申请/专利权人：生物技术公司;约翰·古腾堡大学美因兹医学大学转化肿瘤学公司

申请日：2013-03-25

公开（公告）日：2022-12-02

公开（公告）号：CN109331176B

主分类号：A61K39/00

分类号：A61K39/00;A61K9/127;A61K47/28;A61P35/00;A61P35/04;A61P31/00

优先权：["20120326 EP PCT/EP2012/001319"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.12.02#授权;2019.03.12#实质审查的生效;2019.02.15#公开

摘要：本发明涉及用于免疫治疗的RNA制剂，属于免疫治疗领域，具体地，属于肿瘤免疫治疗领域。本发明提供了用于在全身性施用后将RNA递送至脾中的抗原呈递细胞例如树突细胞DC的药物制剂。特别地，本文所述的制剂使得能够在全身性施用编码抗原的RNA后诱导免疫应答。

主权项：1.包含至少一种阳离子脂质、至少一种中性辅助脂质和编码至少一种抗原的RNA的纳米颗粒在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于将所述至少一种抗原递送至对象的脾中的专职性抗原呈递细胞，其中所述药物组合物全身性施用于所述对象，其中所述抗原是疾病相关抗原，或者其引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答，并且其中所述纳米颗粒是脂质体复合物，其包含：i摩尔比为8:2至3:7的DOTMA和DOPE，其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6:2至1:2；或者ii摩尔比为8:2至3:7的DOTMA和胆固醇，其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6:2至1:2；或者iii摩尔比为8:2至3:7的DOTAP和DOPE，并且其中DOTAP中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6:2至1:2。

