟南芥幼苗。将部分拟南芥幼苗即未处理的拟南芥幼苗全株用液氮快速冷冻,-80℃保存。4、完成步骤3后,向其余拟南芥幼苗表面覆盖厚度为5mm石英砂30min,得到机械刺激的拟南芥幼苗。去除机械刺激的拟南芥幼苗上的石英砂,然后将机械刺激的拟南芥幼苗全株用液氮快速冷冻,-80℃保存。5、提取未处理的拟南芥幼苗或机械刺激的拟南芥幼苗的总RNA,然后用偶联oligodT的柱安诺优达公司的产品纯化分离含有polyA的mRNA。6、完成步骤5后,取所述含有polyA的mRNA,加入mRNA片段化缓冲液安诺优达公司的产品,94℃处理2min,得到片段化的RNA片段。7、完成步骤6后,以所述片段化的RNA片段为模板,先采用随机引物反转录合成第一链cDNA;然后用DNA聚合酶I合成双链DNA,同时加入RNaseH消化RNA模板。反转录的cDNA产物用QiaQuickPCR纯化试剂盒Qiagen公司的产品回收纯化。最后将cDNA片段加上接头引物进行PCR扩增,用Illumina公司的HiSeq2500进行测序。8、完成步骤7后,对未处理的拟南芥幼苗或机械刺激的拟南芥幼苗进行RNA-seq分析,获得机械刺激处理后明显上调的差异表达基因即拟南芥碰触响应基因。结果表明,TCH1基因geneID为AT5G37780和TCH3基因geneID为AT2G41100为拟南芥碰触响应基因。9、以未处理的拟南芥幼苗中拟南芥碰触响应基因TCH1基因或TCH3基因的表达量作为1,检测机械刺激的拟南芥幼苗中拟南芥碰触响应基因的相对表达量。结果表明,与未处理的拟南芥幼苗相比,机械刺激的拟南芥幼苗中拟南芥碰触响应基因的表达量均显著提高。实施例2、拟南芥碰触响应基因的启动子的克隆和发光检测一、重组质粒的构建1、重组质粒pLUC的构建1以pGreenII0800-LUC质粒BioVector公司的产品为模板,采用引物F:5’-CGGGATCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点和引物R:5’-GGGGTACCTTACAATTTGGACTTTCCGCC-3’下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点组成的引物对进行PCR扩增,回收大小约1700bp的PCR扩增产物。反应程序:94℃3min;94℃15秒,57℃30秒,68℃2min,35个循环;68℃10min。2完成步骤1后,将PCR扩增产物进行测序。测序结果表明,PCR扩增产物中含有序列表中的序列1所示的DNA片段。序列表中的序列1所示的DNA片段编码序列表中序列2所示的蛋白质即荧光素酶。3完成步骤1后,取PCR扩增产物,用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切,回收约1.7kb的酶切产物。4取质粒pBI121北京拜尔迪生物技术有限公司的产品,产品目录号为MP-091,用限制性内切酶SacI和EcoRI酶切,回收约277bp的DNA片段。该DNA片段即为NosterpolyA终止序列。5取载体pUC19北京百泰克生物技术有限公司的产品,产品目录号为DP7801,用限制性内切酶SacI和EcoRI酶切,回收约2686bp的载体骨架。6将步骤4得到的DNA片段和步骤5得到的载体骨架进行连接,得到重组质粒pUC19-Noster。7取重组质粒pUC19-Noster,用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切,回收约2950bp的酶切产物。8将步骤3得到的酶切产物和步骤7得到的酶切产物进行连接,得到中间质粒。9取中间质粒,用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切,回收约2kb的DNA片段。10取质粒pCAMBIA1301BiovectorCo.的产品,用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切,回收约10kb的载体骨架。11将步骤9得到的DNA片段和步骤10得到的载体骨架进行连接,得到重组质粒pLUC。2、拟南芥碰触响应基因的启动子的克隆1TCH1基因的启动子以下简称为TCH1p的克隆a、提取拟南芥的基因组DNA并以其作为模板,采用上游引物:5’-CCAAGCTTagcttattactctcttccttggttttg-3’下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点和下游引物:5’-CGGGATCCagcttcttcgagaaatcgtctttc-3’下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点组成的引物对进行PCR扩增,回收大小约1374bp的PCR扩增产物。该PCR扩增产物即含有TCH1p。反应体系为30μL,由0.6μLKOD浓度为5UμLKOD为TOYOBO公司的产品、3μL10×buffer10×buffer为KOD的组件、3μLdNTPsdATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.0mM、2.4μLMgSO4溶液浓度为25mM、0.9μL上游引物浓度为10μM、0.9μL下游引物浓度为10μM、3μL拟南芥的基因组DNA和16.2μLddH2O组成。反应程序:94℃2min;94℃15秒,56℃30秒,68℃2min,35个循环;68℃10min。b、完成步骤a后,取所述PCR扩增产物,测序。测序结果表明,TCH1p的核苷酸序列如序列表中序列3所示。2TCH3基因的启动子以下简称为TCH3p的克隆a、提取拟南芥的基因组DNA并以其作为模板,采用上游引物:5’-CCAAGCTTCATTAGGGTCTGGCTGGTATG-3’下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点和下游引物:5’-CGGGATCCACCCGAATTATTTGAAATGACG-3’下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点组成的引物对进行PCR扩增,回收大小约1400bp的PCR扩增产物。