申请/专利权人：山东泓达生物科技有限公司;山东昆达生物科技有限公司

申请日：2019-03-27

公开（公告）日：2022-09-20

公开（公告）号：CN109797173B

主分类号：C12P5/02

分类号：C12P5/02;C12N1/21;G01N30/02;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.09.20#授权;2019.06.21#实质审查的生效;2019.05.24#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其是一种β‑法尼烯的生产方法。该种β‑法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β‑法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β‑法尼烯、S4通过发酵控制提高β‑法尼烯的产量。本发明的一种β‑法尼烯的生产方法，利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β‑法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本，经本发明的一种气相色谱法检测发酵液中β‑法尼烯的方法检测，发酵72小时后，发酵液中β‑法尼烯浓度高达20.5gL。

主权项：1.一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量；所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2及挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用；所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成β-法尼烯的相关基因，相关基因包括甲羟戊酸途径中乙酰乙酰基CoA硫解酶基因atoB、HMG-CoA合酶基因erg13、HMG-CoA还原酶基因thmg1、甲羟戊酸激酶基因erg12、磷酸甲羟戊酸激酶基因erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因mvd1、异戊烯焦磷酸异构酶基因idi、法尼基焦磷酸合成酶基因ispA、法尼烯合酶基因afs；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，所述多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞；所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基的三角瓶中培养，摇床温度30-38℃，转速180-220rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以3-20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35-38℃，转速180-250rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以5%-8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养；所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm-1.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200rmin-400rmin，发酵液溶氧量控制在2%-90%，pH为7.0±0.4；发酵前期发酵温度为35℃-37℃，发酵中期发酵温度为30℃-35℃，发酵后期为28℃-35℃；当培养至OD600为8-20，向发酵培养基中接入终浓度为0.1-0.5mmolL异丙基硫代半乳糖苷，2h-10h小时后接入占发酵液体积10%-20%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷、正十二烷、石油醚、正辛烷中的一种或多种；发酵过程中当糖浓度下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度在4.0±0.2；所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子；所述LB培养基是胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL；所述pH用20%硫酸和30%氨水控制；所述发酵前期是0h-20h；所述发酵中期是21h-48h；所述发酵后期是49h-结束。

全文数据：一种β-法尼烯的生产方法技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其是一种β-法尼烯的生产方法。背景技术β-法尼烯是一种重要的倍半稀萜类化合物，其在很多领域有着广泛的应用前景，一方面，维生素E生产领域，β-法尼烯作为中间体能够极大的减少了维生素E的合成步骤，与传统合成方法相比提高了反应效率和收率，降低生产成本，目前湖北能特科技已经利用β-法尼烯进行维生素E的生产；另一方面，β-法尼烯可用于制备高热值、高效能的清洁可再生燃料，缓解全球能源危机，目前美国Amyris已经利用专利酵母菌进行β-法尼烯的生产，但其以蔗糖为主要原料，生产成本相对昂贵，发酵周期长，本技术利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本。发明内容本发明的目的在于提供一种β-法尼烯的生产方法，利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。优选的，所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液，每批次糖蜜原液质量均有波动，稀释水量根据现场用波美度计测定的数据为准；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。优选的，所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成β-法尼烯的相关基因，相关基因包括甲羟戊酸途径中乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）基因atoB、HMG-CoA合酶（ERG13）基因erg13、HMG-CoA还原酶（tHMG1）基因thmg1、甲羟戊酸激酶（ERG12）基因erg12、磷酸甲羟戊酸激酶（ERG8）基因erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD1）基因mvd1、异戊烯焦磷酸异构酶（IDI）基因idi、法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）基因ispA、法尼烯合酶（AFS）基因afs；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，所述多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞。优选的，所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度30-38℃，转速180-220rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以3-20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35-38℃，转速180-250rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以5%-8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。优选的，所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm-1.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200rmin-400rmin，发酵液溶氧量控制在2%-90%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为35℃-37℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为30℃-35℃，发酵后期（49h-结束）为28℃-35℃；当培养至OD600为8-20，向发酵培养基中接入终浓度为0.1-0.5mmolL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），2h-10h小时后接入占发酵液体积10%-20%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷、正十二烷、石油醚、正辛烷中的一种或多种；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。优选的，所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜或两者的组合，组合情况下，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为100:25-1000。优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶，其中，基因atoB的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，基因erg13的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，基因thmg1的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，基因erg12的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，基因erg8的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，基因mvd1的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，基因idi的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，基因ispA的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，基因afs的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。优选的，重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因。优选的，所述质粒pKK223-3选用tac启动子（如SEQIDNO.1所示）、质粒PMCSG9选用T7启动子（如SEQIDNO.2所示）、质粒pMal-c4X选用tac启动子（如SEQIDNO.3所示）。优选的，所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重2%-20%，酵母粉或者酵母膏或两者的组合（组合情况下酵母粉：酵母膏为100:1-10000），占培养基比重1%-10%、蛋白胨占培养基比重1.5%-8.5%、柠檬酸铵占培养基比重0.1%-5%、硫酸镁或氯化镁占培养基比重0.1%-2%，硫酸锰占培养基比重0.05%-0.9%，硫酸锌占培养基比重0.02%-0.8%。优选的，所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜40%-60%，硫酸铵20%-50%，蛋白胨5%-10%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法，包括如下步骤：H1、发酵液前处理：取10mL以上发酵液，9000-12000rmin离心3-8min，油相和水相分层，吸取上层油相，用0.44um有机滤膜过滤，得到滤出液；H2、使用安捷伦7890A气相色谱仪，19091JHP-5色谱柱柱长30m;内径0.32mm;膜厚250um，配置β-法尼烯系列标准溶液，制成浓度分别为5gL、10gL、15gL、20gL的β-法尼烯标准溶液，分别进样检测，绘制线性回归方程，并计算R值，使R值在99%以上，上述β-法尼烯检测条件为：柱箱温度：初始温度65-75℃，保留2min，以10℃min升至220-280℃,保留1min，进样口温度220-280℃，进样量1uL，品注入分流比1:50，检测器（FID）温度260-280℃，氮气作为载气，入口压力是12-18psi，模式为恒流模式。本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种β-法尼烯的生产方法，利用价格低廉糖蜜为主要原料，利用重组大肠杆菌作为生产菌种生产β-法尼烯，缩短了发酵周期，降低了生产成本，经本发明的一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法检测，发酵72小时后，发酵液中β-法尼烯浓度高达20.5gL。