申请/专利权人：广州市新合生物医疗科技有限公司

申请日：2019-03-11

公开（公告）日：2022-10-21

公开（公告）号：CN109825586B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12Q1/6851

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.10.21#授权;2019.06.25#实质审查的生效;2019.05.31#公开

摘要：本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点例如SHOX2、HOXA9和TAC1的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，经实验测试，本发明试剂盒可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

主权项：1.一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，所述试剂盒中包含下述三组特异性引物和探针组合中的任一组：（1）用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:1-2和探针SEQIDNO:7；用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:10-11和探针SEQIDNO:16；用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:19-20和探针SEQIDNO:25；用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:28-29和探针SEQIDNO:30；（2）用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:3-4和探针SEQIDNO:8；用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:12-13和探针SEQIDNO:17；用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:21-22和探针SEQIDNO:26；用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:28-29和探针SEQIDNO:30；（3）用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:5-6和探针SEQIDNO:9；用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:14-15和探针SEQIDNO:18；用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物和探针：特异性引物SEQIDNO:23-24和探针SEQIDNO:27；用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:28-29和探针SEQIDNO:30。

全文数据：用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法技术领域本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点例如SHOX2、HOXA9和TAC1的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。背景技术肺癌是全世界范围内的主要死亡原因之一。据美国癌症协会统计，2018年仅在美国就有大约234030例新发肺癌病例和154050例肺癌死亡病例，估计肺癌死亡人数大约相当于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤死亡人数的总和。目前针对肺癌的治疗，早期诊断的非转移性肿瘤多采用手术和放射疗法，后期癌症采用化学疗法和放射疗法的组合，更晚期或终末期癌症则采用化学疗法结合靶向疗法。临床数据显示，I-II期肺癌患者的5年总生存率为30-49％，而III期及以后则为1-14％。由此可见，早期发现及时治疗对肺癌患者的预后及生存期具有重要的影响，然而目前的临床现实是，由于受到诊断手段的限制，大多数患者在晚期才被诊断出来，从而丧失了最佳的治疗窗口。临床中肺癌的初步诊断和分期主要通过CT扫描对肺结节进行判断，而进一步的细胞和分子表型诊断则必须通过细针抽吸或胸腔镜等侵入性方法予以实施，因此，利用微创方法辅助早期诊断在临床上有着极为广阔的应用前景。DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在众多基因中，CpGs的高甲基化，特别是在SHOX2，TAC1和HOXA9中，已被认为是肺癌的生物标志物，因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断肺癌的状态。目前在早期检测和筛查肺癌方面存在的主要挑战在于取得检测样本组织所需实施的侵入性活检方法。毫无疑问，液体活组织检查是该问题理想的解决方案，其中用于分析的生物样品可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样品获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；4.便于早期发现癌症；5.能用于监测肿瘤动态治疗前、治疗间和治疗后；6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。人类生物样本包含，源自所有组织包括癌组织的细胞、蛋白质、外来体和游离DNAcfDNA、游离RNAcfRNA。其中，游离DNA的浓度非常低，在血浆中约为1-10ngmL。肿瘤突变DNA可以在来自癌症患者的生物样本的cfDNA中检测到，被称为循环肿瘤DNAcirculatingtumorDNA,ctDNA，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，其浓度小于cfDNA。