申请/专利权人：CJ第一制糖株式会社

申请日：2017-01-16

公开（公告）日：2022-09-20

公开（公告）号：CN108699538B

主分类号：C12N9/12

分类号：C12N9/12;C12P19/02;C12N15/70

优先权：["20160115 KR 10-2016-0005463"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.09.20#授权;2018.11.16#实质审查的生效;2018.10.23#公开

摘要：本申请案是有关于一种稳定性优异的高温性及耐热性的新的多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述葡萄糖激酶的组成物及使用所述葡萄糖激酶制备葡萄糖‑6‑磷酸的方法。

主权项：1.来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶用于制备葡萄糖-6-磷酸的用途，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的氨基酸序列如序列号2所示或由序列号1的DNA序列编码，及所述葡萄糖-6-磷酸是由葡萄糖和多磷酸通过所述耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶在40℃至60℃的温度下而生产。

全文数据：新的多磷酸依存性葡萄糖激酶与用其制备葡萄糖-6-磷酸的方法技术领域[0001]本发明是有关于一种新的多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述葡萄糖激酶的组成物及使用所述葡萄糖激酶制备葡萄糖-6-磷酸的方法。背景技术[0002]葡萄糖-6-磷酸D-glucose6-phosphate为生物体代谢中解糖途径glycolysispathway及五碳糖磷酸途径（pentosephosphatepathway中的主要磷酸化产物。由于葡萄糖-6-磷酸能够转换成各种代谢产物，因此其于产业中是非常有用的化合物。对于利用通过一系列的多种酶反应自葡萄糖-6-磷酸来生产高附加值化合物的生物制程来说，开发经济性的制备葡萄糖-6-磷酸的方法是非常重要的。[0003]至今为止，为了利用酶来直接制备葡萄糖-6-磷酸，已知有如下方法:使用葡萄糖作为原料及分别利用二磷酸腺苷adenosinediphosphate，ADP或三磷酸腺苷adenosinetriphosphate，ATP作为磷酸基供给体的ADP依存性葡萄糖激酶（ADP-dependentglucokinase，EC2·7·1·147或ATP依存性葡萄糖激酶ATP-dependentglucokinase，EC2·7·I·2，或使用利用葡萄糖及磷酸phosphate的聚合物的多磷酸polyphosphate，PolyPin作为原料的多磷酸依存性葡萄糖激酶（PolyPiindependentglucokinase，EC2.7.1.63。[0004]根据使用ADPATP依存性葡萄糖激酶的方法，是将ADP或ATP的磷酸基转移至葡萄糖而生产葡萄糖-6-磷酸。此方法的缺点为需要高价的ADP或ATP。作为解决该缺点的方法，已知有于单磷酸腺苷adenosinemonophosphate，AMP或ADP中同时使用利用PolyPi11作为磷酸基供给体的多磷酸-二磷酸腺苷磷酸转移酶（p〇Iyph〇sphate-AMPADPphosphotransferase而使ATP再生的方法，但因AMP、ADP及ATP的稳定性不高等问题而于实用化方面存在限制。[0005][反应式1][0006][0007]使用多磷酸依存性葡萄糖激酶的方法是将PolyPin的磷酸基转移至葡萄糖而直接生产葡萄糖-6-磷酸的方法，此方法可使用低价且稳定的PolyPin而直接生产葡萄糖-6-磷酸。因此，就制程的经济实用化方面而言，可谓优于使用ADPATP依存性葡萄糖激酶来生产葡萄糖-6-磷酸的制备方法。[0008][反应式2][0009]发明内容[0010]发明所解决的课题[0011]本发明是有关于一种新的多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述酶的组成物及使用所述葡萄糖激酶生产葡萄糖-6-磷酸的方法。对于特定化合物的酶的制备制程的效率来说，酶的稳定性可谓非常重要的特性。然而，至今为止，与本发明相关的已知多磷酸依存性葡萄糖激酶局限于部分微生物中，这些经分离的酶大多是来源于中温性微生物的酶，而被指出为热稳定性较低表1。为解决该问题，本发明提供一种源自嗜热微生物的稳定性优异的高温性及耐热性的新的多磷酸依存性葡萄糖激酶、包含所述酶的组成物及使用所述葡萄糖激酶生产葡萄糖-6-磷酸的方法。