全文数据：用于免疫治疗的RNA制剂本申请是申请日为2013年03月25日、申请号为201380016262.0、发明名称为“用于免疫治疗的RNA制剂”的中国专利申请的分案申请。技术领域本发明属于免疫治疗领域，具体属于肿瘤免疫治疗领域。本发明涉及提供用于在全身性施用后将RNA高选择性地递送至脾的抗原呈递细胞例如树突细胞DC的药物制剂。特别地，本文所述的制剂使得能够在全身性施用编码抗原的RNA后诱导免疫应答。背景技术核酸如DNA、siRNA或RNA用于在患者中进行多种治疗性干预是令人感兴趣的。在肿瘤治疗中相对新的免疫学方法是基于通过编码RNA在抗原呈递细胞APC中表达肿瘤抗原，以诱导针对肿瘤的T细胞应答Weide，B.等，2008JournalofImmunotherapy312：180-188；Weide，B.等，2009JournalofImmunotherapy325：498-507；Kreiter，S.等，2010CancerRes7022：9031-9040；Kuhn，A.N.等，2010GeneTher178：961-971。用于此种干预的靶细胞是存在于例如淋巴结LN或脾中的树突细胞DC。为了提供DC对RNA的充分摄取，将RNA局部施用于淋巴结已被证明是成功的。然而，这样的局部施用需要医生的专业技能。因此，需要能够进行全身性施用的RNA制剂，例如，静脉内i.v.施用、皮下s.c.施用、皮内i.d.施用或通过吸入施用。从文献中已知多种用于全身性施用核酸的方法。在非病毒基因的转移中，使用阳离子脂质体来诱导DNARNA缩合，并且促进细胞摄取。阳离子脂质体通常由阳离子脂质如DOTAP和一种或更多种辅助脂质如DOPE组成。所谓的“脂质体复合物lipoplex”可由阳离子带正电的脂质体和阴离子带负电的核酸形成。在最简单的情况下，脂质体复合物通过某种混合方案使核酸与脂质体混合来自发形成，但是也可应用多种其他方案。带正电的脂质体与带负电的核酸之间的静电相互作用是形成脂质体复合物的驱动力。除了脂质组分以外，阳离子部分和阴离子部分之间的电荷比也对有效的缩合和转染起重要作用。一般来说，脂质体复合物的过量正电荷被认为是有效转染所必需的Templeton，N.S.等，1997NatureBiotechnology157：647-652；Zhdanov，R.I.等，2002Bioelectrochemistry581：53-64；Templeton，N.S.2003CurrentMedicinalChemistry1014：1279-1287。大多数天然膜带负电，因此，带正电的脂质体复合物与带负电的生物膜之间的静电相互吸引作用可能在细胞结合和脂质体复合物摄取方面起作用。被视为转染的最优+-比率的典型范围是2至4。如果具有较低的过量正电荷，则转染效率大幅下降至几乎为零。遗憾的是，由于已报道带正电的脂质体和脂质体复合物具有升高的毒性，这对于这样的制备物作为药品的应用是一个问题。已证实，上述脂质体复合物能够在多种器官中进行转染。表达的具体的器官分布以复杂的方式取决于制剂和施用参数脂质组成、尺寸、施用途径。迄今为止，还不能充分实现在指定的靶器官或细胞部分中进行选择性表达同时避免在非靶器官中表达。已经报道了使用萤光素酶DNA或RNA作为报道基因reporter，在例如肺、肝、脾、肾和心脏中进行的转染。已证明，避免靶向肺和肝特别困难，因为，在许多情况下，靶向肺和肝占主导。肺具有非常大的表面，并且它是经i.v.注射的化合物在施用后第一个通过的器官。肝是脂质体和具有亲脂性化合物如存在于脂质体复合物中的脂质制剂的典型靶器官。对于基于RNA的免疫治疗，由于存在对肺或肝的免疫应答的风险，所以靶向肺或肝可能是有害的。因此，对于这样的治疗，需要仅对DC例如脾中的具有高选择性的制剂。某些配体已被认为可改进靶向选择性。例如，包含甘露糖官能化脂质的脂质体被认为能改进对巨噬细胞的靶向。然而，这样的组分使制剂更加复杂，从而使得实际的药物开发更加复杂。此外，选择性被限制，并且某些脂质体级分仍然被其他器官摄取。另一个问题是血清的相互作用以及RNA在血清中的降解，带正电的脂质体复合物对其起促进作用。此外，对于治疗适用性，需要满足药品在例如化学稳定性和物理稳定性方面的要求。此外，用于腹膜内应用的产品必须是无菌的并且满足颗粒特性方面的某些要求。此外，产品必须适合于制造。总之，在开发具有高的脾选择性的、满足用于施用于患者之产品标准的可注射RNA制剂方面的问题仍有待解决。本发明提供了对上述问题的解决方案。根据本发明，提供了具有限定粒径的纳米颗粒RNA制剂，其中所述颗粒的净带电接近为0，或者带负电。在一个特别优选的实施方案中，所述RNA纳米颗粒是RNA脂质体复合物。意想不到的是，发现由RNA和脂质体形成的电中性或带负电的脂质体复合物在全身性施用后导致RNA在脾DC中大量表达。测定出报道基因在靶细胞脾中的强表达，而在其他器官中低表达。此外，可诱导针对模式抗原的强免疫应答。这是令人意想不到的，因为过量的正电荷通常被认为是成功摄取和表达的前提条件。在此，我们已发现，虽然表达的绝对量随着过量正电荷的降低而降低，但是在全身性施用后表达仍然高至足以提供脂质体复合物的治疗效力。根据本发明，可形成具有明确限定的粒径分布特征通过动态光散射测量并且具有低级分的亚可见颗粒的脂质体复合物，其为对患者进行静脉内施用所需的。如果通过自装配将脂质体与RNA孵育来形成，则初始脂质体的粒径仅受到轻微影响，并且没有发现不期望的大聚集物部分。通过选择前体脂质体的尺寸和混合条件，可得到不同尺寸。这是令人惊讶的，因为在将RNA与阳离子脂质体孵育过程中通常观察到大聚集物的形成。该聚集物的形成对于开发用于静脉内施用或皮下施用可接受的脂质体复合物制剂来说是一个主要障碍。