申请/专利权人：西北工业大学

申请日：2018-12-05

公开（公告）日：2022-11-29

公开（公告）号：CN110093348B

主分类号：C12N15/113

分类号：C12N15/113;C12N15/867

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.29#授权;2019.08.30#实质审查的生效;2019.08.06#公开

摘要：本发明公开了一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：8425:5’‑GCGAGAAATGGGACTCAAACT‑3’。将增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3H1GFPPuro慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将得到的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，实现增强小鼠中NPFFR2基因表达的目的。以上所述shRNA序列显著增强了小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因在mRNA和蛋白水平的表达。

主权项：1.一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，其序列结构是：8425:5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’。

全文数据：增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA技术领域本发明涉及一种shRNA序列，特别涉及一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA。背景技术神经肽FF2受体neuropeptideFFreceptor2，NPFFR2，是一种属于G蛋白偶联受体家族的膜蛋白，定位于5-5E1，由417个氨基酸组成，具有多种生物学功能，包括参与痛觉传导、血压、摄食、内分泌、体温等。由于NPFFR2广泛分布于体内以及广泛参与体内多种生物学过程，因此，NPFFR2的研究具有重要意义。RNA干扰RNAinterference,RNAi发生于大多数真核细胞中，是基因转录后水平调节表达的一种方式。通常认为，RNA干扰作用机制是双链RNAdoublestrandsRNA,dsRNA介导同源mRNA特异性降解并最终引起目的基因表达沉默。目前，该技术已广泛应用于特定基因表达的调控，在致病基因相关的疾病防治中具有重要应用。然后，最近研究发现，RNA干扰，尤其是短发夹RNAshorthairpinRNA，shRNA可增强特定基因表达ProcNatlAcadSciUSA.2004,17；1017:1892-7。shRNA是一段具有紧密发夹环的RNA序列。利用基因工程方法将shRNA克隆至各类病毒载体中，并转染入宿主细胞后转录出shRNA，进而调控特定基因。尽管目前报道了能部分激动NPFFR2功能的药理学激动剂BrJPharmacol.2016；17311:1864-1880.，但是缺乏有效的遗传学手段增强NPFFR2。目前尚未见到使用shRNA方法增强小鼠NPFFR2的报道。发明内容本发明提供一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA。增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：8425:5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’。将增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3H1GFP&Puro慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将得到的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，实现增强小鼠中NPFFR2基因表达的目的。以上所述shRNA序列可显著增强小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因在mRNA和蛋白水平的表达。本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，其序列结构是：8425:5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’。一种上述增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列的应用，其特点是：步骤一、将上述增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3H1GFP&Puro慢病毒载体，获得重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA：合成相应的反义链及正义链序列，NPFFR2-shRNA-8425正义链：5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’NPFFR2-shRNA-8425反义链：5’-AGTTTGAGTCCCATTTCTCGC-3’所述正义链模板的N端添加AATTC，与EcoRI内切酶后形成的粘性末端互补；反义链的C端添加GATCC，与BamHI内切酶后形成的粘性末端互补；将等量的反义链和正义链DNA混合，退火后获得shRNA；将LV3H1GFP&Puro慢病毒载体进行EcoRI和BamHI双酶切，获得线性化的LV3H1GFP&Puro慢病毒载体；将shRNA和线性化的LV3H1GFP&Puro慢病毒载体进行连接，得到重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA。步骤二、将获得的重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA作用于小鼠巨噬细胞或个体，达到增强小鼠NPFFR2基因表达的目的。