申请/专利权人：瑞克斯旺种苗集团公司

申请日：2016-04-26

公开（公告）日：2022-11-25

公开（公告）号：CN108471716B

主分类号：C12N9/12

分类号：C12N9/12;C12N15/54;C12N15/87;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/34

优先权：["20151002 NL 2015547"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.25#授权;2018.09.25#实质审查的生效;2018.08.31#公开

摘要：本发明涉及包含两个紧密连锁的RDR1基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因反向定向，并且当存在于植物中时该遗传决定子导致病毒抗性。在一个实施方案中，组合中的RDR1基因之一由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70％序列同一性，并且组合中的另一RDR1基因由SEQIDNo.3表示或与其具有序列至少70％序列同一性；或者组合中的RDR1基因之一编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质，并且另一RDR1基因编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质或与其具有至少70％序列同一性的蛋白质。

主权项：1.一种包含两个紧密连锁的RDR1基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因通过其3’末端彼此连接而反向定向，其中反向存在的所述两个RDR1基因的组合的拷贝之间的距离不超过6000bp，并且其中a）所述组合中的RDR1基因之一由SEQIDNo.1表示或编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质；和b）所述组合中的RDR1基因之一由SEQIDNo.3表示或编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质，并且所述遗传决定子在黄瓜植物中的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。

全文数据：导致病毒抗性的拷贝数变体[0001]本发明涉及导致植物的病毒抗性的遗传决定子。本发明还涉及产生这种植物的方法和选择这种植物的方法。本发明还涉及包含所述遗传决定子的病毒抗性植物或种子。[0002]病毒构成了感染植物，造成影响作物种植的方面诸如植物生长、植物活力、产品质量和产量潜力的负效应的主要病原体群。像大多数真核生物一样，植物已经建立了对抗侵入病原体诸如病毒的通用防御反应。然而，致病性病毒能够通过使用不同的抑制子机制来逃避这种防御反应。因此，在宿主植物物种中，特定的防御反应已进化来抵抗致病性病毒的抑制子机制。[0003]当植物或作物受到疾病的影响时，在许多情况下，这不仅仅受单一病毒影响，而是受两种或更多种病毒或其它病原体的组合影响，这只会扩大该问题。许多专业种植的作物对可影响它们的几种病原体具有抗性。育种计划的挑战之一是有效地组合与该特定作物最相关，或者例如与该作物的特定栽培季节或区域相关的抗性。[0004]在共同未决的申请PCTEP2015057409中描述了经修饰的RDRl基因，其赋予对病毒，特别是针对某些科的病毒，具体地针对马铃薯Y病毒科Potyviridae、雀麦花叶病毒科Bromoviridae和或帚状病毒科Virgaviridae的病毒的抗性。这种经修饰的RDRl基因在黄瓜Cucumissativus中的存在导致对黄瓜脉黄化病毒CucumberVeinYellowingVirus，CVYV的抗性，并且可可能促成对其它病毒诸如例如黄瓜绿斑驳花叶病毒CucumberGreenMottleMosaicVirus，CGMMV、黄瓜花叶病毒（CucumberMosaicVirus，CMV和小西萌芦黄花叶病毒ZucchiniYellowMosaicVirus，ZYMV的抗性。[0005]然而，导致本发明的黄瓜中的进一步研究表明，对CVYV和CGMMV的抗性往往一起存在，但也存在仅对CVYV有抗性或仅对CGMMV有抗性的重组体。因此单独修饰RDRl基因并不能确保获得针对CVYV和CGMMV两者以及潜在地其它病毒感染的抗性。另外，鉴定经修饰的RDRl基因的存在总是预测抗CVYV的抗性，但并不总是预测针对CGMMV的抗性。对于一些另外的病毒，以及在其中经修饰的RDRl基因促成病毒抗性的一些另外的作物中，预期会出现类似的情况。[0006]然后确定了在黄瓜的基因组中有两个紧密连锁的RDRl基因位于第5号染色体上。这两个RDRl基因不是精确的拷贝，但非常相似，在本文中被命名为CsRDRl_I或14137以及CsRDRl_II或14138。