具体实施方式实施例1一种β-法尼烯的生产方法一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度37℃，转速200rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以10%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度37℃，转速220rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以7%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.8vvm，发酵罐搅拌转速控制在300rmin，发酵液溶氧量控制在20%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为36℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为32℃，发酵后期（49h-72h）为30℃；当培养至OD600为16，向发酵培养基中接入终浓度为0.1mmolL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），3h小时后接入占发酵液体积15%的萃取剂，所述萃取剂为正十二烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重8.5%，酵母粉3.5%、蛋白胨占培养基比重4.8%、柠檬酸铵占培养基比重1.8%、硫酸镁占培养基比重1.5%，硫酸锰占培养基比重0.12%，硫酸锌占培养基比重0.08%。所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜50%，硫酸铵30%，蛋白胨20%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。实施例2一种β-法尼烯的生产方法一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度35℃，转速180rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以5%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35℃，转速180rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以5%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200rmin，发酵液溶氧量控制在10%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为35℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为30℃，发酵后期（49h-72h）为28℃；当培养至OD600为10，向发酵培养基中接入终浓度为0.1mmolL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），2h小时后接入占发酵液体积10%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重5%，酵母粉2%、蛋白胨占培养基比重2%、檬酸铵占培养基比重1%、硫酸镁占培养基比重0.5%，硫酸锰占培养基比重0.08%，硫酸锌占培养基比重0.1%。所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜55%，硫酸铵40%，蛋白胨5%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。实施例3一种β-法尼烯的生产方法一种β-法尼烯的生产方法，包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化，酸化后，沙土、浮渣等杂质≤1%，浓度≥80°BX，全糖分≥52%，酸度＜9%；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2等有害气体以及挥发性酸和其它挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5，石灰乳由氧化钙加水配得，现用现配；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库BLAST找到MVA途径中的乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶以及对应的cDNA序列；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，即：根据已知酶的cDNA序列设计引物合成相应的基因序列，以设计合成的cDNA序列为模板通过PCR技术克隆合成相应的基因序列，运用DNA重组技术，将克隆合成基因序列连接到相应的质粒上，形成多重重组质粒，多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞，即：将连接好的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞，培养扩增重组宿主细胞，提取质粒进行测序验证目的基因已经连接到相应的质粒上，将验证后的菌株进行培养保藏。所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度38℃，转速220rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度38℃，转速250rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在1.2vvm，发酵罐搅拌转速控制在400rmin，发酵液溶氧量控制在50%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为37℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为35℃，发酵后期（49h-72h）为30℃；当培养至OD600为20，向发酵培养基中接入终浓度为0.3mmolL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），3h小时后接入占发酵液体积20%的萃取剂，所述萃取剂为正十二烷；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两者的组合，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为2.5:6。所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；重组宿主细胞大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重12%，酵母粉8%、蛋白胨占培养基比重8.5%、柠檬酸铵占培养基比重4%、硫酸镁占培养基比重1.5%，硫酸锰占培养基比重0.4%，硫酸锌占培养基比重0.4%。