申请/专利权人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

申请日：2018-12-31

公开（公告）日：2022-11-25

公开（公告）号：CN110041426B

主分类号：C07K16/12

分类号：C07K16/12;C07K16/06;G01N33/569

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.25#授权;2019.08.16#实质审查的生效;2019.07.23#公开

摘要：本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清及其制备方法和应用。本发明对每只鸭进行4次免疫接种，首先采用鸭疫里默氏杆菌重组蛋白进行3次免疫，最后采用鸭疫里默氏杆菌菌液活菌进行最后一免，使鸭在免疫鸭疫里默氏杆菌重组蛋白产生抗体保护后，再在活菌的刺激下而产生很高的鸭疫里默氏杆菌抗体，本发明制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清的效价达到1︰12800以上；采用本发明所述制备方法制备鸭疫里默氏杆菌阳性血清，为鸭疫里默氏杆菌病准确诊断、免疫监测以及对其疫苗免疫效果进行准确评价提供了很好的技术支撑，具有很好的应用前景。

主权项：1.一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）动物免疫：分别对每只鸭进行4次免疫接种，第一次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏完全佐剂乳化的免疫原0.5ml接种于每只鸭；中间2次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原1.0ml接种于每只鸭，首免与二免间隔14天，二免与三免间隔7天；最后一次免疫接种：免疫3次后7天，腿部静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体效价，效价达到1:3200以上时，采用肌肉注射的方式对每只鸭注射不加佐剂的鸭疫里默氏杆菌菌液0.5ml；所述免疫原为鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA；所述鸭疫里默氏杆菌菌液是鸭疫里默氏杆菌RAHB-1菌液、或鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌液、或鸭疫里默氏杆菌RAHB-1菌液︰鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌液=1︰1体积比的混合菌液；其中的活菌含量为12~20亿cfuml；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018805；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018806；（2）血清收获：最后一次免疫接种后10天，全部进行颈动脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，进行物理性状、无菌检验和特异性检验，检验合格后，进行分装，-70℃保存，即得到鸭疫里默氏杆菌阳性血清。