所述颗粒在至少24小时内是稳定的，并且不倾向于随时间而聚集。所述颗粒可进行冷冻和融化，而不会形成聚集物，同时保持初始粒径特征，并且保持生物学活性。所述颗粒可进行冻干和用水重构，而不会形成聚集物，同时保持初始粒径特征，并且保持生物学活性。所述颗粒可通过不同的方案来制造，这些方案可扩展并且可在受控的条件下进行。由于有着这样的性质，本发明的脂质体复合物制剂在粒径分布特征和稳定性方面满足药物制剂施用于患者的重要要求。此外，与带正电的脂质体复合物相比，本文所述的RNA纳米颗粒预期具有更低的毒性并且表现出更小的不期望的血清相互作用。特别地，所述制剂适用于肠胃外施用，包括静脉内施用和皮下施用。发明内容发明概述免疫治疗策略是用于治疗例如感染性疾病和癌症疾病的有前景的选择。对越来越多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原本文中也称为肿瘤抗原的鉴定导致收集了大量用于免疫治疗的合适靶标。本发明一般包含通过靶向病变细胞来对疾病进行免疫治疗。本发明提供了对表达抗原的细胞的选择性清除，从而使对不表达所述抗原的正常细胞的有害作用最小化。因此，优选的用来治疗的疾病是其中一种或更多种抗原被表达的那些，例如癌症疾病或感染性疾病。本发明旨在在患者中通过主动免疫来诱导并扩增能够特异性识别并杀伤病变细胞的T细胞，以特异性靶向表达抗原的细胞。具体地，本发明使表示为RNA的抗原能够在体内选择性地进入抗原呈递细胞例如，树突细胞中。该抗原可被加工以产生MHC分子的肽伴侣，或者如果其可与MHC分子结合的话，则其可在不需要进一步加工的情况下被呈递。优选其中完整抗原在体内通过抗原呈递细胞被加工的施用形式，因为这还可产生有效免疫应答所需的辅助T细胞应答。因此，当施用于患者时，根据本发明所提供的组合物提供了一种或更多种MHC呈递表位，用于刺激、引发和或扩增针对T细胞，该T细胞所针对的细胞表达MHC所呈递表位的来源抗原。因此，本文所述的组合物优选能够诱导或促进针对以呈递I类MHC抗原为特征之疾病的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性。特别地，本发明涉及包含纳米颗粒的药物组合物，所述纳米颗粒包含编码的至少一种抗原的RNA，其中：i所述纳米颗粒中的正电荷数不超过所述纳米颗粒中的负电荷数，和或ii所述纳米颗粒具有中性电荷或净负电荷，和或iii在所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4∶1或更低，和或iv所述纳米颗粒的ζ电势为0或更低。优选地，本文所述纳米颗粒在至少2小时内是胶体稳定的，即，不发生聚集、沉淀，或者通过动态光散射测量不发生高于30％的尺寸和多分散性指数的升高。在一个实施方案中，所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4∶1至1∶8，优选1.2∶1至1∶4，例如，1∶1至1∶3，例如1∶1.2至1∶2，1∶1.2至1∶1.8，1∶1.3至1∶1.7，特别是1∶1.4至1∶1.6，例如约1∶1.5。在一个实施方案中，所述纳米颗粒的ζ电势为-5或更低，-10或更低，-15或更低，-20或更低或者-25或更低。在多个实施方案中，所述纳米颗粒的ζ电势为-35或更高，-30或更高或者-25或更高。在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有0mV至-50mV，优选0mV至-40mV或者-10mV至-30mV的ζ电势。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一种脂质。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质。所述阳离子脂质可为单阳离子的monocationic或多阳离子的polycationic。任何阳离子两亲分子例如包含至少一个亲水和亲脂部分的分子都是本发明涵义范围内的阳离子脂质。在一个实施方案中，所述正电荷由所述至少一种阳离子脂质贡献，而所述负电荷由所述RNA贡献。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一种辅助脂质。所述辅助脂质可为中性脂质或阴离子脂质。所述辅助脂质可为天然脂质例如磷脂或天然脂质类似物，或完全合成脂质，或与天然脂质没有相似性的类脂质分子。在一个实施方案中，所述阳离子脂质和或所述辅助脂质是形成双层bilayer的脂质。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷DOTMA或其类似物或衍生物，和或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP或其类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述至少一种辅助脂质包括1，2-二-9Z-十八酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺1，2-di-9Z-octadecenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE或其类似物或衍生物、胆固醇Chol或其类似物或衍生物和或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱DOPC或其类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比为10∶0至3∶7，优选9∶1至3∶7、4∶1至1∶2、4∶1至2∶3、7∶3至1∶1或2∶1至1∶1，优选约1∶1。