此外，所述两个紧密连锁的RDRl基因是反向定向的，更具体地说，它们通过其3’末端彼此连接。[0007]令人惊讶地发现，当两个紧密连锁的反向定向的RDRl基因的这种组合被重复（导致两个或更多个拷贝的该组合）、并因此具有总共四个或更多个RDRl基因时，这种重复导致植物的病毒抗性增加。该组合的两个或更多个拷贝的存在被称为拷贝数变体，所述拷贝数变体的存在影响病毒抗性。[0008]因此，本发明提供了遗传决定子，其包含两个紧密连锁RDRl基因的组合的至少两个拷贝，所述两个紧密连锁的RDRl基因反向定向，并且当存在于植物中时，该遗传决定子导致病毒抗性。[0009]两个紧密连锁的反向RDRl基因的组合在本文中被定义为“组合”或“RDR1基因座”。如本文中所用，与在组合中存在的两个RDRl基因相关联的“紧密连锁”意味着在这两个RDRl基因之间不发生重组。在一个实施方案中，组合中两个RDRl基因之间的距离不超过3000个核苷酸。基因之间的核苷酸不是所述基因的序列的一部分。在组合中存在的两个RDRl基因之间没有其它基因。术语“拷贝”和“重复”表示相同，并且在本文中可互换使用。如本文中所用，“重复”和“拷贝的”包括倍数增加至两个或更多个拷贝的组合。因此两个或更多个拷贝是两个RDRl基因的组合的不同拷贝数变体。[0010]本发明的遗传决定子可包含两个紧密连锁的、反向定向的RDRl基因的组合的两个拷贝。遗传决定子还可包含三个拷贝的组合，或四个拷贝或四个以上的拷贝。该组合的至少两个拷贝的存在导致植物的病毒抗性。植物可能由于存在本发明的遗传决定子而变得对某种病毒产生抗性，或者已具有抗性的植物的抗性可能增加。将抗性水平与仅具有单一版本的两个紧密连锁的、相反定向的RDRl基因组合的等基因植物相比较。遗传决定子中所述组合的每个额外拷贝的存在都可导致病毒抗性水平的进一步增加。这意味着例如具有四个拷贝的植物比具有三个拷贝的植物更具抗性，所述具有3个拷贝的植物又比具有两个拷贝的植物更具抗性。[0011]在本发明的遗传决定子中重复的RDRl基因座任选地包含与反向定向的RDRl基因之一相邻的一个另外的基因，该另外的基因也作为组合的一部分被重复以形成另一版本的本发明的遗传决定子。[0012]在本发明的遗传决定子中RDRl基因组合的两个或更多个拷贝或复制可以以串联重复的形式存在，这意味着各重复彼此直接相邻地位于染色体上。当各拷贝之间不存在核苷酸或存在最多10个核苷酸时，各重复是直接相邻的。每个重复任选地包含与RDRl基因之一相邻的一个另外的基因。重复也可以以散布的重复存在，这意味着在重复拷贝之间存在大约一千、二千，甚至六千个核苷酸。较大的染色体区段也可以存在于拷贝之间。任选地，重复之一甚至可以位于不同的染色体上。多个拷贝的所述组合这样在植物基因组内的存在足以形成本发明的遗传决定子。[0013]拷贝数变体Copynumbervariants，CNV近来被鉴定是遗传变异的主要潜在来源之一。然而，用于确定基因组中CNV的存在以能够鉴定其效应的方法与鉴定基因内的其它变异诸如存在于基因内的修饰非常不同。就后者而言，通常对序列的分析可以鉴定比较中的序列之间的差异。随后将这些差异用于开发与包含修饰的基因组区域连锁的标记或包含该突变本身的标记。然而，这对于确定CNV的存在是不可行的，因为这些CNV不基于基因的核苷酸序列的差异。拷贝数变体必须通过确定基因组内特定序列，特别是形成基因或基因部分的序列的重复来确定。拷贝数的这些变化可以彼此接近，例如在同一染色体上，但它们也可位于基因组中的不同位置。由CNV引起的大部分遗传变异，特别是它们对特定表型性状的影响和关系尚未被揭示。[0014]在一个优选实施方案中，本发明的遗传决定子包含所述两个紧密连锁的、反向定向的RDRl基因的组合的至少3个拷贝。[0015]在一个实施方案中，组合的RDRl基因中的至少一个的序列由SEQIDNo.1表示，其为CsRDRl_II的序列，或者（按照增加的优先顺序）与SEQIDNo.l具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列。所述相似序列应该作为〇8^1?1_11基因的功能同源基因的基础。或者，组合中的RDRl基因中的至少一个具有编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或者编码具有按照增加的优先顺序与SEQIDNo.2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列的蛋白质的序列。[0016]在一个实施方案中，所述组合的RDRl基因中的至少一个的序列由SEQIDNo.3表示，其是CsRDRl_I的序列，或者按照增加的优先顺序与SEQIDNo.3具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列。所述相似序列应该作为CsRDRl_lS因的功能同源基因的基础。