该PCR扩增产物即含有TCH3p。反应体系同步骤1中a的反应体系。反应程序同步骤1中a的反应程序。b、完成步骤a后,取所述PCR扩增产物,测序。测序结果表明,TCH3p的核苷酸序列如序列表中序列4所示。3、CaMV35S启动子以下简称为35Sp的克隆a、以pGreenII0800-LUC质粒为模板,采用上游引物:5’-CCAAGCTTTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTC-3’下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点和下游引物:5’-CGGGATCCTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3’下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点组成的引物对进行PCR扩增,回收大小约346bp的PCR扩增产物。该PCR扩增产物即含有35Sp。反应体系同步骤1中a的反应体系。反应程序同步骤1中a的反应程序。b、完成步骤a后,取所述PCR扩增产物,测序。测序结果表明,35Sp的核苷酸序列如序列表中序列5所示。4、重组质粒pLUC-TCH1p、重组质粒pLUC-TCH3p和重组质粒pLUC-35Sp的构建1重组质粒pLUC-TCH1p的构建1-1取步骤1构建的重组质粒pLUC,用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切,回收约10kb的载体骨架。1-2取步骤2中1扩增的PCR扩增产物,用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切,回收约1374bp的酶切片段。1-3将步骤1-1得到的载体骨架和步骤1-2得到的酶切片段进行连接,得到重组质粒pLUC-TCH1p。将重组质粒pLUC-TCH1p进行测序。根据测序结果,对重组质粒pLUC-TCH1p进行结构描述如下:将重组质粒pLUC的限制性内切酶HindIII和BamHI之间的DNA小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子,得到的重组质粒。重组质粒pLUC-TCH1p中,由TCH1p启动荧光素酶的表达。2重组质粒pLUC-TCH3p的构建按照步骤1的方法,将步骤1-2中“步骤2中1扩增的PCR扩增产物”替换为“步骤2中2扩增的PCR扩增产物”,其它步骤均不变,得到重组质粒pLUC-TCH3p。将重组质粒pLUC-TCH3p进行测序。根据测序结果,对重组质粒pLUC-TCH3p进行结构描述如下:将重组质粒pLUC的限制性内切酶HindIII和BamHI之间的DNA小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子,得到的重组质粒。重组质粒pLUC-TCH3p中,由TCH3p启动荧光素酶的表达。3重组质粒pLUC-35Sp的构建按照步骤1的方法,将步骤1-2中“步骤2中1扩增的PCR扩增产物”替换为“步骤3扩增的PCR扩增产物”,其它步骤均不变,得到重组质粒pLUC-35Sp。将重组质粒pLUC-35Sp进行测序。根据测序结果,对重组质粒pLUC-35Sp进行结构描述如下:将重组质粒pLUC的限制性内切酶HindIII和BamHI之间的DNA小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子,得到的重组质粒。重组质粒pLUC-35Sp中,由35Sp启动荧光素酶的表达。二、重组农杆菌的获得将重组质粒pLUC-TCH1p导入根癌农杆菌GV3101,得到重组农杆菌,命名为GV3101pLUC-TCH1p。将重组质粒pLUC-TCH3p导入根癌农杆菌GV3101,得到重组农杆菌,命名为GV3101pLUC-TCH3p。将重组质粒pLUC-35Sp导入根癌农杆菌GV3101,得到重组农杆菌,命名为GV3101pLUC-35Sp。三、转基因拟南芥的获得1、采用拟南芥花序浸花转化法记载于如下文献中Clough,S.J.,andBent,A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.199816,735-743.,将GV3101pLUC-TCH1p转至野生型拟南芥中,获得T1代转TCH1p拟南芥种子。2、将步骤1获得的T1代转TCH1p拟南芥种子播种于含有30mgL的潮霉素的12MS培养基上,能够正常生长的拟南芥抗性苗即为T1代转TCH1p阳性苗,T1代转TCH1p阳性苗收到的种子即为T2代转TCH1p拟南芥种子。3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转TCH1p拟南芥种子播种于含有30mgL的潮霉素的12MS培养基上进行筛选,如果某株系中能够正常生长的拟南芥抗性苗的数目与不能够正常生长的拟南芥非抗性苗的数目比例为3:1,则该株系为TCH1p插入一个拷贝的株系,该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转TCH1p拟南芥种子。4、将步骤3筛选出的T3代转TCH1p拟南芥种子再次播种于含有30mgL的潮霉素的12MS培养基上进行筛选,均为抗性苗的即为T3代纯合转TCH1p拟南芥。将其中2个T3代纯合转TCH1p拟南芥株系分别命名为TCH1p-1和TCH1p-2,并进行后续实验。按照上述方法,将GV3101pLUC-TCH1p替换为GV3101pLUC-TCH3p,其它步骤均相同,得到T3代纯合转TCH3p拟南芥。将其中2个T3代纯合转TCH3p拟南芥株系分别命名为TCH3p-1和TCH3p-2,并进行后续实验。