全文数据：一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清及其制备方法和应用技术领域本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清及其制备方法和应用。背景技术鸭疫里默氏杆菌Riemerellaanatipestifer,RA病是重要的水禽细菌病，是由鸭疫里默氏杆菌引起家鸭、火鸡、鹅和其它多种禽类的一种接触性传染病，又名鸭传染性浆膜炎，其主要的剖检病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。该病感染宿主范围广，发病率和死亡率很高，易产生耐药性，且血清型众多，不同血清型之间缺乏免疫保护，给该病的防治工作带来很大困难，已对养鸭业造成了巨大的经济损失。鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白AOutermembranceproteinA，OmpA是革兰氏阴性菌外膜蛋白的表面抗原，是RA全基因序列中相对保守的基因序列，为各血清型菌株共有的抗原，且具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分。发明内容本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清及其制备方法和应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清的制备方法，包括如下步骤：1动物免疫：分别对每只鸭进行4次免疫接种，第一次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏完全佐剂乳化的免疫原0.5ml接种于每只鸭；中间2次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原1.0ml接种于每只鸭，首免与二免间隔14天，二免与三免间隔7天；最后一次免疫接种：免疫3次后7天，腿部静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体效价，效价达到1:3200以上时，采用肌肉注射的方式对每只鸭注射不加佐剂的鸭疫里默氏杆菌菌液0.5ml；2血清收获：最后一次免疫接种后10天，全部进行颈动脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，进行物理性状、无菌检验和特异性检验，检验合格后，进行分装，-70℃保存，即得到鸭疫里默氏杆菌阳性血清。上述方案中，所述颈背部皮下注射的方式为分多点注射。上述方案中，所述免疫原为鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA。上述方案中，所述弗氏完全佐剂乳化的免疫原是由蛋白浓度为1.5mgmL的鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA与弗氏完全佐剂按体积比1︰1等量混合、充分乳化制备得到。上述方案中，所述弗氏不完全佐剂乳化的免疫原是由蛋白浓度为1.5mgmL的鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA与弗氏不完全佐剂按体积比1︰1等量混合、充分乳化制备得到。上述方案中，所述鸭疫里默氏杆菌菌液是由鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和或鸭疫里默氏杆菌RAHB-2培养获得，其中的活菌含量为12～20亿cfuml；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1的分类学命名为RiemerellaanatipestiferRAHB-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018805，保藏日期为2018年11月20日；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-2的分类学命名为RiemerellaanatipestiferRAHB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018806，保藏日期为2018年11月20日。上述方案中，所述鸭疫里默氏杆菌菌液的培养方法为：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1划线接种于含5％新生牛血清的TSA平板，置于烛缸中恒温培养箱37℃培养24～48小时；然后再挑取单菌落接种于含5％新生牛血清的TSB培养基，37℃恒温摇床震荡培养18～20小时。上述方案中，所述检验合格的标准为：1物理性状检验结果：淡黄色澄明液体；2无菌检验结果：无菌生长；3效价检验结果：抗体效价在1︰12800以上；4特异性检验结果：阳性。上述制备方法制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清。上述鸭疫里默氏杆菌阳性血清在鸭疫里默氏杆菌病准确诊断、免疫监测以及疫苗免疫效果评价生物制品领域的应用。本发明的有益效果如下：本发明采用先免疫鸭疫里默氏杆菌重组蛋白再免疫鸭疫里默氏杆菌菌液活菌的免疫方法和免疫途径，使鸭在免疫鸭疫里默氏杆菌重组蛋白产生抗体保护后，再在活菌的刺激下而产生很高的鸭疫里默氏杆菌抗体，制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清的效价达到1︰12800以上；采用本发明所述制备方法制备鸭疫里默氏杆菌阳性血清，为鸭疫里默氏杆菌病准确诊断、免疫监测以及对其疫苗免疫效果进行准确评价提供了很好的技术支撑，具有很好的应用前景。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1一免疫原的制备将实验室保存的鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA作为免疫原，蛋白浓度为1.5mgmL，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照体积比1︰1等量混合后，将混合物装入注射器内，通过三通阀相连的两个注射器之间来回推拉，反复混合，直到混合物滴在水面呈球形而不分散即为乳化完全，得到弗氏完全佐剂乳化的免疫原和弗氏不完全佐剂乳化的免疫原。鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和或鸭疫里默氏杆菌RAHB-2。二菌液的制备将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1保藏编号为CCTCCNO：M2018805，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2保藏编号为CCTCCNO：M2018806，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学分别划线接种于含5％新生牛血清的TSA平板，置于烛缸中恒温培养箱37℃培养24～48小时；再分别挑取鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2单菌落接种于含5％新生牛血清的TSB培养基，37℃恒温摇床震荡培养18～20小时后，分别得到鸭疫里默氏杆菌RAHB-1菌液和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌液，取样计数，确保每个菌液中活菌含量均为6～10亿cfu0.5ml，取鸭疫里默氏杆菌RAHB-1菌液、或鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌液、或鸭疫里默氏杆菌RAHB-1菌液︰鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌液＝1︰1体积比混合菌液；用于后续的免疫接种，备用。三鸭疫里默氏杆菌阳性血清的制备选择15日龄鸭10只，免疫前血清学检测应为阴性，临床健康状况良好，分别对每只鸭进行4次免疫接种，第一次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏完全佐剂乳化的免疫原0.5ml接种于每只鸭；中间2次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原1.0ml接种于每只鸭，颈背部皮下注射的方式为多点注射，首免与二免间隔14天，其余每次间隔7天。免疫3次后，腿部静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体效价，效价达到1:3200时，用不加佐剂的鸭疫里默氏杆菌菌液0.5ml含活菌6～10亿cfu注射，10天后，全部进行颈动脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，进行物理性状、无菌检验和特异性检验，检验合格后，分装-70℃保存。将制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行物理性状、无菌检验和效价检验：1、物理性状检验：制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清应为无色或淡黄色澄明液体。2、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清无菌生长。3、效价检验：取制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清血清3份，编号分别为RA-01、RA-02、RA-03作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400稀释，用鸭疫里默氏菌ELISA抗体检测试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，表1结果表明所述鸭疫里默氏杆菌阳性血清RA-01、RA-02分别稀释到1︰25600倍时仍能检测到特异性抗体，鸭疫里默氏杆菌阳性血清RA-03稀释到1︰51200倍时仍能检测到特异性抗体，即所制备鸭疫里默氏杆菌阳性血清RA-01、RA-02的抗体效价为1︰25600，鸭疫里默氏杆菌阳性血清RA-03的抗体效价为1:51200，血清效价高。表1血清ELISA效价检验结果注明：3份血清编号RA-01、RA-02、RA-034、ELISA验证制备所得血清的特异性：在相同条件下，用鸭疫里默氏菌ELISA抗体检测试剂盒检测鸭大肠杆菌O78、鸭链球菌、鸭肝炎病毒以及新城疫病毒等阳性血清以及本发明制备的阳性血清，检测结果见表2，表2结果表明与鸭大肠杆菌O78、鸭多杀性巴氏杆菌、鸭肝炎病毒以及新城疫病毒等阳性血清均呈阴性反应，但与本发明制备的阳性血清呈阳性反应，表明制备的阳性血清特异性良好。表2ELISA方法验证制备血清的特异性5、分装与保存：制备的阳性血清其中3份经物理性状、无菌检验、效价检验、特异性检验合格后，进行分装，-70℃保存，备用。表3制备的阳性血清检验结果显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