或者，组合中的RDRl基因中的至少一个具有编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质、或者编码按照增加的优先顺序与SEQIDNo.4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列问一性的序列的蛋白质的序列。[0017]在一个具体的实施方案中，所述组合包含由SEQIDNo.1或由（按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列表示的一个RDRl基因，以及由SEQIDNo.3或由（按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列表示的一个RDRl基因。[0018]在一个备选实施方案中，所述组合包含编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或编码按照增加的优先顺序）与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的蛋白质的一个RDRl基因，以及编码如由SEQIDNo.4表示的蛋白质或编码按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的蛋白质的一个RDRl基因。[0019]包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.3的特定组合的遗传决定子当存在于黄瓜植物中时，导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。在一个优选实施方案中，所述遗传决定子包含至少3个拷贝的SEQIDNo.1和SEQIDNo.3的特定组合。[0020]在一个实施方案中，所述组合包含一个由SEQIDNo.1或由（按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列表示的一个RDRl基因，以及编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质或编码按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的蛋白质的一个RDRl基因。[0021]在一个实施方案中，所述组合包含编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或编码按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的蛋白质的一个RDRl基因，以及由SEQIDNo.3或由（按照增加的优先顺序与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列表示的一个RDRl基因。[0022]SEQIDNo.l和3代表黄瓜的CsRDRl_II和CsRDRl_I基因的野生型，相应的蛋白质代表野生型蛋白质。作为其它作物中CsRDRl_I或CsRDRl_II的功能同源物的基因与黄瓜的这些RDRl基因之一具有至少70%至高达90%的序列同一性。[0023]在某些情况下，与当仅存在单一版本的野生型时的表达相比，遗传决定子中所述组合的RDRl基因中的至少一个的表达能够增加。例如，由于在遗传决定子中存在所述组合的至少两个拷贝，任选地三个、四个或更多个拷贝，该组合的RDRl基因中的一个或两者的表达能够增加。[0024]RDRl基因中至少一个的表达由于所述基因的野生型核苷酸序列的修饰而能够可选择地增加。这种修饰包括例如基因起始密码子上游的修饰，特别是启动子或5’-UTR中的修饰。[0025]增加的表达可以是RDRl基因的mRNA水平的升高或RDRl蛋白水平的升高或RDRl蛋白活性增加。[0026]可在稳态情况下测量到植物中存在的基因的增加表达，其中稳态与该基因的功能相关地意味着植物中不存在病毒感染的情况。或者，可在受感染的状态情况下测量到整合至植物中的基因的增加的表达，由此病毒感染存在于植物中。[0027]在一个具体的实施方案中，导致增加的表达和病毒抗性的所述组合中RDRl基因之一的起始密码子上游的修饰是插入缺失（indel。导致表达增加的插入缺失合适地是导致由SEQIDNo.5表示的经修饰的基因序列的插入缺失。在起始密码子ATG的下游，SEQIDNo.5具有与SEQIDNo.1相同的序列。本发明还涉及遗传决定子，其中组合中的CsRDRl基因之一的起始密码子上游的序列按照增加的优先顺序与SEQIDNo.5起始密码子上游的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性。[0028]在一个具体的实施方案中，遗传决定子包含由SEQIDNo.3表示的，或者按照增加的优先顺序）与其具有至少90%、95%、98%、99%序列同一性的一个CsRDRl基因，和由SEQIDNo.5表示的，或者按照增加的优先顺序与其具有至少90%、95%、98%、99%序列同一性的一个CsRDRl基因。