按照上述方法,将GV3101pLUC-TCH1p替换为GV3101pLUC-35Sp,其它步骤均相同,得到T3代纯合转35Sp拟南芥。将其中1个T3代纯合转35Sp拟南芥株系命名为35S:LUC,并进行后续实验。四、发光检测D-Luciferin母液:将1gD-Luciferin粉末MW=318.42gmol溶于62.8mL水中,得到浓度为50mM的D-Luciferin母液,-80℃分装避光保存。D-Luciferin工作液:用水稀释D-Luciferin母液至浓度为1mM。待测拟南芥种子为TCH1p-1的T3代种子、TCH1p-2的T3代种子、TCH3p-1的T3代种子、TCH3p-2的T3代种子、35S:LUC的T3代种子或野生型拟南芥种子。1、取待测拟南芥种子,用含0.05%vvtritonX-100的75%vv乙醇水溶液灭菌15min,然后用灭菌水清洗3-5次。2、完成步骤1后,将待测拟南芥种子播种于12MS固体培养基,4℃春化3d。3、将完成步骤2的12MS固体培养基置于培养箱,光暗交替培养5d,得到待测拟南芥幼苗。4、完成步骤3后,取所述待测拟南芥幼苗,用D-Luciferin工作液喷施,然后静置处理24h,用植物活体成像仪拍照BertholdLB985。5、完成步骤4后,部分待测拟南芥幼苗的表面覆盖玻璃板厚度为5mm,30min后去掉玻璃板,用植物活体成像仪拍照BertholdLB985。6、完成步骤4后,部分待测拟南芥幼苗不做任何处理,30min后用植物活体成像仪拍照BertholdLB985。作为对照。部分实验结果见图1A为对照,其中左上的1#为TCH1p-1的T3代种子,右上的1#为TCH1p-2的T3代种子,左下的2#为TCH3p-1的T3代种子,右下的2#为TCH3p-2的T3代种子;B为覆盖玻璃板处理30min,其中左上的1#为TCH1p-1的T3代种子,右上的1#为TCH1p-2的T3代种子,左下的2#为TCH3p-1的T3代种子,右下的2#为TCH3p-2的T3代种子和图2左图为对照,右图为覆盖玻璃板处理30min,Col为野生型拟南芥的种子,35S:LUC为35S:LUC的T3代种子。结果表明,碰触刺激前即未覆盖玻璃板,TCH1p-1、TCH1p-2、TCH3p-1和TCH3p-2基本没有荧光;碰触刺激覆盖玻璃板处理30min后,TCH1p-1和TCH1p-2的荧光强度均较弱,TCH3p-1和TCH3p-2的荧光强度则较强;碰触刺激前和碰触刺激后,35S:LUC的荧光强度均较强且无显著变化;碰触刺激前和碰触刺激后,野生型拟南芥均无荧光信号。由此可见,TCH1p和TCH3p均能够响应碰触刺激如机械压力。在碰触刺激如机械压力下,TCH3p和TCH1p均可以驱动荧光素酶产生荧光。五、检测TCH1基因和TCH3基因的转录水平待测拟南芥幼苗为完成步骤四中6中表面未覆盖玻璃板的野生型拟南芥幼苗或完成步骤四中5中表面覆盖玻璃板处理的野生型拟南芥幼苗。1、取待测拟南芥幼苗,采用植物总RNA试剂盒SIGMA-ALDRICH公司的产品提取总RNA,得到待测拟南芥总RNA。2、取待测拟南芥总RNA,参照RT-PCR试剂盒天根生化科技北京有限公司的产品说明书的操作步骤,合成待测拟南芥的cDNA。1取2μg待测拟南芥总RNA,加入2μL5×gDNABuffer,然后用RNase-FreeddH2O补齐至10μL,混匀短暂离心后,42℃静置3min。2取完成步骤1的体系,加入10μL反转录混合物由2μL10×KingRTBuffer、1μLFastKingRTEnzymeMix、2μLFQ-RTPrimerMix和RNase-FreeddH2O组成,混匀;先42℃孵育15min,然后95℃孵育3min后置于冰上,得到待测拟南芥的cDNA。5×gDNABuffer、RNase-FreeddH2O、10×KingRTBuffer、FastKingRTEnzymeMix和FQ-RTPrimerMix均为RT-PCR试剂盒中的组件。3、完成步骤2后,采用TBGreenTMFastqPCRMix试剂盒Takara公司的产品进行RealTimePCRqPCR检测。1取待测拟南芥的cDNA,用ddH2O稀释20倍,得到模板溶液。2配制反应体系。反应体系为20μL,由5μL模板溶液、10μLTBGreenFastqPCRMix2×、0.8μL上游引物浓度为10μM、0.8μL下游引物浓度为10μM、0.4μLROXReferenceDye50×和ddH2O组成。TBGreenFastqPCRMix2×和ROXReferenceDye50×均为TBGreenTMFastqPCRMix试剂盒中的组件。检测TCH1基因的上游引物的核苷酸序列为5’-CCCGAGTTCCTGAACCTGAT-3’,下游引物的核苷酸序列为5’-CAGCCTCACGGATCATCTCT-3’。检测TCH3基因的上游引物的核苷酸序列为5’-ATGGTGACGGAACCATCAGT-3’,下游引物的核苷酸序列为5’-CGCTATGTCCCTCTCCCAAT-3’。3完成步骤2后,取所述反应体系,进行Real-timePCR检测。反应程序为:95℃20s;95℃3s,60℃30s,40个循环;95℃15s;60℃1min;95℃15s;60℃15s。Real-timePCR检测结果见图30h为表面未覆盖玻璃板,0.5h为表面覆盖玻璃板30min。结果表明,碰触刺激前即未覆盖玻璃板,以TCH1基因和TCH3基因的表达量为1;在碰触刺激后,TCH1基因和TCH3基因的表达量显著上调TCH1基因的表达量上调2倍,TCH3基因的表达量上调31倍。由此可见,TCH1基因和TCH3基因对碰触刺激如机械压力均有明显的响应,进而说明TCH1基因的启动子和TCH3基因的启动子对碰触刺激如机械压力均有明显的响应。