[0012][表1][0013][0014]葡萄糖-6-磷酸glucose-6-phosphate为生物体代谢中解糖途径glycolysispathway及五碳糖磷酸途径（pentosephosphatepathway中的主要磷酸化产物。由于葡萄糖-6-磷酸能够转换成各种代谢产物，因此于产业中是非常有用的化合物。于利用通过一系列的多种酶反应自葡萄糖-6-磷酸来生产高附加值化合物的生物制程来说，开发经济性的制备葡萄糖-6-磷酸的方法是非常重要的。[0015]通常，于生物体代谢中为了实现自葡萄糖至葡萄糖-6-磷酸的酶的转换而使用ATP或ADP作为磷酸基供给化合物，就商业性而言，所述反应途径因ATP或ADP的较高价格而限制葡萄糖-6-磷酸的酶的制备制程的开发。再者，由于通过微生物发酵而生产的葡萄糖-6-磷酸无法穿透细胞膜，故此生产方法是不合适的。[0016]由于作为磷酸基供给化合物的磷酸的聚合物（即PolyPinPolyphosphate大量存在于自然界，或可通过化学制造法而经济性地低价生产，因此可谓商业价值较高的化合物。因此，开发使用酶并利用此种PolyPin来有效地制备自葡萄糖至葡萄糖-6-磷酸的方法，就商业性而言可谓非常重要。[0017]然而，大部分的利用PolyPin来生产葡萄糖-6-磷酸的前述酶在低温下反应且具有热稳定性低的缺点，因此在生产葡萄糖-6-磷酸方面存在限制。[0018]解决课题的手段[0019]本发明提供一种来源于嗜热微生物的稳定性优异的高温性及耐热性的新的多磷酸依存性葡萄糖激酶及使用其生产葡萄糖-6-磷酸的方法。[0020]以下，详细地对本发明的各种实施方式进行说明。[0021]具体而言，本发明的一实施方式可提供来源于奇异球菌Deinococcus属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶。[0022]具体而言，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可为包含序列号2的胺基酸序列。所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可为包含与序列号2的胺基酸序列具有70%以上、具体为80%以上、更具体为90%以上、进而具体为95%以上的相同性的胺基酸序列的任意蛋白质，且实质上具有与所述酶相同或类似的酶活性。也就是说，作为与序列号2具有此种相同性的胺基酸序列，只要是实质上显示出多磷酸依存性葡萄糖磷酸化的功能的胺基酸序列即可，因此部分序列缺失、变化、置换或添加的蛋白质变异体亦包含于本发明的范围内。[0023]本发明中的用语“相同性”意指可具有共同进化起源或并非共同进化起源的多肽polypeptide序列或多核苷酸polynucleotide的序列之间的同一"性或相应性，并可由百分比表示。于本说明书中，由“相同性％”表示具有与多肽序列或多核苷酸序列相同或相似的活性的胺基酸序列的相同性序列。例如，可利用计算分数（score、同一1identity及相似性similarity等的媒介参数parameter的标准软体，具体而言，利用BLAST2.0或于指定的严格条件下通过所实施的混合实验来比较序列而进行确认，可通过本领域技术人员所熟知的方法来决定指定的合适的混合条件（例如，萨姆布鲁克等（Sambrooketal.，1989,以下参考）。于一实施例中，于两个胺基酸序列中，多肽相对于胺基酸序列的特定长度的匹配度至少为21%具体而言至少约为50%，特别是约为75%、90%、95%、96%、97%或99%时，为“实质上相同”或“实质上相似”。[0024]进而，本发明的又一实施方式可提供一种编码来源于奇异球菌Deinococcus属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶的多核苷酸。具体而言，本发明可提供一种编码具有由序列号2的胺基酸序列所的具有多磷酸依存性葡萄糖激酶活性的蛋白质的多核苷酸。[0025]本发明中的用语“多核苷酸”是核苷酸单体通过共价键而连接成链状的核苷酸的聚合物，通常意指至少具有特定长度的DNA链或RNA链。[0026]所述编码具有多磷酸依存性葡萄糖激酶活性的蛋白质的多核苷酸序列可包含编码所述序列号2的胺基酸的多核苷酸序列。考量到密码子codon的退化性degeneracy或用于表达所述酶的生物所具有的密码子偏好性，所述多核苷酸可于不使多肽的胺基酸序列发生变化的范围内于编码区域实现各种变化。例如，所述多核苷酸序列可具有序列号1的多核苷酸序列。再者，与所述序列70%以上、具体为80%以上、更具体为90%以上、进而具体为95%以上、尤其具体为98%以上的相同性的核苷酸序列可包含可编码实质上具有多磷酸依存性葡萄糖磷酸化活性的多肽的多核苷酸。再者，应明白具有部分序列缺失、经变化、置换或添加的胺基酸序列的变异体亦包含于本发明的范围内。