所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜60%，硫酸铵30%，蛋白胨10%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。实施例4一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法，包括如下步骤：H1、发酵液前处理：取10mL以上发酵液，10000rmin离心5min，油相和水相分层，吸取上层油相，用0.44um有机滤膜过滤，得到滤出液；H2、使用安捷伦7890A气相色谱仪，19091JHP-5色谱柱柱长30m;内径0.32mm;膜厚250um，配置β-法尼烯系列标准溶液，制成浓度分别为5gL、10gL、15gL、20gL的β-法尼烯标准溶液，分别进样检测，绘制线性回归方程，并计算R值，使R值在99%以上，上述β-法尼烯检测条件为：柱箱温度：初始温度70℃，保留2min，以10℃min升至250℃,保留1min，进样口温度250℃，进样量1uL，品注入分流比1:50，检测器（FID）温度260℃，氮气作为载气，入口压力是15psi，模式为恒流模式。采用本实施例中的种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法对实施例1-3中生产的β-法尼烯进行检测，实施例1-3均发酵72h，，检测发酵液中β-法尼烯浓度依次达到20.5gL、20.3gL和20.2gL。上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。序列表山东昆达生物科技有限公司山东泓达生物科技有限公司一种β-法尼烯的生产方法12SIPOSequenceListing1.0128DNA人工序列1gacaattaatcatcggctcgtataatgt28217DNA人工序列2taatacgactcactata17329DNA人工序列3tgacaattaatcatcggctcgtataatgt2941185DNA人工序列4atgaaaaattgtgtcatcgtcagtgcggtacgtactgctatcggtagttttaacggttca60ctcgcttccaccagcgccatcgacctgggggcgacagtaattaaagccgccattgaacgt120gcaaaaatcgattcactacacgttgatgaagtgattatgggtaacgtgttgcaagccgga180ctggggcaaaatccggcacgtcaggcgctgctaaaaagcggactagctgaaacggtgtgc240ggattcacggtcaacaaagtgtgcggttcaggtctgaaaagcgtggcgcttgctgcacag300gcgattcaggcaggtcaggcacagagcattgtggcggggggtatggaaaatatgagttta360gcgccctacttactcgatgcaaaagcacgctctggttatcgtcttggagacggacaggtt420tatgacgtaatcctgcgcgatggcctgatgtgcgccacccatggttatcatatggggatt480accgccgaaaacgtggctaaagagtacggaattacccgtgaaatgcaggatgaactggcg540ctacattcacagcgtaaagcggcagccgcaattgagtccggtgcttttacagccgaaatc600gtcccggtaaatgttgtcacccggaagaaaaccttcgtcttcagtcaagacgaattcccg660aaagcggattctacggctgaagcgttaggcgcattgcgcccggccttcgataaagcagga720acagtcaccgccgggaacgcgtcaggtattaacgacggtgctgccgctctggtgattatg780gaagaatctgcggcgctggcagcaggcctgaatcccctggcacgcattaaaagttatgcc840agcggtggcgtgccccccgcattgatgggtatggggccagtacctgctacgcaaaaagcg900ttacaactggcggggctgcaactggcggatattgatctcattgaggctaatgaagcattt960gctgcacagttccttgccgttgggaaaaccctgggctttgatcctgagaaagtgaatgtc1020aacggcggggccatcgcgctcggacatcctatcggtgccagtggtgctcgtattctggtc1080acactattacatgcaatgcaggcacgcgataaaacgctggggctggcaacactatgcatt1140ggtggcggccagggaattgcgatggtgattgagcggttgaattaa118551476DNA人工序列5ttatttttttacatcgtaagatcttctaaatttgtcatcgatgttggtcaagtagtaaac60accactttgcaaatgctcaatggaaccttgaggtttgaagttcttcttcaaatgggcatt120ttctctcaattcgatggcagcttcgtaatcctttggagtttcggtgattctcttggctaa180tttgttagtaatatctaattccttgataatatgttggacgtcaccaacaattttgcaaga240atatagagatgcagctaaaccggaaccgtaagaaaataaaccaacacgcttgccttgtaa300gtcgtcagatccaacatagtttaatagagatgcaaaggcggcataaacagatgcggtgta360catgttacctgtgtttgttggaacaatcaaagattgggcaactctctctttgtggaatgg420cttagcaacattaacaaaagttttttcaatgttcttatcggttaaagattcgtcataatc480gcgagtagctaattcggcgtcaacttctgggaacaattgaggattggctctgaaatcgtt540atatagtaatctaccgtatgattttgtgaccaatttacaggttggaacatggaaaacgtt600gtagtcgaaatatttcaaaacgttcaaagcatccgaaccagcgggatcgctaaccaaccc660tttagaaatagccttcttggaataactcttgtaaacttgatcaagagccttgacgtaaca720agttaatgaaaaatgaccatcgacgtaaggatattcgctggtgaaatctggcttgtaaaa780atcgtaggcgtgttccatgtaagaagctcttacagagtcaaatacaattggagcatcagg840accgatccacatagcaacagtaccggcaccaccggttggtcttgcggcacccttatcgta900gatggcaatatcaccgcaaactacaatggcgtctctaccatcccatgcgttagattcaat960ccagttcaaagagttgaacaacgcgttggtaccaccgtaacaggcattaagcgtgtcaat1020accttcgacgtcagtgttttcaccaaacaattgcatcaagacagacttgacagacttgga1080cttgtcaatcagagtttcagtaccgacttctaatctaccaattttgttagtgtcgatatt1140gtaactcttgatcaacttagacaaaacagttagggacatcgagtagatatcttctctgtc1200attgacaaaagacatgttggtttggcccagaccaattgtgtatttaccttgagaaacgcc1260atcaaatttctctagctcagattggttgacacattgagttgggatgtaaatttggatacc1320tttaataccgacattttgaggtctggttttttgttcagcggtcttttgtttttttagttc1380agtcatttgcaagtttgtattgtgtaattgttgttgcttttgcggcctaagtcttccctt1440aataccacaccaacaaagtttagttgagagtttcat14766381DNA人工序列6atgtcagactgcggagcgcgccccaaaaaacccatgagcgccttcatgttgtggatgaat60tccaccgggcggaagcacataaaagcggagcatcccgattttagtgtccaagaagtgtct120gtgaagggcggagagatgtggcgagccatggccgatgaggacaagatcgtgtggcaggag180tcggccaccacggcaatggccgagtacaaggagaagttgaagcagtggaatttccccaag240gagcaccgcttttcggacacgcaatgtatttgttcctcaaatactaaccaatgccccacc300ctttttgtgtacgacaccatggatgactcgatgactccgatctgcaggaagtgcttatca360aagaccaggtgccttcactaa38171332DNA人工序列7atgtcattaccgttcttaacttctgcaccgggaaaggttattatttttggtgaacactct60gctgtgtacaacaagcctgccgtcgctgctagtgtgtctgcgttgagaacctacctgcta120ataagcgagtcatctgcaccagatactattgaattggacttcccggacattagctttaat180cataagtggtccatcaatgatttcaatgccatcaccgaggatcaagtaaactctcaaaaa240ttggccaaggctcaacaagccaccgatggcttgtctcaggaactcgttagtcttttggat300ccgttgttagctcaactatccgaatccttccactaccatgcagcgttttgtttcctgtat360atgtttgtttgcctatgcccccatgccaagaatattaagttttctttaaagtctacttta420cccatcggtgctgggttgggctcaagcgcctctatttctgtatcactggccttagctatg480gcctacttgggggggttaataggatctaatgacttggaaaagctgtcagaaaacgataag540catatagtgaatcaatgggccttcataggtgaaaagtgtattcacggtaccccttcagga600atagataacgctgtggccacttatggtaatgccctgctatttgaaaaagactcacataat660ggaacaataaacacaaacaattttaagttcttagatgatttcccagccattccaatgatc720ctaacctatactagaattccaaggtctacaaaagatcttgttgctcgcgttcgtgtgttg780gtcaccgagaaatttcctgaagttatgaagccaattctagatgccatgggtgaatgtgcc840ctacaaggcttagagatcatgactaagttaagtaaatgtaaaggcaccgatgacgaggct900gtagaaactaataatgaactgtatgaacaactattggaattgataagaataaatcatgga960ctgcttgtctcaatcggtgtttctcatcctggattagaacttattaaaaatctgagcgat1020gatttgagaattggctccacaaaacttaccggtgctggtggcggcggttgctctttgact1080ttgttacgaagagacattactcaagagcaaattgacagtttcaaaaagaaattgcaagat1140gattttagttacgagacatttgaaacagacttgggtgggactggctgctgtttgttaagc1200gcaaaaaatttgaataaagatcctaaaatcaaatccctagtattccaattatttgaaaat1260aaaactaccacaaagcaacaaattgacgatctattattgccaggaaacacaaatttacca1320tggacttcataa133281356DNA人工序列8atgtcagagttgagagccttcagtgccccagggaaagcgttactagctggtggatattta60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权利要求：1.一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：S1糖蜜除杂纯化、S2β-法尼烯重组宿主细胞的构建、S3将重组宿主细胞接种到含有除杂纯化后的糖蜜的培养基中进行异源诱导表达合成β-法尼烯、S4通过发酵控制提高β-法尼烯的产量。2.