本发明的有益效果是：增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列为：8425:5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’。将增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3H1GFP&Puro慢病毒载体，获得含有上述shRNA序列的重组慢病毒质粒；将获得的重组慢病毒质粒转染小鼠细胞，达到增强细胞中NPFFR2基因表达的目的。以上shRNA序列可显著增强小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因在mRNA和蛋白水平的表达。本发明针对小鼠NPFFR2基因的shRNA序列能有效增强小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因的表达，其中在NPFFR2基因mRNA水平上的升高了130％，在蛋白质水平上升高了191％。下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。附图说明图1是shRNA的靶向NPFFR2基因的靶序列位点图。图2是本发明增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列重组慢病毒质粒侵染小鼠巨噬细胞的侵染效率照片。Bar:100μm。图3是本发明重组慢病毒质粒对小鼠巨噬细胞RAW264.7中NPFFR2基因表达的增强效果图。V.S.Control,*P0.05,**P0.01。图4是本发明LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2蛋白表达的增强效果图。A：Westernblot检测NPFFR2蛋白表达条带；B：NPFFR2蛋白表达的相对表达量分析。具体实施方式以下实施例参照图1-4。实施例1.shRNA序列的设计与合成。1通过GeneBank数据库https:www.ncbi.nlm.nih.govgenbank获得小鼠NPFFR2基因的mRNA序列，根据shRNA设计原则，设计1条针对小鼠NPFFR2基因的NPFFR2-shRNA和1条对照shRNA序列Negativecontrol，NC参见图1。上述shRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。1条shRNA靶向小鼠NPFFR2基因NM_133192.3的120位点，长为21碱基。其中，本实施例所涉及的NPFFR2-shRNA-8425作用序列为：5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’针对上述1种shRNA及shRNA-NC的作用位点设计合成对应的shRNA反义链与正义链序列：NPFFR2-shRNA-8425正义链：5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’NPFFR2-shRNA-8425反义链：5’-AGTTTGAGTCCCATTTCTCGC-3’上述正义链模板的N端5’端添加AATTC，与EcoRI内切酶后形成的粘性末端互补；反义链的C端3’端添加GATCC，与BamHI内切酶后形成的粘性末端互补；2制作shRNA模板。将反义链50μM,5μL和正义链50μM,5μLDNA混合，依次加入shRNA退火缓冲液双蒸水35μL，加至总反应体系50μL。PCR仪进行退火反应：95℃5min、85℃5min、75℃5min、70℃5min；结束后保存于4℃。获得shRNA10μM,50μL，将其稀释50倍至终浓度200nM。3制作双酶切后的线性化载体。将LV3H1GFP&Puro慢病毒载体上海吉玛制药技术有限公司进行EcoRI和BamHI双酶切以进行线性化，双酶切条件：EcoRI5μL、BamHI5μL、LV3H1GFP&Puro慢病毒载体10μg、酶切缓冲液2×，10μL，加水至100μL，混匀，酶切2小时37℃。将酶切产物进行琼脂糖核酸电泳，利用AgaroseGelDNAPurificationKit回收线性慢病毒载体片段。4连接并构建慢病毒重组质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA。将shRNA模板100nM,1μL、线性化的慢病毒载体50ngμL,1μL、T4DNA连接酶5UμL,1μL、连接缓冲液10×，2μL，双蒸水15μL混匀，共计20μL，4℃连接16小时，获得连接产物。将连接产物10μL转化至大肠杆菌感受态DH5α，将感受态细胞均与涂于LB平板Ampicillin,50μgmL，至于37℃培养箱16小时，从平板上挑斑6个板，置于液体LBAmpicillin,50μgmL中37℃震荡16小时。碱裂解提取质粒后，EcoRI和BamHI双酶切鉴定后送测序，鉴定无误后确定为阳性质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA。无内毒素质粒大提质粒，置于-80℃保存。5包装慢病毒。将重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA、LV3H1GFP&Puro-NC-shRNA分别与辅助质粒pGagPol、pRev、pVSV-G上海吉玛制药技术有限公司混合制备成DNA-Lipofectamine2000混合物，将该复合物依次递加入293T细胞，轻轻混匀，置于5％CO2、37℃、饱和湿度细胞孵箱中培养6小时。更换新鲜的DMEM培液含10％胎牛血清，10mL，置于5％CO2、37℃、饱和湿度细胞孵箱中培养72小时，收集上清并浓缩，获得含有目的shRNA的成熟慢病毒颗粒。实施例2。重组慢病毒感染小鼠巨噬细胞的效率。将LV3H1GFP&Puro-NC-shRNA和1种LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA的慢病毒质粒转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，使用荧光显微镜检测不同shRNA的转染效率。