[0027]以组成物的整体容积为基准，包含葡萄糖为1重量％至3重量％、多磷酸为1重量％至10重量％、多磷酸依存性葡萄糖激酶为〇.Imgml至2.Omgml及可选择性添加镁离子例如:MgCl2为ImM至20mM的组成物的至葡萄糖-6-磷酸的转换产率可为60%以上，可更具体为70%以上，可进而具体为80%以上。[0028]包含葡萄糖为1.5重量％、多磷酸为3重量％、多磷酸依存性葡萄糖激酶为0.3mgml及镁离子例如=MgCl2为IOmM的组成物的至葡萄糖-6-磷酸的转换产率可为60%以上，可更具体为70%以上，可进而具体为80%以上。[0029]以组成物的整体容积为基准，包含葡萄糖为5重量％至20重量％、多磷酸为5重量％至10重量％、多磷酸依存性葡萄糖激酶为O.lmgml至2.0mgml及镁离子例如=MgCl2为ImM至20mM的组成物的至葡萄糖-6-磷酸的转换产率可为50%以上，可更具体为60%以上，可进而具体为70%以上。[0030]葡萄糖为15重量％、多磷酸为7.5重量％、多磷酸依存性葡萄糖激酶为0.3mgml及镁离子例如=MgCl2为IOmM的组成物的至葡萄糖-6-磷酸的转换产率可为50%以上，可更具体为60%以上，可进而具体为70%以上。[0031]所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可于40°C至60°C下中显示出活性，可更具体为于45°：至55°：下显示出活性，可进而具体为于50°C下显示出活性。[0032]所述多磷酸依存性葡萄糖激酶可于pH7至pH9下显示出活性，可更具体为于pH8下显示出活性。[0033]所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性可于存在镁离子的情形下增大。[0034]所述镁离子的浓度可具体为ImM至20mM，可更具体为5mM至15mM，可进而具体为IOmM0[0035]本发明的又一实施方式是有关于一种包含本发明所揭示的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的组成物。所述组成物可进一步包含镁离子。所述组成物可用于制备葡萄糖-6-磷酸。于本实施方式中，对各成分及含量的详细说明与上述实施方式或下述实施例中所说明的内容相同，因此省略对其的详细的记载。[0036]本发明的又一实施方式可提供一种制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的组成物制备葡萄糖-6-磷酸。[0037]所述制备反应条件可为40°C至60°C的温度、pH7至pH9的条件。[0038]所述葡萄糖可通过使淀粉或纤维素cellulose液化或糖化而制备。[0039]所述多磷酸作为磷酸供给体（donor，其例如可为六偏磷酸钠（sodiumhexametaphosphate、三聚磷酉爱钠（sodiumtripolyphosphate、六偏磷酉爱钾（potassiumhexametaphosphate等，但当然并不限定于此，亦可使用市售的多磷酸。[0040]所述葡萄糖-6-磷酸的制备可于40°C至60°C下进行，可更具体为于45°C至55°C下进行，可尤其具体为于50°C下进行。[0041]所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的分子量可为IOkDa至100kDa，可具体为20kDa至50kDa〇[0042]于制备所述葡萄糖-6-磷酸时，可进一步包含镁离子，例如可进一步包含MgCl2或MgSO4o[0043]以所述组成物的体积为基准，所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的含量可为O.lmgml至0.5mgml，可更具体为0.2mgml至0.4mgml，可尤其具体为0.3mgml。[0044]以整体组成物的重量为基准，所述葡萄糖可为1重量％至30重量％，可更具体为1重量％至20重量％，可尤其具体为3重量％至15重量％。[0045]以整体组成物的重量为基准，所述多磷酸可为1重量％至15重量％，可更具体为1重量％至1〇重量％，可尤其具体为1.5重量％至7.5重量％。[0046]本发明的又一实施方式提供一种方法，其于利用本发明所述的多磷酸依存性葡萄糖激酶制造葡萄糖-6-磷酸时添加镁离子，藉此增大葡萄糖-6-磷酸的转换活性。[0047]于葡萄糖-6-磷酸生产用组成物中，所述镁离子可具体为ImM至20mM，可更具体为5mM至15mM，可进而具体添加为IOmM的浓度。[0048]MgCl2或MgSO4等可作为所用的镁离子，但本发明不现于此，只要是可于组成物中提供镁离子的镁盐形态皆可。[0049]本发明的又一实施方式可提供一种制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含多磷酸依存性葡萄糖激酶、糖化酶、淀粉及多磷酸的组成物来制备葡萄糖-6-磷酸。[0050]所述制备反应条件可为40°C至60°C的温度、PH7至PH9的条件。