权利要求：1.一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）动物免疫：分别对每只鸭进行4次免疫接种，第一次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏完全佐剂乳化的免疫原0.5ml接种于每只鸭；中间2次免疫接种：采用颈背部皮下注射的方式将用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原1.0ml接种于每只鸭，首免与二免间隔14天，二免与三免间隔7天；最后一次免疫接种：免疫3次后7天，腿部静脉采血，分离血清，检测ELISA抗体效价，效价达到1:3200以上时，采用肌肉注射的方式对每只鸭注射不加佐剂的鸭疫里默氏杆菌菌液0.5ml；（2）血清收获：最后一次免疫接种后10天，全部进行颈动脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，进行物理性状、无菌检验和特异性检验，检验合格后，进行分装，-70℃保存，即得到鸭疫里默氏杆菌阳性血清。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述颈背部皮下注射的方式为分多点注射。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫原为鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述弗氏完全佐剂乳化的免疫原是由蛋白浓度为1.5mgmL的鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA与弗氏完全佐剂按体积比1︰1等量混合、充分乳化制备得到。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述弗氏不完全佐剂乳化的免疫原是由蛋白浓度为1.5mgmL的鸭疫里默氏杆菌重组蛋白OmpA与弗氏不完全佐剂按体积比1︰1等量混合、充分乳化制备得到。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌菌液是由鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和或鸭疫里默氏杆菌RAHB-2培养获得，其中的活菌含量为12~20亿cfuml；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018805；所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018806。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌菌液的培养方法为：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1划线接种于含5%新生牛血清的TSA平板，置于烛缸中恒温培养箱37℃培养24~48小时；然后再挑取单菌落接种于含5%新生牛血清的TSB培养基，37℃恒温摇床震荡培养18~20小时。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述检验合格的标准为：1）物理性状检验结果：淡黄色澄明液体；2）无菌检验结果：无菌生长；3）效价检验结果：抗体效价在1︰12800以上；4）特异性检验结果：阳性。9.权利要求1~8任一所述制备方法制备所得鸭疫里默氏杆菌阳性血清。10.权利要求9所述鸭疫里默氏杆菌阳性血清在鸭疫里默氏杆菌病准确诊断、免疫监测以及疫苗免疫效果评价生物制品领域的应用。

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