北京大学一种植物碰触响应启动子及其应用5PatentInversion3.511653DNA人工序列1atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatgga60accgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaatt120gcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtcc180gttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgta240tgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagtt300gcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatt360tcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaa420aaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccaggga480tttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgat540tttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctgga600tctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgcctgcgtcagattctcg660catgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgtt720gttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggattt780cgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattac840aaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctg900attgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcg960aaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatat1020gggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggc1080gcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaa1140acgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggt1200tatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattct1260ggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtct1320ttaattaaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaa1380caccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaactt1440cccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggat1500tacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggac1560gaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcata1620aaggccaagaagggcggaaagtccaaattgtaa16532550PRT人工序列2MetGluAspAlaLysAsnIleLysLysGlyProAlaProPheTyrPro151015LeuGluAspGlyThrAlaGlyGluGlnLeuHisLysAlaMetLysArg202530TyrAlaLeuValProGlyThrIleAlaPheThrAspAlaHisIleGlu354045ValAsnIleThrTyrAlaGluTyrPheGluMetSerValArgLeuAla505560GluAlaMetLysArgTyrGlyLeuAsnThrAsnHisArgIleValVal65707580CysSerGluAsnSerLeuGlnPhePheMetProValLeuGlyAlaLeu859095PheIleGlyValAlaValAlaProAlaAsnAspIleTyrAsnGluArg100105110GluLeuLeuAsnSerMetAsnIleSerGlnProThrValValPheVal115120125SerLysLysGlyLeuGlnLysIleLeuAsnValGlnLysLysLeuPro130135140IleIleGlnLysIleIleIleMetAspSerLysThrAspTyrGlnGly145150155160PheGlnSerMetTyrThrPheValThrSerHisLeuProProGlyPhe165170175AsnGluTyrAspPheValProGluSerPheAspArgAspLysThrIle180185190AlaLeuIleMetAsnSerSerGlySerThrGlyLeuProLysGlyVal195200205AlaLeuProHisArgThrAlaCysValArgPheSerHisAlaArgAsp210215220ProIlePheGlyAsnGlnIleIleProAspThrAlaIleLeuSerVal225230235240ValProPheHisHisGlyPheGlyMetPheThrThrLeuGlyTyrLeu245250255IleCysGlyPheArgValValLeuMetTyrArgPheGluGluGluLeu260