[0029]包含SEQIDNo.3和SEQIDNo.5的特定组合的遗传决定子当存在于黄瓜植物中时导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜脉黄化病毒的抗性。在一个优选实施方案中，所述遗传决定子包含至少3个拷贝的SEQIDNo.3和SEQIDNo.5的特定组合。由SEQIDNo.3和SEQIDNo.5表示的CsRDRl基因在所述抗性黄瓜植物中不一定具有这些SEQID’s的完全相问的序列，而是可以显不与其有至少90%、95%、98%、99%的序列问一性。[0030]如本文中所用，百分比“序列同一性”是在正确比对那些序列之后两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知道如何比对序列。为了获得最显著的结果，应该获得提供最高序列同一性得分的最佳可能比对。将序列在评估的最短序列的长度上进行比较。[0031]高百分比的序列同一性通常推定指同源序列。如果相似序列在功能上是同源的，则包含具有所要求的序列同一性百分比的RDRl基因的遗传决定子是本发明的一部分。功能同源意指其是导致与在黄瓜中鉴定的RDRl基因具有相似功能的蛋白质的基因序列。相似序列是与SEQIDNo.1和或SEQIDNo.3和或SEQIDNo.5具有至少70%至高达99%序列同一性的序列。对于本发明，“功能上同源的”意指该基因或蛋白质参与病毒抗性。[0032]如本文中所用，“插入缺失”（indel可表示插入、缺失或两者的组合。优选地，导致表达增加的组合中RDRl基因之一中的插入缺失包含至少一个缺失。[0033]在植物中存在本发明的遗传决定子合适地导致了对马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科和或帚状病毒科的病毒的抗性。通过感染大量栽培作物引起主要问题的属于这些科的病毒种类是例如但不限于黄瓜脉黄化病毒CucumberVeinYellowingVirus，CVYV、黄瓜花叶病毒（CucumberMosaicVirus，CMV、小西萌芦黄花叶病毒（ZucchiniYellowMosaicVirus，ZYMV、番木瓜环斑病毒PapayaRingspotVirus，PRSV、西瓜花叶病毒WatermelonMosaicVirus，WMV、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CucumberGreenMottleMosaicVirus，CGMMV、烟草花叶病毒（TobaccoMosaicVirus，TMV、番前草花叶病毒（TomatoMosaicVirus，ToMV、辣椒轻斑驳病毒PepperMildMottleVirus，PMMoV、辣椒斑驳病毒（PepperMottleVirus，PepMoV、马铃薯Y病毒（PotatoVirusY，PVY、大豆花叶病毒SoybeanMosaicVirus，SMV和玉米矮花叶病毒MaizeDwarfMosaicVirus，MDMV。[0034]在其基因组中具有与SEQIDNo.I和或SEQIDNo.3同源的RDRl基因并因此特别适合于获得本发明的遗传决定子的植物物种属于各种植物科，诸如萌芦科Cucurbitaceae、前科（Solanaceae、十字花科（Brassicaceae、伞形科Apiaceae、ϋ科Fabaceae、苋科Amaranthaceae和菊科Asteraceae。适合获得本发明的遗传决定子的作物物种可以特别选自以下任一种:菜豆Phaseolusvulgaris、甜菜Betavulgaris、甘蓝（Brassicaoleracea、胡萝卜（Daucuscarota、萬苣（Lactucasativa、甜瓜Cucumismelo、黄瓜（Cucumissativus、西萌芦（Cucumispepo、菠菜（Spinacia〇Ieracea、番前（SolanumIycopersicum、辣椒（Capsicumannuum和西瓜Citrulluslanatus〇[0035]本发明涉及用于产生病毒抗性植物的方法，所述方法包括在植物中导入具有至少两个拷贝的两个紧密连锁的RDRl基因的组合的遗传决定子，所述两个紧密连锁的RDRl基因反向定向。当植物具有性相容性时，可通过常用的育种技术，诸如杂交和选择，从包含遗传决定子的另一个植物引入所述遗传决定子。这种引入可来自同一物种的植物，其通常可被容易地杂交，或者来自相关物种的植物。杂交困难可通过本领域已知的技术诸如胚拯救来克服，或者可以应用同源转基因。可以为遗传决定子开发适当的标记以跟踪该遗传决定子至另一个植物中的整合。[0036]上述方法可以特别用于将本发明的遗传决定子引入适于掺入这种遗传决定子的植物物种中。在一个具体的实施方案中，本发明的遗传决定子可使用标准育种方法从包含所述遗传决定子的黄瓜植物引入缺乏所述遗传决定子的黄瓜植物。