由于ctDNA来自肿瘤细胞基因组突变，且其半衰期较短，当用于肿瘤示踪和筛查时，与蛋白类肿瘤标记物相比，ctDNA肿瘤标记物检测的假阳性率更低，准确率更高，因此ctDNA作为一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤生物标记物，适用于多种肿瘤的示踪和筛查。然而，目前临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和治疗选择的主要挑战，在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pgmL水平的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。不仅如此，目前临床可用的检测试剂盒还普遍受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的定量PCR方法设计不合理等诸多限制。Epigenomics公司生产的EpiproLung试剂盒，其检测针对肺癌的SHOX2和PTGER4的甲基化状态。然而，早期检测肺癌标记物的最佳方案来自HulbertA等人2017年的报道HulbertAet.al.EarlyDetectionofLungCancerUsingDNAPromoterHypermethylationinPlasmaandSputum.ClinCancerRes.2017,238:1998-2005.doi:10.11581078-0432，该小组指出，SOX17、TAC1和CDO1的组合在预测早期患者的癌症方面表现最佳IA-IIA期，针对这三个基因的甲基化检测使得他们可以对肺癌早期检测达到93％和62％的特异性和敏感性。在上述资料的基础上，我们通过更加广泛和深入的研究，发现了可用于早期肺癌筛查的更好的甲基化基因靶点，并设计出数套可针对这些靶点进行甲基化检测的引物及探针组合，我们的方案可取得更高的检测特异性和敏感度，利用新发现的基因靶标检测组合制成了早期肺癌的检测和筛查试剂盒。发明内容为了进一步提高肺癌早期检测和筛查方法的特异性和敏感性，我们在反复实验的基础上，研制开发出了一种新的用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，试验证实，利用本发明检测试剂盒能够显著提高早期肺癌的阳性检出率和特异性真实阴性率。首先，本发明公开了一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌。本发明试剂盒中包含下述组成部分：1用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:1-2和探针SEQIDNO:7、特异性引物SEQIDNO:3-4和探针SEQIDNO:8、特异性引物SEQIDNO:5-6和探针SEQIDNO:9；2用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:10-11和探针SEQIDNO:16、特异性引物SEQIDNO:12-13和探针SEQIDNO:17、特异性引物SEQIDNO:14-15和探针SEQIDNO:18；3用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:19-20和探针SEQIDNO:25、特异性引物SEQIDNO:21-22和探针SEQIDNO:26、特异性引物SEQIDNO:23-24和探针SEQIDNO:27；4用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:28-29和探针SEQIDNO:30。进一步地，上述特异性引物SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、19、20、21、22、23、24、28、29均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。进一步地，上述基于TaqManTM设计的探针SEQIDNO:7、8、9、16、17、18、25、26、27、30在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。进一步地，上述特异性引物SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、19、20、21、22、23、24、28、29和基于TaqManTM设计的探针SEQIDNO:7、8、9、16、17、18、25、26、27、30的长度为10-50nt。具体的特异性引物和探针序列及硫代磷酸酯修饰位置如下表1所示：表1本发明试剂盒中包含的特异性引物和探针注：“*”表示DNA中的硫代磷酸酯修饰。进一步地，本发明试剂盒中还包含下述组成部分：5PCR反应缓冲液；6DNA聚合酶。进一步地，本发明试剂盒中还包含下述组成部分：7血浆游离DNA提取试剂；8血浆游离DNA甲基化转化试剂。优选地，上述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。本发明试剂盒的DNA甲基化检测系通过分析一个或多个特定基因检测区域的甲基化状态来对肺癌进行特异性检测与筛查。我们通过优化反应体系，使多个区域靶点的甲基化检测在一个反应中同时完成。其中对SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点的分析将用于肺癌检测，而对ACTB基因区域靶点的分析则用作内部对照以对DNA提取和亚硫酸氢盐转化是否成功进行检验。进一步地，所述DNA可以为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。进一步地，本发明试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置如下：1SHOX2基因：检测靶点序列如SEQIDNO:31所示，检测靶点位置为Chr3:158,096,011-158,106,163；2HOXA9基因：检测靶点序列如SEQIDNO:32所示，检测靶点位置为Chr7:27,162,435-27,165,530；3TAC1基因：检测靶点序列如SEQIDNO:33所示，检测靶点位置为Chr7:97,731,959-97,740,472；4ACTB基因：检测靶点序列如SEQIDNO:34所示，检测靶点位置为Chr7:5,532,001-5,532,300。