[0051]所述糖化酶可为α-淀粉酶alpha-amylase、葡萄糖淀粉酶glucoamylase及α-葡萄糖苷酶alpha-glcosidase中的一种以上。[0052]作为又一实施方式，本发明可提供生产所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的微生物，具体而言，可提供大肠杆菌属Bscherichiasp.微生物。[0053]本发明中的用语“生产多磷酸依存性葡萄糖激酶的微生物”表示于生物体内可生产所述酶的原核或真核微生物菌株，具体而言，意指可通过遗传操作或通过自发突变而培养或于微生物体内累积所述酶的微生物。[0054]具体而言，所述微生物只要是能表达序列号2的多肽的微生物即可，并不特别限定其种类，且可为原核细胞或真核细胞，但可具体为原核细胞。例如，可包含属于大肠杆菌Escherichia属、伊文氏杆菌（Erwinia属、锯杆菌（Serratia属、普罗威登斯菌Providencia属、棒状杆菌Corynebacterium属及短杆菌Brevibacterium属的微生物菌株，具体而言，可为属于大肠杆菌（Escherichia属的微生物，例如可为大肠杆菌Eschrichiacoli，但并不限定于此。[0055]于本发明中的用语“表达expression”能通过对可操作地operably包含编码本发明的多肽的多核苷酸的重组载体vector进行转型，或通过将编码多肽的所述多核苷酸插入至染色体内而达成，但本发明不限于此。[0056]本发明中的用语“转型（transformation”意指可将包含编码目标蛋白质的多核苷酸的载体导入至宿主细胞内而于宿主细胞内表达所述多核苷酸所编码的蛋白质。只要是能于宿主细胞内表达经转型的多核苷酸，则不论是插入至宿主细胞的染色体内或是位于染色体外均包含在本发明的范围内。再者，所述多核苷酸包含编码目标蛋白质的DNA及RNA。能以任意形态将所述多核苷酸导入所述宿主细胞内，只要所述多核苷酸能被导入至所述宿主细胞并被表达即可。例如，所述多核苷酸自我表达，但能以作为包含所需要的所有要素的遗传基因结构的表达盒expressioncassette的形态导入至宿主细胞，且并不限定于此。通常所述表达盒可包含以可操作的方式连接于所述多核苷酸的启动子promoter、转录终止信号、核糖酶ribozyme结合部位及转译终止信号。所述表达盒可为可自我复制的表达载体的形态。再者，所述多核苷酸亦可为以自身形态导入至宿主细胞而以可操作的方式与宿主细胞中表达所需要的序列连接的多核苷酸。[0057]再者，上述中的用语“以可操作的方式连接”意指将对编码本发明的目标蛋白质的多核苷酸的转录加以起始及媒介的启动子序列与所述遗传基因序列功能性连接。[0058]本发明中的用语“载体”是指用以向宿主细胞复制（cloning和或转移碱基的任意媒介物。载体可为如下复制子replicon:能与其他的DNA片段结合而实现经结合的片段的复制。所谓“复制子”是指于生物体内作为DNA复制的自我单元而发挥功能的（即通过自我调节而可复制的）任意的遗传单位（例如，质体（plasmid、菌体（phage、黏接质体cosmid、染色体、病毒virus。“载体”可包含于试管内、生物体外或生物体内，用以向宿主细胞导入碱基的病毒及非病毒媒介物，再者，可包含微球形状的DNA。例如，所述载体可为无细菌bacteriaDNA序列的质体。为了减少转殖基因表达默化silencing而实现自质体DNA载体更持久的表达，实施CpG区域中所富含的细菌DNA序列的去除（例如，艾哈德等Ehrhardt，A.et.al·2003人类基因疗法（HumGeneTher10:215-25;耶提（Yet，N.S2002分子治疗MolTher5:731-38;陈等（Chen，Z.Y.etal.2004基因疗法GeneTher11:856-64。再者，所述载体可包含转位子（transposon遗传学年评（AnnuRevGenet.2003;37:3-29.，又可包含人工染色体。具体而言，可于pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322及pMW118载体或其等中使用使启动子等变异的变异载体，但并不限定于此。[0059]特别是，于本发明中载体可为DNA制造物，以能于适宜的宿主内表达目标蛋白质。所述DAN制造物含有编码以可操作的方式连接于适宜的表达调节序列的所述目标蛋白质的多核苷酸的碱基序列。所述表达调节序列可包含可起始转录的启动子、用以调节所述转录的任意的操作子operator序列、编码适宜的mRNA核糖酶结合部位的序列及调节转录与解读的终止的序列。向合适的宿主细胞内进行转型之后，载体可不干涉宿主基因组genome而发挥复制的功能，且基因组可整合于所述载体自身。[0060]于本发明中所使用的载体，只要是可于宿主细胞内进行复制的载体即可，则并不特别地限定，可使用本业界所熟知的任意的载体。