在黄瓜中，所述遗传决定子可包含两个反向定向的RDRl基因的组合的两个、三个、四个或更多个拷贝。将遗传决定子引入黄瓜导致了对黄瓜绿色斑驳花叶病毒的抗性。当组合中的RDRl基因中的一个由SEQIDNo.5表示时，黄瓜中遗传决定子的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性和对黄瓜脉黄化病毒的抗性。[0037]或者，可以通过增加已经存在于植物基因组中的紧密连锁的反向定向的RDRl基因的拷贝数来引入本发明的遗传决定子，或者可以例如通过使用转基因修饰从另一种性不相容的植物转移它们。可适合用于修饰基因或基因组合的拷贝数或用于从其它植物转移多个拷贝的RDRl基因的技术包括本领域技术人员已知的一般植物转化技术，诸如使用土壤杆菌介导的转化方法。也可使用其它基因组编辑方法，诸如使用CRISPRCas系统。[0038]本发明还提供了包含本发明的遗传决定子的植物，该植物由于遗传决定子的存在而对一种或多种病毒具有抗性。本发明的植物优选对马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科和或帚状病毒科的一种或多种病毒具有抗性。[0039]本发明还涉及包含本发明的遗传决定子的种子，其中从所述种子生长的植物对一种或多种病毒，特别是对马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科和或帚状病毒科的一种或多种病毒具有抗性。[0040]本发明的植物或种子是其中存在两个反向定向的RDRl基因的组合的两个或更多个拷贝（所述存在导致病毒抗性的植物或种子，例如选自菜豆、甜菜、甘蓝、胡萝卜、莴苣、甜瓜、黄瓜、菠菜、番前和西瓜的物种的植物或种子。[0041]包含本发明的遗传决定子的黄瓜植物优选对黄瓜绿斑驳花叶病毒具有抗性，任选地组合有针对黄瓜脉黄化病毒的抗性。[0042]本发明还涉及选择病毒抗性植物的方法，包括确定反向存在的两个RDRl基因的组合的拷贝数，并选择包含所述组合的至少两个拷贝的植物作为病毒抗性植物。包含至少两个拷贝的所述组合的植物包含本发明的遗传决定子。在一个优选实施方案中，选择包含至少三拷贝的所述组合的植物作为病毒抗性植物。[0043]基于基因组测序的各种方法已被开发来鉴定拷贝数变体CNV，并且本领域技术人员已知如何确定植物基因组中拷贝数变体的存在情况。基于下一代测序数据的CNV检测的直接策略是例如（1读数深度分析readdepthanalysis，（2分拆读值分析split-readanalysis，（3不一致作图的读值配对分析（discordantlymappedreadpairanalysis，以及4从头基因组组装。[0044]在本研究中，使用工具来检测在黄瓜中的相关区域中鉴定的两个RDRl基因的组合的局部拷贝数变体。随后还使用qPCR来测定组合中基因的表达水平。将已鉴定的拷贝数变化和表达分析的结果都与植物的病毒抗性相关联实施例1。以这种方式建立了基因型与表型之间的关系。[0045]在一个实施方案中，本发明涉及用于选择病毒抗性植物的方法，其包括测定反向存在的两个RDRl基因的组合的拷贝数，和选择包含至少两个拷贝的所述组合的植物作为病毒抗性植物，其中两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含由SEQIDNo.1表示的或与其具有至少70%序列同一性的至少一个RDRl基因，和或由SEQIDNo.3表示的或与其具有至少70%的序列同一性的至少一个RDRl基因。[0046]在一个实施方案中，本发明涉及用于选择病毒抗性植物的方法，其包括测定反向存在的两个RDRl基因的组合的拷贝数，并选择包含至少两个拷贝的所述组合的植物作为病毒抗性植物，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含由SEQIDNo.3代表或与其具有至少70%序列同一性的至少一个RDRl基因，和或由SEQIDNo.5表示的或与其具有至少70%序列同一性的至少一个RDRl基因。[0047]在一个实施方案中，本发明涉及用于选择对黄瓜绿色斑驳花叶病毒具有抗性的黄瓜植物的方法，其包括测定反向存在的两个RDRl基因的组合的拷贝数，并选择包含至少2个拷贝、优选至少3个拷贝的所述组合的植物作为CGMMV抗性植物，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含由SEQIDNo.1表示的CsRDRl_II或与其具有至少90%序列同一性的基因，和由SEQIDNo.3表示的CsRDRl_I，或与其具有至少90%序列同一性的基因。