本发明试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置如下表2所示：表2本发明试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置上述用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从受试者血浆样本中提取游离DNA；2血浆游离DNA甲基化转化：利用血浆游离DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化；3PCR扩增：对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA进行PCR扩增，利用Taqman分析法，每个模板的PCR扩增做三个重复；每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液；SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点的引物各400nM，SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点探针各250nM；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点探针100nM；50nMROX染料；PCR程序为：一个循环95℃10min；然后45个循环95℃15s；最后65℃20s；PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；4结果判定：首先，每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；其次，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SHOX2、HOXA9和TAC1中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性。优选地，上述使用方法第3步骤可选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。经实验测试，本发明试剂盒可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。附图说明图1：甲基化实时定量PCR测定qPCR的工作流程图；本发明的工作流程从一个或多个步骤的改进开始，具体包括：DNA亚硫酸氢盐处理、甲基化特异性qPCR和扩增产物的检测。图2：肺癌甲基化qPCR扩增曲线图原图为彩色，可以清楚地区分不同靶点的扩增曲线；其中：A：阴性对照样本中仅扩增出ACTB基因区域靶点选用引物探针组合1：引物1-2和探针7、引物10-11和探针16、以及引物19-20和探针25；B：阳性对照样本扩增曲线显示除了ACTB基因外，SHOX2、HOXA9及TAC1基因区域靶点均有扩增产物选用引物探针组合1：引物1-2和探针7、引物10-11和探针16、以及引物19-20和探针25；C：阴性对照样本中仅扩增出ACTB基因区域靶点选用引物探针组合2：引物3-4和探针8、引物12-13和探针17、以及引物21-22和探针26；D：阳性对照样本扩增曲线显示除了ACTB基因外，SHOX2、HOXA9及TAC1基因区域靶点均有扩增产物选用引物探针组合2：引物3-4和探针8、引物12-13和探针17、以及引物21-22和探针26；E：阴性对照样本中仅扩增出ACTB基因区域靶点选用引物探针组合3：引物5-6和探针9、引物14-15和探针18、以及引物23-24及探针27；F：阳性对照样本扩增曲线显示除了ACTB基因外，SHOX2、HOXA9及TAC1基因区域靶点均有扩增产物选用引物探针组合3：引物5-6和探针9、引物14-15和探针18、以及引物23-24及探针27；G：健康人血液样本仅在ACTB基因区域靶点有扩增产物选用引物探针组合1：引物1-2和探针7、引物10-11和探针16、以及引物19-20和探针25；H：肺癌病人血液样本在ACTB、SHOX2、HOXA9及TAC1基因区域靶点均有扩增产物选用引物探针组合1：引物1-2和探针7、引物10-11和探针16、以及引物19-20和探针25。具体实施方式以下通过特定的具体实例详细描述本发明的实施方式，但是以下具体实施方式本质上仅是示例，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。为使本领域技术人员了解本发明的特点及效果，以下就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。定义术语“患者”、“个体”或“受试者”可以在本文中互换使用，可以指哺乳动物，特别是人类。所述受试者可能有轻度、中度或重度疾病。所述患者可能是未治、易治或难治。所述患者可能是基于特定症状或家族病史需要治疗或需要诊断的个体。术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等包括从患者、个体或受试者获得的各种样本类型，并且可用于诊断或监测检测。所述患者样本可以从健康受试者、患病患者或患有肺癌相关症状的患者获得。而且，从患者获得的样本可以被分割，并且只有一部分可以用于诊断。此外，所述样本或其一部分可以在保持样本用于以后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和其他生物来源的液体样本包括但不限于外周血、血清、血浆、尿、唾液、痰、粪便和滑液，固体组织样本如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在获取后以任何方式操作的样本，如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、试剂处理、洗涤或富集某些细胞群。这些术语还包括临床样本、培养细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。所述样本还可以包含新鲜冷冻和或福尔马林固定的石蜡包埋组织块，例如由临床或病理活组织检查制备的块，其被制备用于病理分析或通过免疫组织化学研究。术语“测量”、“确定”、“检测”或“检查”在全文中可互换使用，并且可以指包括获得患者样本和或检测患者样本中的生物标志物甲基化状态或水平的方法。