作为通常所使用的载体的示例，可为天然状态或重组状态的质体、黏接质体、病毒及噬菌体bacteriophage。例如，pWE15、M13等噬菌体载体或λWE15、λE15、λE15、E15、M13等噬菌体载体及Charon21A等可作为噬菌体载体或黏接质体载体，但并不限定于此。可使用pBR类、pUC类、pBluescriptll类、pGEM类、pTZ类、PCL类及ρΕΤ类作为质体载体，但并不限定于此。[0061]可提供包含编码所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因的重组表达载体。[0062]可提供一种大肠杆菌BL21DE3CJpET21a-Dg_ppgkEscherichiacoliBL21DE3CJpET21a-Dg_ppgk保藏机构：韩国微生物保藏中心，保藏日：2015.12.17,保藏号：KCCMl1793P，其特征在于利用所述重组表达载体进行转型。[0063]可提供通过使用本发明的酶及具有其他功能的酶α-淀粉酶α-amylase、葡萄糖淀粉酶glucoamylase、α-葡萄糖苷酶α-glucosidase、异构酶（isomerase、丁醛醇酶aldolase、合成酶（synthase、激酶kinase、磷酸酶phosphatase等）的共锅酶反应one-potenzymaticconversions而自多磷酸及葡萄糖或淀粉经济性地制备下述各种化合物的方法。[0064]于产业中有用的各种化合物为葡萄糖-1-磷酸D-glucoseΙ-phosphate、果糖_6_磷酸（D-fructose6-phosphate、果糖-1,6-二磷酸（D-fructose1,6-bisphosphate、肌醇_3_磷酸（myo-inositol3-phosphate、肌醇（myo-inositol、葡萄糖酸酸（D-glucuronate、葡萄糖胺_6_磷酸（D-glucosamine6_phosphate、葡萄糖胺（D-glucosamine、N_乙酰葡萄糖胺_6_磷酸（N-acetyl-D-glucosamine6-phosphate、N_乙酰葡萄糖胺N-acetyl-D-glucosamine、N_乙酰甘露糖胺-6-磷酸N-acetyl-D-manosamine6-phosphate、N_乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-manosamine、N_乙酰神经胺糖酸（N-acetylneuraminicacid,sialicacid、甘露糖-6-磷酉爱（D-mannose6-phosphate、甘露糖（D_mannose、塔格糖-6-磷酸（D-tagatose6-phosphate塔格糖（D-tagatose、阿洛酮糖-6-磷酸（D-allulose6-phosphate、阿洛酮糖（D_allulose、甘油酸-3-磷酸（D-glyceraldehyde3-phosphate、二轻丙酮磷酸（dihydroxyacetonephosphate等，但当然并不限定于此，可包含利用葡萄糖-6-磷酸的各种化合物等。[0065]发明的效果[0066]本发明的酶可于高温下发生酶反应，故而可于高温下的酶反应制程中增加基质PolyPin、葡萄糖）的溶解度，因此能以高浓度使用基质，且因物质的扩散速度增加、反应速度增加、反应时间缩短等而可提高单位产率。而且，因于高温下进行的酶反应制程而可最大限度地减少因外部的微生物引起的制程污染。再者，具有如下优点:若于中温性微生物中将本发明的酶进行重组并大量表达后利用耐热性的特性，则可实现高温热处理而可对来源于中温性微生物中的蛋白质选择性地进行变性与去除。附图说明[0067]图1是利用流程图（flow-chart来表示本发明的制备方法。[0068]图2是ATP自身与葡萄糖反应的反应式。[0069]图3是多磷酸与葡萄糖反应的反应式。[0070]图4是于SDS-PAGE凝胶gel中进行的尺寸标记Marker，M、细胞破碎后的助酶液粗萃CrudeExtract，CE、未诱导基因表达的酶液负控制NegativeControl，NE及基因表达后精制的酶液纯化酶PurifiedEnzyme，PE的电泳分析图片。[0071]图5是表示重组多磷酸依存性葡萄糖激酶对应于pH的活性的曲线图（graph。[0072]图6是表示表示重组多磷酸依存性葡萄糖激酶对应于温度的活性的曲线图。[0073]图7是表示表示重组多磷酸依存性葡萄糖激酶对应于金属粒子的种类的活性的曲线图。[0074]图8是表示表示重组多磷酸依存性葡萄糖激酶对应于MgCl2的浓度的活性的曲线图。[0075]图9是表示表示重组多磷酸依存性葡萄糖激酶对应于酶的热处理温度的活性的曲线图。具体实施方式[0076]如今，来源于淀粉或纤维素的葡萄糖是较低价的碳源且可大量生产，为了生产化学、医学、化妆品及食品产业中有用的各种化合物，其被用作化学或生物学的转换制程的基础原料。