[0048]在一个实施方案中，本发明涉及用于选择对黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜脉黄化病毒具有抗性的黄瓜植物的方法，其包括测定反向存在的两个RDRl基因的组合的拷贝数，并选择包含至少2个拷贝、优选至少3个拷贝的所述组合的植物作为CGMMV和CVYV抗性植物，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含由SEQIDNo.5表示的经修饰的CsRDRl_II或与其具有至少90%序列同一性的基因，和由SEQIDNo.3表示的CsRDRl_I，或与其具有至少90%序列同一性的基因。[0049]将在下面的实施例中将进一步说明本发明，所述实施例仅用于说明的目的，并不意图以任何方式限制本发明。在所述实施例中，参考以下附图。[0050]附图[0051]图I-SEQIDNo.1、SEQIDNo.3和SEQIDNo.5的基因组序列，包括以起始密码子ATG序列中的粗体开始的编码序列CDS，和在起始密码子上游约2kb包括5’-UTR和启动子）的序列。序列分别是黄瓜CsRDRl_II、CSRDR1_I和在起始密码子上游具有插入缺失的CsRDRl_II〇[0052]图2-分别由CsRDRl_II和CsRDRl_I的CDS生成的SEQIDNo.2和SEQIDNo.4的蛋白质序列，其中由SEQID如.5表示的具有插入缺失的〇81«1?1_11与〇81^1?1_11编码相同的蛋白质，因为CDS是一样的。[0053]图3-来自对CVYV和CG匪V均易感、抗CGMMV并对CVYV易感，或对两种病毒均具有抗性的各种品系的测序数据的读数深度分析。[0054]A:Geno3对参照基因组的WGS读值作图（pacbio;[0055]B:对BFll参考pacbio、CGMMV易感⑸和CVYV易感⑸品系的WGS读值作图；[0056]C:对BFll参考pacbio、CGMMV抗性⑻和CVYV敏感⑸品系的WGS读值作图；[0057]D:对BFll参考pacbio、CGMMV抗性⑻和CVYV抗性⑻品系的WGS读值作图。[0058]图4-RDR1基因的组合的拷贝在基因组中彼此相对的可能位置。对于“Gen〇4”，描绘了具有3个拷贝的遗传决定子，对于“Gen〇2”和“Gen〇3”，描绘了具有2个拷贝的遗传决定子。实施例[0059]实施例1[0060]鉴定黄瓜中与病毒抗性相关的RDRl基因的拷贝数变体[0061]在以前的研究中，在黄瓜基因组的第5号染色体上鉴定了两个紧密连锁的、反向定向的RDRl基因。这些RDRl基因中的至少一个当被修饰时被确定为参与赋予对CVYV的抗性。尽管似乎与对CGMMV的抗性连锁，但可以观察到仅具有CGMMV抗性或仅具有CVYV抗性的重组体。针对经修饰的RDRl基因开发的标记可预测CVYV抗性，但并不总是预测GMMV抗性。[0062]随后对许多易感或具有一种或两种抗性的品系进行全基因组测序WGS。基于目标区域的序列差异开发了250多个另外的标记。同样地，这些数据的分析和新标记的应用也没有得到CGMMV抗性的更好标记。这导致了一种假设，即与第5号染色体区域上的基因中或其周围的修饰不同的某些修饰可能导致了CGMMV抗性，并且决定采取不同的方法。[0063]然后对各种品系的WGS数据进行作图，随后使用WGS读值比对可视化工具进行分析，并将其与内部生成的黄瓜参考基因组序列进行比较。使用该方法，观察到具有两个RDRl基因的序列的读值深度。特别有趣地发现，对于某些材料，与参考基因组相比，具有这两个RDRl基因的特定序列的读值深度是约两倍或甚至3倍图3。[0064]为了证实这一信息，对具有CGMMV和CVYV抗性的各种组合或对两者均敏感的大量61个品系进行重新测序，并使用可用数据进行qPCR。使用’δδ〇ι’方法ddCq分析qPCR数据，并进行效率校正。使用通常已知的合适软件计算针对靶基因CsRDRl_I和CsRDRl_II两者以及针对参考基因的阈值。以下公式用于计算最终的倍数变化，这也表示拷贝数的变化：[0065][0066]这些不同的方法最终导致了相同的结果，并且证实了在黄瓜的基因组中存在这两个紧密连锁的、反向定向的RDRl基因的组合的拷贝数变体。[0067]实施例2[0068]确定不同拷贝的位置[0069]不同拷贝在黄瓜基因组内的位置由组合策略来确定，所述策略包括拆分读值分析、不一致作图读值配对分析和从头基因组组装。基于该分析，已确定黄瓜基因组中RDRl组合的多个拷贝在某些背景中以串联重复的形式存在。这通过拆分读值分析来确定，但也通过使用确认重叠序列存在的MGB测定来验证。其它背景表明拷贝存在于同一染色体上，但在两者之间相距约1000至高达6000bp。这是通过从头基因组组装完成的。第三个结果表明拷贝可能相离更远，两者之间可能相距200kb，但是在不同染色体上的位置也是可行的。为了获得该结果，将拆分读值分析与不一致作图读值配对分析相结合。组合结果在图4中可见。[0070]实施例3[0071]使抗性与拷贝数变体的存在相关联[0072]也就对CVYV和CGMMV的抗性对在实施例1和2中分析的品系进行了表型分析。使用通常已知的接种和观察方法进行生物测定以评估抗性。对于CGMMV，进行了两次重复。CVYV抗性评分基于不同年份的几个生物测定。