1实验分组：实验分为空白对照组Control-Blank、阴性对照组Control-NC、NPFFR2-shRNA-8425转染组，共3组。各组细胞数量及培养条件一致。2细胞转染实验方法：将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板1×106孔，混匀后于37℃5％CO2培养24小时。取慢病毒原液10μL，用DMEM培养基含10％FBS稀释5倍，并加入凝聚胺Polybrene至终浓度为5μgmL。吸弃6孔板中培液，替换为慢病毒液1mL孔，培养24小时。用新鲜的培液替换慢病毒液2mL孔，在细胞孵箱中继续培养72小时。3采用荧光显微镜明场观察并记录细胞形态，荧光通道观察并拍照。参见图2，各组慢病毒转染效率均达90％以上，含有上述shRNA的慢病毒可高效率转染小鼠巨噬细胞。实施例3。重组慢病毒对小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达的增强作用。采用实时荧光PCR方法检测上述1种shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达的增强作用。1实验分组：实验分为空白对照组Control-Blank、阴性对照组Control-NC、NPFFR2-shRNA-8425转染组，共3组。各组细胞数量及培养条件一致。2RNA提取：Trizol法裂解细胞，并提取细胞总RNA，将其中mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：42℃30min，85℃10min。取cDNA为模板，以ACTB为内参，Real-timePCR检测NPFFR2的基因表达。引物序列为：NPFFR2Forwardprimers:5’-CTGTCTCCTAACAAACTGCGTAT-3’NPFFR2Reverseprimers:5’-ATCTTGGAAACCATTGCGA-3’ACTBForwardprimers:5’-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’ACTBReverseprimers:5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’Real-timePCR反应条件：98℃15s,95℃,1min；55℃,40秒,30循环。参见图3，1种shRNA可显著增强小鼠巨噬细胞中NPFFR2基因表达。实施例4。重组慢病毒对小鼠巨噬细胞中NPFFR2蛋白表达的增强作用。利用重组慢病毒转染细胞72小时后，采用细胞裂解法裂解细胞后，提取蛋白质。BCAbicinchoninincacid法测定蛋白浓度；每组取15μL蛋白样品20μg泳道，加入15μL的电泳缓冲液2×SDS-PAGEloadingbuffer，100℃,5min，12000g离心10min，取上清，以6％SDS-PAGE进行蛋白电泳；电泳结束后，将蛋白转膜至PVDF膜，脱脂奶粉封闭2小时5％；TBST洗膜10min×3次，分别加入NPFFR2一抗、GAPDH一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜10min×3次；加入二抗，室温孵育2小时；TBS洗膜15min×3次；SuperSignalChemiluminescentSubstrates进行化学发光检测，经X光片曝光、显影、定影后，采集图像并分析。参见图4，重组慢病毒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA对小鼠巨噬细胞中NPFFR2的蛋白表达具有显著增强水平，说明本实施例所述shRNA有效增强NPFFR2的蛋白水平的表达。下面具体实施例中重组慢病毒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA为活性成分，在制备增强NPFFR2的shRNA中作进一步说明。实施例5。注射液的制备。工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支含LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA1.32mg。用法用量：一日1次，每次1支。

权利要求：1.一种增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA，其序列结构是：8425:5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’。2.一种权利要求1所述的增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列的应用，其特征在于包括以下步骤：步骤一、将上述增强小鼠NPFFR2基因表达的shRNA序列克隆至LV3H1GFP&Puro慢病毒载体，获得重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA：合成相应的反义链及正义链序列，NPFFR2-shRNA-8425正义链：5’-GCGAGAAATGGGACTCAAACT-3’NPFFR2-shRNA-8425反义链：5’-AGTTTGAGTCCCATTTCTCGC-3’所述正义链模板的N端添加AATTC，与EcoRI内切酶后形成的粘性末端互补；反义链的C端添加GATCC，与BamHI内切酶后形成的粘性末端互补；将等量的反义链和正义链DNA混合，退火后获得shRNA；将LV3H1GFP&Puro慢病毒载体进行EcoRI和BamHI双酶切，获得线性化的LV3H1GFP&Puro慢病毒载体；将shRNA和线性化的LV3H1GFP&Puro慢病毒载体进行连接，得到重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA；步骤二、将获得的重组慢病毒质粒LV3H1GFP&Puro-NPFFR2-shRNA作用于小鼠巨噬细胞或个体，达到增强小鼠NPFFR2基因表达的目的。

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