在一个实施方式中，这些术语是指获得患者样本并检测样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。在另一个实施方式中，术语“测量”、“确定”或“检测”是指检测患者样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法完成，包括但不限于甲基化特异性定量聚合酶链式反应qPCR。术语“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位置、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的，因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指其原始模板是未甲基化或甲基化的扩增DNA。术语“CpG岛”是指具有高密度CpG的基因组DNA的连续区域。术语“甲基化状态”或“甲基化水平”是指特定核苷酸或部分DNA中的核苷酸处的甲基化的存在、不存在和或量。术语“超甲基化”是指对应于在测试DNA样本的DNA序列中的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt相对于在正常对照DNA样本中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的存在增加的甲基化状态。如本文所用，“超甲基化”或“甲基化水平升高”是指与对照样本相比，该DNA区域存在统计学显着例如，本公开的生物标志物的甲基化程度增加。或者，“高甲基化”或“甲基化水平升高”可能指随着时间的推移患者体内水平增加。术语“低甲基化水平”是指对应于在测试DNA样本的DNA序列中的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt相对于在正常对照DNA样本中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的存在减少的甲基化状态。应该理解的是，无论在何处使用语言“包括”描述实施例，还提供了以“由…组成”和或“基本上由…组成”描述的其他类似实施例。实施例1：利用本发明试剂盒对健康人cfDNA样本进行肺癌甲基化多重qPCR检测一实验材料1.健康人血浆购自BloodworksNW公司；2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒购自Qiagen公司，货号55114；3.EZDNAMethylation-Lightning试剂盒购自ZymoResearch公司，货号D5031；4.本发明试剂盒其中包含检测靶点SHOX2、HOXA9及TAC1的其中一套引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针；5.AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶及缓冲试剂购自ThermoFisher公司，货号4311806。二实验方法1.血浆游离DNA提取使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从60份健康人血浆样本中提取游离DNA，步骤按照试剂盒说明书进行。2.游离DNA甲基化转化使用ZymoResearch公司的EZDNAMethylation-Lightning试剂盒对提取的60份血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。3.qPCR扩增对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA使用ThermoFisher公司QuantStudio3instrument进行qPCR扩增，选择Taqman分析法，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR缓冲液，400nM靶点引物每个靶点只选择一对引物，终浓度400nM，250nM靶点探针每个靶点选择一条探针，终浓度为250nM，200nMACTB引物，100nMACTB探针以及50nMROX染料。PCR程序为：一个循环95℃10min；然后45个循环95℃15s；最后65℃20s。PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间本实验中，设定ΔRn为0.1，Ct值小于40的扩增被认定为阳性。三实验结果对于结果的判定标准是，首先每个检测位靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，其次，对于样本是否阳性的判定标准为，内部参照位点ACTB检测结果阳性，且三个靶点SHOX2、HOXA9和TAC1中至少1个靶点检测阳性则判定该样本为阳性。下表3显示的是使用本发明的多重测定SHOX2、HOXA9和TAC1对从60个健康个体获得的60个血浆样品进行检测的结果。由表3可见，本方案检测特异性非常高。表3利用本发明试剂盒对健康人血液样本的检测结果样本阳性判定方法检测样本数阴性样本数阴性率％至少1个靶点阳性605795实施例2：利用本发明试剂盒对肺癌病人cfDNA样本进行肺癌甲基化多重qPCR检测一实验材料1.肺癌病人血浆购自BloodworksNW公司；2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒购自Qiagen公司，货号55114；3.EZDNAMethylation-Lightning试剂盒购自ZymoResearch公司，货号D5031；4.本发明试剂盒其中包含检测靶点SHOX2、HOXA9及TAC1的其中一套引物及探针组合、ACTB扩增引物及探针；5.AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶及缓冲试剂购自ThermoFisher公司，货号4311806。二实验方法1.血浆游离DNA提取使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从41份肺癌病人血浆样本中提取游离DNA，步骤按照试剂盒说明书进行。2.游离DNA甲基化转化使用ZymoResearch公司的EZDNAMethylation-Lightning试剂盒对提取的41份血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。