[0077]然而，特别是于生物制程中的酶转换制程中，作为基础原料的磷酸化葡萄糖因如今的高价格而使用十分有限。[0078]于产业方面，作为于葡萄糖代谢中非常重要的代谢产物的葡萄糖-6-磷酸于利用存在于自然界（生物体）的各种代谢酶时，可作为能诱导非常有用的反应的基础原料来使用。[0079]因此，本发明提供一种可自葡萄糖及多磷酸经济性地生产作为可生产产业中各种有用的化合物的原料的葡萄糖-6-磷酸的酶及酶的制备方法。[0080]再者，提供一种于运用本发明的所制备的葡萄糖-6-磷酸及制备方法时，可利用酶制备于医药、化妆品及食品产业中的高附加功能性化合物。[0081][实施例][0082]实施例1:包含多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因的重组表达载体及转型微生物的制备[0083]为了提供本发明的新的高温性及耐热性多磷酸依存性葡萄糖激酶polyphosphate-dependentglucokinase的酶而对来源于作为微生物的耐福射奇异球菌Deinococcusgeothermalis的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因Dg_ppgk进行了分离。[0084]具体而言，以于基因银行Genbank所注册的基因序列为对象，对与本发明的酶相关的基因序列进行了一次筛选，于其中最终只选定了来源于嗜热微生物的基因序列。以对基因碱基序列[序列号1]与注册为胺基酸序列[序列号2]的耐辐射奇异球菌的基因的碱基序列进行比较分析的结果为基础，研发出正向引子ForwardPrimer，序列号3、反向引子ReversePrimer、序列号4。通过经合成的引子而自耐福射奇异球菌的染色体DNAgenomicDNA利用聚合酶连锁反应PolymeraseChainReaction，PCR来扩大该基因（通过正向引子及反向引子而扩大的基因）。经扩大的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因使用限制酶NdeI及XhoI而插入至用于表达大肠杆菌的质体载体pET21a诺维根Novagen公司的制品），从而制备出pET21a-Dg_ppgk的重组表达载体。如上所述般所获得的重组表达载体利用普遍的转型方法参考:萨姆布鲁克等Sambrooketal.1989而于大肠杆菌BL21DE3菌株进行转型来制备出转型微生物。[0085]实施例2:重组多磷酸依存性葡萄糖激酶的制备[0086]为了制备重组多磷酸依存性葡萄糖激酶，将转型微生物接种至包含5ml的LB液体培养基的培养管（tube，于37°C的振荡培养器中进行菌种培养，直至于600nm中吸光度为2.0为止。将培养有该菌种的培养液添加至盛装有LB液体培养基的烧瓶flask而进行其培养。于600nm中的吸光度为2.0时，添加ImM的IPTG而诱导重组酶的表达生产。此时，所述过程中的搅拌速度保持为200rpm、培养温度保持为37°C。[0087]如上所述，过表达而生产的重组酶于4°C下对所述经转型的菌株的培养液以8，000Xg进行20分钟的离心分离，利用50mMTris-ClpH7.5的缓冲液进行二次清洗后，利用超音波细胞破碎机而破碎细胞。于4°C下对所述细胞破碎物以13,000Xg进行20分钟的离心分离后，仅提取上清液并使用His-Tag亲和色层分析法chromatography进行精制。利用活性测定用缓冲液50mMTris-Cl，pH7.5对涌出精制的重组酶进行透析后，使用酶的特性分析。[0088]图4的M是尺寸标记（sizemarker、CE是细胞破碎后的助酶液（粗萃（Crudeextract、NE是未诱导基因表达的酶（负控制（Negativecontrol及PE是基因表达后精制的酶纯化酶Purifiedenzyme。通过SDS-PAGE可确认到经精制的多磷酸依存性葡萄糖激酶约为30kDa图4。[0089]实施例3:重组多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性分析[0090]对来源于以于基因银行所注册的基因序列分析的结果为基础而制造的基因的经精制的重组多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性进行了分析。[0091]对于反应组成物，使用包含2%wv的葡萄糖、IOmM的MgCl2、1.5%wv的六偏磷酸钠（sodiumhexametaphosphate、0.3mgml的精制酶的50mM的Tris-HClρΗ7·5，于40°C下进行30分钟的酶反应后，利用高效液相层析法（HighPerformanceLiquidChromatography进行分析。HPLC分析条件是使用安美纳斯AminexHPX-87C伯乐（Bio-Rad色谱柱column，于80°C下，作为移动相的5mM的H2SO4溶液的流速为0.6mlmin，利用折射率检测器RefractiveIndexDetector检测分析葡萄糖-6-磷酸。