[0073]随后对于每一个品系，将指示拷贝数和插入缺失的存在或不存在的基因型数据与指示病毒抗性的表型相互比较以能够得出结论。表1列出了某些代表性品系的结果。[0074]‘Genol’是指仅存在一个版本的两个紧密连锁的反向定向的RDRl基因的组合的植物，因此不是多个拷贝。‘Gen〇2’是存在2个拷贝的遗传背景，但它们在基因组中彼此远离，之间可能相距约2001Λ或甚至更远。‘Geno3’是在CsRDRl_II中不具有已知导致CVYV抗性的插入缺失的遗传背景。该背景中的拷贝位于彼此之间相距1000至6000bp的距离。‘Gen〇4’是其中RDRl基因的组合的拷贝是串联重复的遗传背景。此外，该背景中的CsRDRl-ΙΙ具有导致CVYV抗性的插入缺失。[0075]‘R’意指在该测试中所有植物都具有抗性。820的得分意指8株植物具有抗性，即没有症状，2株植物显示轻微症状，0株植物是易感的。[0076]表1[0077]与CVYV和CGMMV抗性相关的拷贝数以及基因表达[0078][0079]基于这些结果得出结论，多个拷贝的RDRl基因组合的存在导致对CGMMV的抗性。在两个RDRl基因之一中存在插入缺失Gen〇4时，当仅存在1个版本Gen〇4j时，其只产生CVYV抗性。只有当两个或更多个拷贝存在时，才会存在对CVYV和CGMMV的抗性。没有拷贝、也没有插入缺失会产生对这两种病毒的易感性®enol^θηο2_1*6θηο3_1显示CGMMV抗性可以独立于CVYV抗性而存在。

权利要求：1.一种包含两个紧密连锁的RDRl基因的组合的至少两个拷贝的遗传决定子，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因反向定向，并且当存在于植物中时，该遗传决定子导致病毒抗性。2.权利要求1所述的遗传决定子，其包含所述两个紧密连锁的反向定向的RDRl基因的组合的三个、四个或更多个拷贝。3.权利要求1或2所述的遗传决定子，其中a所述组合中的RDRl基因中的至少一个由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70%序列同一1性;或b所述组合中的RDRl基因中的至少一个编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或编码与SEQIDNo.2具有至少70%序列同一性的蛋白质。4.权利要求1或2所述的遗传决定子，其中a所述组合中的RDRl基因中的至少一个由SEQIDNo.3表示或与其具有至少70%序列同一1性;或b所述组合中的RDRl基因中的至少一个编码由SEQIDNo.4表示的蛋白质或编码与SEQIDNo.4具有至少70%序列同一性的蛋白质。5.权利要求3或4所述的遗传决定子，其中a所述组合中的RDRl基因之一由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70%序列同一性，并且所述组合中的RDRl基因之一由SEQIDNo.3表示或与其具有序列至少70%序列同一性;或b所述组合中的RDRl基因之一编码由SEQIDNo.2表示的蛋白质或与其具有至少70%序列同一性的蛋白质，并且RDRl基因之一编码SEQIDNo.4表示的蛋白质或与其具有至少70%序列同一性的蛋白质。6.权利要求1-5中任一项所述的遗传决定子，其中所述组合中的RDRl基因中的至少一个在起始密码子的上游具有插入缺失。7.权利要求1-6中任一项所述的遗传决定子，其中反向存在的两个RDRl基因之间的距离不超过3000bp。8.权利要求1-7中任一项所述的遗传决定子，其中两个RDRl基因的组合的拷贝之间的距离不超过6000bp，优选不超过IOOObp，最优选Obp。9.权利要求1-8中任一项所述的遗传决定子，其中所述RDRl基因之一是CsRDRl_II，由SEQIDNo.1表示，或者与其具有至少90%序列同一性，并且所述RDRl基因之一是CsRDRl_I，由SEQIDNo.3表示，或者与其具有至少90%序列同一性，所述遗传决定子在黄瓜植物中的存在导致对黄瓜绿色斑驳花叶病毒的抗性。10.权利要求6-8中任一项所述的遗传决定子，其中所述RDRl基因之一是CsRDRl_I，由SEQIDNo.3表示，或者与其具有至少90%的序列同一性，并且所述RDRl基因之一是经修饰的CsRDRl_II，由SEQIDNo.5表示，或与其具有至少90%的序列同一性，所述遗传决定子在黄瓜植物中的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜脉黄化病毒的抗性。11.一种用于产生病毒抗性植物的方法，其包括将权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子引入植物。12.