3.qPCR扩增对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA使用ThermoFisher公司QuantStudio3instrument进行qPCR扩增，选择Taqman分析法，每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL，其中含1xPCR缓冲液，400nM靶点引物每个靶点只选择一对引物，终浓度为400nM，250nM靶点探针每个靶点选择一条探针，终浓度为250nM，200nMACTB引物，100nMACTB探针以及50nMROX染料。PCR程序为：一个循环95℃10min；然后45个循环95℃15s；最后65℃20s。PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间本实验中，设定ΔRn为0.1，Ct值小于40的扩增被认定为阳性。三实验结果对于结果的判定标准是，首先每个检测位靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性，其次，对于样本是否阳性的判定标准为，内部参照位点ACTB检测结果阳性，且三个靶点SHOX2、HOXA9和TAC1中至少1个靶点检测阳性则判定该样本为阳性。下表4显示的是使用本发明的多重测定SHOX2、HOXA9和TAC1对从41个肺癌病人获得的41个血浆样品进行检测的结果。由表4可见，本方案阳性检出率非常高。表4利用本发明试剂盒对肺癌病人血液样本的检测结果样本阳性判定方法检测样本数阳性样本数阳性率％至少1个靶点阳性413790.2综合实施例1和实施例2，可以看出，利用本发明试剂盒进行肺癌筛查，其阳性检出率约为90.2％，特异性真实阴性率约为95％。以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。序列表深圳市新合生物医疗科技有限公司用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法201934SIPOSequenceListing1.0118DNA人工序列1tcgtggaaacgtagattc18221DNA人工序列2cgaaaatcgcgaatattccgc21320DNA人工序列3cgggttagaaggtaggaggc20421DNA人工序列4aaaaacgattactttcgcccg21521DNA人工序列5tcgggttagaaggtaggaggc21622DNA人工序列6atcgaatctacgtttccacgaa22719DNA人工序列7gtttaatttatagagatta19818DNA人工序列8cggtggcgggcgaaagta18920DNA人工序列9gattactttcgcccgccacc201019DNA人工序列10gtgggttttagttaggagc191117DNA人工序列11caaacgcccgtaacgac171220DNA人工序列12aagttgtacgggttgaagtc201318DNA人工序列13gttaaccgctatacgccg181416DNA人工序列14ttagtttattcgcggc161521DNA人工序列15aacaactactacgtaaactcg211618DNA人工序列16gttcggcgtcgtcgtcgt181720DNA人工序列17aaaaccctaaaccaacctcc201819DNA人工序列18cggcgtttagtaggaacga191921DNA人工序列19gaaatttttaattacgtaagc212023DNA人工序列20ctccttaaacctccaaacccacg232120DNA人工序列21tgttacgtgggtttggaggt202220DNA人工序列22cgctctttcgcctactcaat202321DNA人工序列23ggaagtaggtcgtttcggatt212421DNA人工序列24tcgtcgatacccataacatct212520DNA人工序列25gcgtggggagaatgttacgt202622DNA人工序列26aggaggttgggataaatatcgt222720DNA人工序列27aaatcgaaatctcgccatcc202822DNA人工序列28tgtaatttttaagggaggagta222920DNA人工序列29aaacacctcaaacctacgaa203020DNA人工序列30agtgaatatttattacgcgt2031295DNA人31ccctgggctcgggccaaaccctgcataaggtcccctggacagccaggtaatctccgtccc60gcctgcccgaccggggtcgcacgagcacaggcgcccacgccatgttggctgcccaaaggg120ctcgccgcccaagccgggccagaaggcaggaggcggaaaaccagcctccggtggcgggcg180aaagcaaccgctctttctgttctctcttcgccctccctcgtggaaacgcagactcgaccc240taaacgcttaacccacagagatcaacaggttcaagcggaatattcgcgatcctcg29532308DNA人32ccgtccggcgccgccgccgccacgggcgcctgggggtgcacgtaggggtggtggtgatgg60tggtggtacaccgcagcgggtacagcgttggcgcccgccgcgtgcactgggttccacgag120gcgccaaacaccgtcgccttggactggaagctgcacgggctgaagtcggggtgctcggcc180agcgtcgccgcctgccggggaggctggcccagggtccccggcgcatagcggccaacgctc240agctcatccgcggcgtcggcgcccagcaggaacgagtccacgtagtagttgcccagggcc300ccagtggt30833231DNA人33cgtcagatctgcagacggaagcaggccgctccggattggatggcgagacctcgattttcc60taaaattgcgtcatttagaacccaattgggtccagatgttatgggcatcgacgagttacc120gtctcggaaactctcaatcacgcaagcgaaaggagaggaggcggctaattaaatattgag180cagaaagtcgcgtggggagaatgtcacgtgggtctggaggctcaaggaggc23134300DNA人34agggacaggacagtcccatccccaggaggcagggagtatacaggctggggaagtttgccc60ttgcgtggggtggtgatggaggaggctcagcaagtcttctggactgtgaacctgtgtctg120ccactgtgtgctgggtggtggtcatctttcccaccaggctgtggcctctgcaaccttcaa180gggaggagcaggtcccattggctgagcacagccttgtaccgtgaactggaacaagcagcc240tccttcctggccacaggttccatgtccttatatggactcatctttgcctattgcgacaca300

权利要求：1.一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平来筛查和诊断肺癌，所述试剂盒中包含下述组成部分：1用于检测SHOX2基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:1-2和探针SEQIDNO:7、特异性引物SEQIDNO:3-4和探针SEQIDNO:8、特异性引物SEQIDNO:5-6和探针SEQIDNO:9；2用于检测HOXA9基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:10-11和探针SEQIDNO:16、特异性引物SEQIDNO:12-13和探针SEQIDNO:17、特异性引物SEQIDNO:14-15和探针SEQIDNO:18；3用于检测TAC1基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQIDNO:19-20和探针SEQIDNO:25、特异性引物SEQIDNO:21-22和探针SEQIDNO:26、特异性引物SEQIDNO:23-24和探针SEQIDNO:27；4用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物SEQIDNO:28-29和探针SEQIDNO:30。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、19、20、21、22、23、24、28、29均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针SEQIDNO:7、8、9、16、17、18、25、26、27、30是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、19、20、21、22、23、24、28、29和所述探针SEQIDNO:7、8、9、16、17、18、25、26、27、30的长度为10-50nt。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：5PCR反应缓冲液；6DNA聚合酶。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含下述组成部分：7血浆游离DNA提取试剂；8血浆游离DNA甲基化转化试剂。7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述血浆游离DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。8.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所检测的特定基因的检测靶点序列和检测靶点位置如下：1SHOX2基因：检测靶点序列如SEQIDNO:31所示，检测靶点位置为Chr3:158,096,011-158,106,163；2HOXA9基因：检测靶点序列如SEQIDNO:32所示，检测靶点位置为Chr7:27,162,435-27,165,530；3TAC1基因：检测靶点序列如SEQIDNO:33所示，检测靶点位置为Chr7:97,731,959-97,740,472；4ACTB基因：检测靶点序列如SEQIDNO:34所示，检测靶点位置为Chr7:5,532,001-5,532,300。10.如权利要求1所述的用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1血浆游离DNA提取：利用血浆游离DNA提取试剂从受试者血浆样本中提取游离DNA；2血浆游离DNA甲基化转化：利用血浆游离DNA甲基化转化试剂对提取的血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化；3PCR扩增：对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA进行PCR扩增，利用Taqman分析法，每个模板的PCR扩增做三个重复；每个反应体系10μL，其中含1xPCR反应缓冲液；SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点的引物各400nM，SHOX2、HOXA9和TAC1基因区域靶点探针各250nM；ACTB基因区域靶点的引物200nM，ACTB基因区域靶点探针100nM；50nMROX染料；PCR程序为：一个循环95℃10min；然后45个循环95℃15s；最后65℃20s；PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；4结果判定：首先，每个靶点的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；其次，当内部参照位点ACTB检测结果阳性，且SHOX2、HOXA9和TAC1中至少1个靶点检测结果阳性则判定该样本为阳性。11.如权利要求10所述的使用方法，其中第3步骤选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR。

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