265270PheLeuArgSerLeuGlnAspTyrLysIleGlnSerAlaLeuLeuVal275280285ProThrLeuPheSerPhePheAlaLysSerThrLeuIleAspLysTyr290295300AspLeuSerAsnLeuHisGluIleAlaSerGlyGlyAlaProLeuSer305310315320LysGluValGlyGluAlaValAlaLysArgPheHisLeuProGlyIle325330335ArgGlnGlyTyrGlyLeuThrGluThrThrSerAlaIleLeuIleThr340345350ProGluGlyAspAspLysProGlyAlaValGlyLysValValProPhe355360365PheGluAlaLysValValAspLeuAspThrGlyLysThrLeuGlyVal370375380AsnGlnArgGlyGluLeuCysValArgGlyProMetIleMetSerGly385390395400TyrValAsnAsnProGluAlaThrAsnAlaLeuIleAspLysAspGly405410415TrpLeuHisSerGlyAspIleAlaTyrTrpAspGluAspGluHisPhe420425430PheIleValAspArgLeuLysSerLeuIleLysTyrLysGlyTyrGln435440445ValAlaProAlaGluLeuGluSerIleLeuLeuGlnHisProAsnIle450455460PheAspAlaGlyValAlaGlyLeuProAspAspAspAlaGlyGluLeu465470475480ProAlaAlaValValValLeuGluHisGlyLysThrMetThrGluLys485490495GluIleValAspTyrValAlaSerGlnValThrThrAlaLysLysLeu500505510ArgGlyGlyValValPheValAspGluValProLysGlyLeuThrGly515520525LysLeuAspAlaArgLysIleArgGluIleLeuIleLysAlaLysLys530535540GlyGlyLysSerLysLeu54555031374DNA拟南芥(Arabidopsisthaliana)3agcttattactctcttccttggttttgttttatttttatctagttttagttttgaaattt60attttttttattatgaattttaaaaatttaatttttatttgtgttggaatttttttattt120tctttgtaacctatatgaacttggatattttttttctttcttacattaattaagtacgta180agtttcgacaatcaagaatagggttttgttgattccaatcgtgttacccaaaaattagaa240taaggtttgtccaacaatttattaaatttggtcttagagttgtatacgagcctacgaggt300atcttttagatatgccgaagagatggtagtgcgaagaagaaaagaaacctcattttccat360ggtattaaggatttcaagctattcaaacttttgtagtgacccaaatacgtgtagaactgg420cccaaagacaaatagcttaattaagattatcacctaatcttaggtattggtgataggtga480ttcgctcaagccttatgatcaatattagctccatattatggagagtgagcagcacatact540cgtagatagaaaagtattgttgctcgagtaatatttttctgatgataattgtgtttcgac600cactgttggcatctttcacacatgaatacatgatgtacatgtacgacatgcaatctttct660cttaacgctcgactgctgtctgctgtgatggatcatcacaagtaaactttgtgaagcata720tttcgtgagccaaatgatgttagaaaacaatcgtgtgagccaaaggcgtgagagcgcttg780tagaaagtggtttatgttgtagttaaaataatccgaatattcatcttccggaaaaaagtg840aagttcaacctctcaacggtacgtttttatacctcaactaagttacattgtgtatatcaa900catcagctaactttttattaatatttcggttcacaatatcattatctttttcaaaattta960ttaagatttcttttgctcattttatttatgtgaattttaaaaataaaataatttttataa1020tatagaaacaaaatattactaaaagtaatttttaaaaaataaataaaattaatgtcatat1080caacgaaaaattcatagtttattaaagtagtaaatataaaagtaataatattttaattat1140tttggtattaaattatacacttttattaatatatgtattttcttctaaaaattaaaaatt1200aattgggtttttgtttggaatttttccgacttaccttttctccttctttttgtcgttttg1260cttagatatttgtttgcatcattttcaaagagagacgactctgaatccaaaaaaaaaaaa1320aactcattaagtaaagacaaaggaagagaagaaagacgatttctcgaagaagct137441400DNA拟南芥(Arabidopsisthaliana)4cattagggtctggctggtatgttagatctctctaaaaaggcgtttgatctttgaaaataa60tttctatgtaataaatttattgtgttaccatcttttcttgcatgcaatttattaaaatga120gtttgtaatatggtttcagtatcgaatataattggggtatcaatgtatcttttgagaaaa180acatttaaaacgtagcagaactaattattgaaaactggtagcattactaaaaattgatct240aaatcggttaatgatttggcacatacagtgatcaaatcagctaagcctcatatctcaccg300tcccagagttcttcaagactcttataaggactcatctaatgaataatgacatgcctcgca360ccaacctgccctgcaacattgaaaacacacgtctacaatttcgataacccaagtgttttg420agcaaaacaaaggacgccctttgacccatttggactacaatgtgtggaaaattactgcat480gttcaatatcagaaaacttggataacatgtcttcgatatgggcttttcttattttgtacc540cgtgtaatttcgctggcccaaaatccaaagcaacaagggtaaatttgtatgcagtacatg600tggcatgttgggtcatatggaaacaggtcacaagactcagattctttacattgcggcggg660tagtagtagctttctagtctaccttgagattgcccctgcccgtgattcttgagtcgggca720caggaagtggttttctgtcaactttacttgctcaagccatccccgcaaggtagaaacttc780tgtggtctttctcgttatttcttatgtaccatgtttttggtcgtttgtgtagtttcttct840aaccttccacacacttgtcttgcgaattccttccacagcagagatgttaaatcaggaata900ttcaggatgtagaaacttctctgctctttctcaagtagaatgcacttgtggaatccctca960gatcagatttcattggtaacgttcgttaacttcaacaacaacactttactaaacatgtgc1020taatcaattgtcatacgcttgtatttcttcgattcatttttatcttatgcaagtgttttc1080tctattatgatttatttagttttgcataaataaggacactccttcggagtcagtataaga1140aaactataacctaaaatataaattaggcaaatgtccactcacccatccaaaattccattg1200taaataaatgtttctttcaaataaatgaaaaaaaaaaaaaaaaacaagttggaagaagga1260accaaccaagtaattgccagtcaaaggaggcgactcacacttgaaaggataagctgacat1320ggcagacaacgatcctgcgtagaaattgcgtgaacgtggaaaagtttgaggatatagccg1380tcatttcaaataattcgggt14005346DNA人工序列5tgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctat60ctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattg120cgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacc180cccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagt240ggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgca300agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggaca346

权利要求:1.特异DNA分子,为如下a1或a2或a3:a1序列表序列4所示的DNA分子;a2与a1限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有启动子功能的DNA分子;a3在严格条件下与a1或a2限定的核苷酸序列杂交,且具有启动子功能的DNA分子。2.含有权利要求1所述特异DNA分子的表达盒。3.含有权利要求1所述特异DNA分子的重组质粒。4.含有权利要求1所述特异DNA分子的转基因细胞系。5.权利要求1所述特异DNA分子作为启动子或碰触响应启动子的应用。6.权利要求1所述特异DNA分子、权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用。7.一种表达目的基因的方法,为以权利要求1所述特异DNA分子作为启动子或碰触响应启动子来启动目的基因的表达。8.一种表达目的基因的方法,包括如下步骤:将权利要求1所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游,以此来启动目的基因的表达。9.一种表达目的基因的方法,包括如下步骤:将目的基因插入权利要求2所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游,由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。10.一种表达目的基因的方法,包括如下步骤:将目的基因插入权利要求3所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游,由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

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