[0092]因此，于来源于基因的重组蛋白质中检测出活性。[0093]实施例4:pH及温度对重组多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性的影响的分析[0094]4-1.pH影响性分析[0095]为了调查pH对所述酶的影响性，对于反应组成物，使用包含2%wv的葡萄糖、IOmM的MgC12、1.5%wV的六偏磷酸钠、0.3mgm1的精制酶的50mM的缓冲液（乙酸钠sodiumacetate，pH4-6;磷酸钾（potassiumphosphate，pH6_8;Tris-HCl，pH7-8，于4〇°C下进行30分钟的酶反应后，利用HPLC进行分析。结果如图5所示，可确认到于接近pH8时显示出最大活性。再者，于各个PH所对应的缓冲液中，于Tris-HCl缓冲液中的活性显示为最大，因此可确认到于该缓冲液中显示出最高的活性图5。[0096]4-2.温度影响性分析[0097]为了确认对应于温度变化的酶的活性，对于反应组成物，使用包含2%wv的葡萄糖、IOmM的MgCl2、1.5%wv的六偏磷酸钠、0.3mgml的精制酶的50mM的Tris-HCl，以pH7.5,于30°C至65°C下进行30分钟的酶反应后，利用HPLC进行分析。[0098]结果如图6所示，可确认到接近50°C时显示出最高的活性。[0099]实施例5:重组多磷酸依存性葡萄糖激酶的金属离子的要求性分析[0100]已知现有的多磷酸依存性葡萄糖激酶需要金属离子。为了调查不同种类的金属离子对本发明的多磷酸依存性葡萄糖激酶的活性的影响性，利用1〇mM的乙二胺四乙酸Ethylenediaminetetraaceticacid，ETDA处理后，使用经透析的酶样品。[0101]对于反应组成物，使用包含2%wv的葡萄糖、5mM的金属离子（NiS〇4、CuS〇4、MnS〇4、CaCl2、ZnS〇4、MgS〇4、MgCl2、FeS〇4、NaCl、LiCl、KCl、CoCl2、1·5%wv的六偏磷酸钠、0.3mgml的不含金属离子的酶样品的50mM的Tris-HClpH7.5，于50°C下进行30分钟的酶反应后，利用HPLC进行分析。[0102]使用未经金属离子处理的反应组成物作为对照组，并比较经金属离子处理的各反应组成物与对照组的酶活性。结果如图7所示，于所分析的金属盐中，镁对通过来源于耐辐射奇异球菌的多磷酸依存性葡萄糖激酶的葡萄糖-6-磷酸的生产最有效，特别是，于添加MgCl2的情况下，可确认到最大活性。额外对MgCl2的添加浓度进行实验，结果显示于IOmM的浓度中增加活性图8。[0103]实施例6:温度稳定性[0104]为了调查多磷酸依存性葡萄糖激酶的温度稳定性，通过于温度40°C至70°C的范围内经6个小时的热处理的酶来测定残余活性，从而进行比较分析。[0105]对于反应组成物，使用包含2%wv的葡萄糖、IOmM的MgCl2、1.5%wv的六偏磷酸钠、〇.3mgml的精制酶的50mM的Tris-HClpH7.5，于50°C下进行30分钟的酶反应后，利用HPLC进行分析。[0106]结果如图9所示，可确认到当于40°C下经过6个小时以上或于50°C以上的温度经过1个小时的处理时，酶的活性减半。[0107]实施例7.对应于不同浓度的基质的转换产率的分析[0108]为了确认利用本发明的精制酶的葡萄糖-6-磷酸的产率，以不同浓度的基质对葡萄糖-6-磷酸的转换产率进行分析。[0109]对于反应组成物，使用包含3%wv或15%wv的葡萄糖、IOmM的MgCl2、l.5%wv或7.5%wv的六偏磷酸钠、0.3mgml的精制酶的50mM的Tris-HClpH8.0，于50°C下进行不同时间段的酶反应后，利用HPLC进行分析。[0110]结果显示，使用3%wv及1.5%wv的六偏磷酸钠的情况下，于0.8小时反应后显示出88.5%的转换产率，使用15%的葡萄糖及7.5%wv的六偏磷酸钠的情况下，于24小时反应后显示出74.2%的转换产率。[0111]涉及保藏微生物或其它生物材科的说明PCT细则第13条之2PCTRO134表（1998年7月，.2猶4年1月再版:）