—种用于选择病毒抗性植物的方法，其包括测定反向存在的两个紧密连锁的RDRl基因的组合的拷贝数，并选择包含至少两个拷贝，优选至少三个拷贝的所述组合的植物作为病毒抗性植物，所述病毒抗性植物包含如权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子。13.权利要求11或12所述的方法，其中所述植物属于选自菜豆Phaseolusvulgaris、甜菜（Betavulgaris、甘蓝（Brassicaoleracea、胡萝卜（Daucuscarota、萬苣（Lactucasativa、甜瓜（Cucumismelo、黄瓜（Cucumissativus、西萌芦（Cucumispepo、菠菜Spinaciaoleracea、番前（SolanumIycopersicum、辣椒（Capsicumannuum和西瓜CitrullusIanatus的物种。14.权利要求I1、12或13所述的方法，其中所述病毒属于马铃薯Y病毒科Potyviridae、雀麦花叶病毒科Bromoviridae和或帚状病毒科Virgaviridae。15.权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含至少一个由SEQIDNo.1表示或与其具有至少70%序列同一性的RDRl基因，和或至少一个由SEQIDNo.3表示或与其具有至少70%序列同一性的RDRl基因。16.权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述两个紧密连锁的RDRl基因的组合包含至少一个由SEQIDNo.3表示或与其具有至少70%序列同一性的RDRl基因，和或至少一个由SEQIDNo.5表示或与其具有至少70%序列同一性的RDRl基因。17.权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述病毒抗性植物是对黄瓜绿斑驳花叶病毒具有抗性、并且任选地对黄瓜脉黄化病毒具有抗性的黄瓜植物。18.权利要求15或17所述的方法，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因的组合包含由SEQIDNo.1表示的CsRDRl_II或与其具有至少90%序列同一性的基因，和由SEQIDNo.3表示的CsRDRl_I，或与其具有至少90%序列同一性的基因，并且其中所选定的病毒抗性植物是包含两个拷贝、优选三个或更多个拷贝的所述组合的黄瓜植物，所述组合的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性。19.权利要求16或17所述的方法，其中所述两个紧密连锁的RDR1基因的组合包含由SEQIDNo.5表示的经修饰的RCRR1_II或与其具有至少90%序列同一性的基因，和由SEQIDNo.3表示的CsRDRl_I或与其具有至少90%序列同一性的基因，并且其中所述选定的病毒抗性植物是包含至少两个拷贝、优选至少三个拷贝的所述组合的黄瓜植物，所述组合的存在导致对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗性和对黄瓜脉黄化病毒的抗性。20.—种植物，其由于在其基因组中存在权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子而对一种或多种病毒具有抗性。21.—种种子，其中从所述种子生长的植物由于在其基因组中存在权利要求1-10中任一项所述的遗传决定子而对一种或多种病毒具有抗性。22.权利要求16所述的植物或权利要求17所述的种子，其中所述病毒属于马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科和或帚状病毒科。23.权利要求16或18所述的植物或权利要求17或18所述的种子，其为选自菜豆Phaseolusvulgaris、甜菜Betavulgaris、甘蓝Brassicaoleracea、胡萝卜（Daucuscarota、萬苣（Lactucasativa、甜瓜（Cucumismelo、黄瓜（Cucumissativus、西萌芦Cucumispepo、菠菜（Spinaciaoleracea、番前（SolanumIycopersicum、辣椒Capsicumannuum和西瓜（CitrullusIanatus的物种的植物或种子。24.权利要求16、18或19所述的植物，其为包含如权利要求9或10所述的遗传决定子的黄瓜植物，其中所述遗传决定子包含至少两个拷贝、优选至少三个拷贝的所述组合，其中所述黄瓜植物对黄瓜绿色斑驳花叶病毒具有抗性，并且任选地对黄瓜脉黄化病毒具有抗性。25.权利要求20所述的黄瓜植物，其包含权利要求10所述的遗传决定子，所述植物由于所述遗传决定子的存在而对黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜脉黄化病毒具有抗性。

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