根据权利要求1所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：（1）称量：称取糖蜜原液加入1.5-2.0倍的水，将糖蜜稀释至16-17波美度，得稀糖液；（2）酸化：稀糖液倒入发酵罐中，加入浓硫酸及浓磷酸调整酸度，pH4.0-4.5，进行酸化；（3）通风：通蒸汽加热煮沸酸化后的稀糖液，加热促使胶体蛋白凝固，便于沉淀离心，加热煮沸后，保温90℃，同时通入进罐空气1h，以去除有害气体NO2、SO2及挥发性物质；（4）加碱中和：通风处理后的稀糖液装入暂存桶，加入石灰乳调节pH至5.0-5.5；（5）离心澄清：用高速离心机离心除去加碱中和后的稀糖液中的杂质，取清液；（6）加热灭菌：清液倒入清洗干净的发酵罐中，通汽加热至90℃，保温0.5h；（7）保压存放：灭菌好后将发酵罐密闭，通气保压1.0Mpa，常温暂存备用。3.根据权利要求1所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括：（1）通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成β-法尼烯的相关基因，相关基因包括甲羟戊酸途径中乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）基因atoB、HMG-CoA合酶（ERG13）基因erg13、HMG-CoA还原酶（tHMG1）基因thmg1、甲羟戊酸激酶（ERG12）基因erg12、磷酸甲羟戊酸激酶（ERG8）基因erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD1）基因mvd1、异戊烯焦磷酸异构酶（IDI）基因idi、法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）基因ispA、法尼烯合酶（AFS）基因afs；（2）构建在同一宿主细胞中兼容的多重重组质粒，所述多重重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共表达合成β-法尼烯的相关蛋白；（3）多重重组质粒转化导入到宿主细胞中获得合成β-法尼烯的重组宿主细胞。4.根据权利要求1所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述步骤S3具体包括：将重组宿主细胞进行活化并接入250mL装有LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用水定容到1000mL）的三角瓶中培养，摇床温度30-38℃，转速180-220rmin，培养至OD600到0.8±0.2，以3-20%的接种量接入1000mL二级发酵摇瓶培养，摇床温度35-38℃，转速180-250rmin，培养至OD600到1.2±0.2，以5%-8%的接种量接入30L发酵罐发酵培养。5.据权利要求1所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括：整个发酵过程通风量控制在0.5vvm-1.5vvm，发酵罐搅拌转速控制在200rmin-400rmin，发酵液溶氧量控制在2%-90%，pH为7.0±0.4（用20%硫酸和30%氨水控制发酵液pH）；发酵前期（0h-20h）发酵温度为35℃-37℃，发酵中期（21h-48h）发酵温度为30℃-35℃，发酵后期（49h-结束）为28℃-35℃；当培养至OD600为8-20，向发酵培养基中接入终浓度为0.1-0.5mmolL异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），2h-10h小时后接入占发酵液体积10%-20%的萃取剂，所述萃取剂为正癸烷、正十二烷、石油醚、正辛烷中的一种或多种；发酵过程中当糖浓度（°BX）下降到（4±1）%时开始补料，控制发酵液中糖浓度（°BX）在4.0±0.2。6.据权利要求2所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述糖蜜原液中的糖蜜为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜或两者的组合，组合情况下，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的重量比为100:25-1000。7.据权利要求3所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌，重组宿主细胞为大肠杆菌B21，构建的重组宿主细胞大肠杆菌B21能够表达乙酰乙酰基CoA硫解酶（AtoB）、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼烯合酶共9种酶；大肠杆菌B21，包含pKK223-3、PMCSG9、pMal-c4X三种质粒，其中pKK223-3上包含atoB、thmg1、mvd1三种基因，PMCSG9上包含erg13、erg12、erg8、ispA四种基因，pMal-c4X上包含idi、afs两种基因；所述质粒pKK223-3选用tac启动子、质粒PMCSG9选用T7启动子、质粒pMal-c4X选用tac启动子。8.据权利要求4所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述二级发酵摇瓶培养和30L发酵罐发酵培养过程中，培养基的主要组成如下：除杂纯化后的糖蜜占培养基比重2%-20%，酵母粉或者酵母膏或两者的组合（组合情况下酵母粉、酵母膏的重量比为100:1-10000），占培养基比重1%-10%、蛋白胨占培养基比重1.5%-8.5%、柠檬酸铵占培养基比重0.1%-5%、硫酸镁或氯化镁占培养基比重0.1%-2%，硫酸锰占培养基比重0.05%-0.9%，硫酸锌占培养基比重0.02%-0.8%。9.据权利要求5所述的一种β-法尼烯的生产方法，其特征在于：所述补料过程中补充的物料重量百分比为除杂纯化后的糖蜜40%-60%，硫酸铵20%-50%，蛋白胨5%-10%，上述物料于110-120℃高压灭菌25-40min备用。10.一种气相色谱法检测发酵液中β-法尼烯的方法，其特征在于：包括如下步骤：H1、发酵液前处理：取10mL以上发酵液，9000-12000rmin离心3-8min，油相和水相分层，吸取上层油相，用0.44um有机滤膜过滤，得到滤出液；H2、使用安捷伦7890A气相色谱仪，19091JHP-5色谱柱柱长30m;内径0.32mm;膜厚250um，配置β-法尼烯系列标准溶液，制成浓度分别为5gL、10gL、15gL、20gL的β-法尼烯标准溶液，分别进样检测，绘制线性回归方程，并计算R值，使R值在99%以上，上述β-法尼烯检测条件为：柱箱温度：初始温度65-75℃，保留2min，以10℃min升至220-280℃,保留1min，进样口温度220-280℃，进样量1uL，品注入分流比1:50，检测器（FID）温度260-280℃，氮气作为载气，入口压力是12-18psi，模式为恒流模式。

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