申请/专利权人：天津科技大学

申请日：2020-10-23

公开（公告）日：2022-11-29

公开（公告）号：CN112481233B

主分类号：C12N9/12

分类号：C12N9/12;C12N15/70;C12P19/30;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.29#授权;2021.03.30#实质审查的生效;2021.03.12#公开

摘要：本发明涉及一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：构建工程菌EscherichiacoliCKI‑CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶；构建工程菌EscherichiacoliPPK‑UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶；构建工程菌EscherichiacoliCMK‑NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶；对发酵得到的产酶细胞进行破碎，离心收集上清液得到粗酶液。本发明首次报道了具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合成，具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异源可溶性表达量和酶活力更高。

主权项：1.一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，其特征在于：制备步骤如下：首先，构建工程菌EscherichiacoliCKI-CCT表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和CTP形成胞二磷胆碱；构建工程菌EscherichiacoliPPK-UDK表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化ATP再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成CMP；构建工程菌EscherichiacoliCMK-NDK表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化CMP形成CDP，二磷酸核苷激酶能够用于催化CDP形成CTP；其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂；具体制备步骤如下： 在大肠杆菌E.coliBL21中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株EscherichiacoliCKI-CCT； 在大肠杆菌E.coliBL21中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株EscherichiacoliPPK-UDK； 在大肠杆菌E.coliBL21中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株EscherichiacoliCMK-NDK； 将上述构建的重组菌株EscherichiacoliCKI-CCT、EscherichiacoliPPK-UDK和EscherichiacoliCMK-NDK分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞； 将步骤中培养获得的产酶细胞EscherichiacoliCKI-CCT、EscherichiacoliPPK-UDK和EscherichiacoliCMK-NDK重悬于平衡缓冲液中并进行细胞破碎，破碎液经13000rmin离心20min后取上清液，即为粗酶液；所述步骤中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株E.coliCKI-CCT；其中，所述胆碱激酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2；所述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因来源于具核梭杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；所述质粒pET-Duet的核苷酸序列为SEQIDNO.13；所述步骤中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达聚磷酸激酶和胞苷激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株E.coliPPK-UDK；其中，所述聚磷酸激酶编码基因来源于类球红细菌，其扩增引物为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6；所述胞苷激酶编码基因来源于嗜热栖热菌，其扩增引物为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8；所述质粒pET-Duet的核苷酸序列为SEQIDNO.13；所述步骤中是以pET-Duet质粒为载体在E.coliBL21中过表达胞苷酸激酶和二磷酸激酶基因，构建出具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株E.coliCMK-NDK；其中，所述胞苷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.9、SEQIDNO.10；所述二磷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌，其扩增引物为SEQIDNO.11、SEQIDNO.12；所述质粒pET-Duet的核苷酸序列为SEQIDNO.13。

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