权利要求：1.一种来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶。2.根据权利要求1所述的来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶由序列号1的DNA序列表达。3.根据权利要求1所述的来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶具有序列号2的胺基酸序列。4.一种葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其包含来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸。5.根据权利要求4所述的葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其中以所述组成物的整体容积为基准，当所述组成物包含1重量％至3重量％的所述葡萄糖、1重量％至10重量％的所述多磷酸及〇.lmgml至2.Omgml的所述多磷酸依存性葡萄糖激酶，葡萄糖-6-磷酸的转换产率为60%以上。6.根据权利要求4所述的葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其中以所述组成物的整体容积为基准，当所述组成物包含5重量％至20重量％的所述葡萄糖、5重量％至10重量％的所述多磷酸及〇.lmgml至2.Omgml的所述多磷酸依存性葡萄糖激酶，葡萄糖-6-磷酸的转换产率为50%以上。7.根据权利要求5或6所述的葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其中所述组成物还包含镁离子。8.根据权利要求7所述的葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其中所述镁离子的浓度为ImM至20mM〇9.根据权利要求4所述的葡萄糖-6-磷酸制备用组成物，其中于40°C至60°C的温度和或pH7至pH9的条件下制备葡萄糖-6-磷酸。10.—种制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其自包含来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖及多磷酸的组成物来制备葡萄糖-6-磷酸。11.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述葡萄糖是通过使淀粉或纤维素液化或糖化而制备。12.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸为六偏磷酸钠。13.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中于40°C至60°C的温度和或pH7至pH9的条件下进行所述葡萄糖-6-磷酸的制备。14.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述组成物进一步包含镁离子。15.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述多磷酸依存性葡萄糖激酶的含量为0.lmgml至0.5mgml。16.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中以所述组成物的体积为基准，所述葡萄糖为1重量％至30重量％。17.根据权利要求10所述的制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中以所述组成物的体积为基准，所述多磷酸为1重量％至1〇重量％。18.—种自组成物制备葡萄糖-6-磷酸的方法，所述组成物包含来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、糖化酶、淀粉及多磷酸。19.根据权利要求18所述的自组成物制备葡萄糖-6-磷酸的方法，其中所述糖化酶为α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及葡萄糖苷酶中的至少一者。20.—种重组表达载体，其包含编码有如权利要求3所述的多磷酸依存性葡萄糖激酶的基因。21.—种大肠杆菌BL21DE3CJpET21a-Dg_ppgk，其保藏号为KCCM11793P，其利用如权利要求20所述的重组表达载体进行转型。22.—种通过来源于奇异球菌属的耐热性的多磷酸依存性葡萄糖激酶、葡萄糖或淀粉、多磷酸及其他酶产生反应而生产葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1，6-二磷酸、肌醇-3-磷酸、肌醇、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺-6-磷酸、葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神经胺糖酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、塔格糖-6-磷酸、塔格糖、阿洛酮糖-6-磷酸、阿洛酮糖、甘油醛-3-磷酸及二羟丙酮磷酸中的任一种的方法。

百度查询： CJ第一制糖株式会社 多磷酸依存性葡萄糖激酶与用其制备葡萄糖-6-磷酸的方法

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