在一个实施方案中，在该比率中，所述阳离子脂质的摩尔量通过用所述阳离子脂质的摩尔量乘以所述阳离子脂质中的正电荷数而得到。在多个实施方案中，所述脂质不被官能化，例如，不被甘露糖、组氨酸和或咪唑官能化，所述纳米颗粒不包含靶向配体，例如甘露糖官能化的脂质，和或所述纳米颗粒不包含以下的一种或更多种：pH依赖性化合物、阳离子聚合物例如包含组氨酸和或聚赖氨酸的聚合物，其中所述聚合物可任选地被PEG化PEGylated和或组胺酰基化histidylated或二价离子例如Ca2+。在多个实施方案中，所述RNA纳米颗粒可包含肽，其优选具有高至2500Da的分子量。在本文所述的纳米颗粒中，所述脂质可与所述RNA形成复合物和或可包封所述RNA。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含脂质体复合物或脂质体。在一个实施方案中，所述脂质被包含在包封所述RNA的囊泡中。所述囊泡可为多层囊泡、单层囊泡或其混合物。所述囊泡可为脂质体。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和胆固醇，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTAP和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.4∶1或更低。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1的DOTMA和胆固醇，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.4∶1或更低。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1的DOTAP和DOPE，并且其中DOTAP中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.4∶1或更低。在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约50nm至约1000nm，优选约50nm至约400nm，优选约100nm至约300nm，例如约150nm至约200nm的平均粒径。在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约200nm至约700nm、约200nm至约600nm，优选约250nm至约550nm，特别为约300nm至约500nm或约200nm至约400nm范围内的平均粒径。在一个实施方案中，通过动态光散射测量的本文所述纳米颗粒的多分散性指数为0.5更低，优选0.4或更低，或者甚至更优选0.3或更低。在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒可通过以下一种或更多种方式得到：i将水相中的脂质体与水相中的RNA一起孵育，ii将溶解于水可混溶有机溶剂例如乙醇中的脂质与水溶液中的RNA一起孵育，iii逆相蒸发技术，iv对所述产物进行冷冻和融化，v对所述产物进行脱水和再水化，vi对所述产物进行冻干和再水化，或vii对所述产物进行喷雾干燥和再水化。在一个实施方案中，所述纳米颗粒通过这样的方法来生产，其包括将所述RNA与优选0.1mM至5mM例如0.1mM至4mM或0.3mM至1mM浓度的二价离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和或将所述RNA与优选1mM至500mM例如100mM至200mM或130mM至170mM浓度的一价离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和或将所述RNA与缓冲剂一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中的步骤。在一个实施方案中，在对RNA进行二价阳离子的孵育后，涉及通过添加脂质体和或其他水相来进行至少大于1.5倍，优选大于2倍，或大于5倍的稀释步骤。在一个实施方案中，所述二价阳离子是钙离子，其中所述钙离子的终浓度低于4mM，优选低于3mM，甚至更优选为2.2mM或更低。在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒通过这样的方法来生产，所述方法包括挤出所述纳米颗粒的步骤和或过滤所述纳米颗粒的步骤和或冻干所述纳米颗粒的步骤。在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾中发生RNA表达。在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在肺和或肝中发生或基本发生RNA表达。在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，脾中的RNA表达是肺中RNA表达量的至少5倍，优选至少8倍，优选至少10倍，优选至少20倍，优选至少50倍，优选至少100倍，优选至少1000倍或甚至更高。在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾的抗原呈递细胞中，优选专职性抗原呈递细胞中，发生RNA表达。在一个实施方案中，当进行全身性施用时，所述纳米颗粒靶向脾，或在脾中累积。优选地，当进行了全身性施用时所述纳米颗粒将RNA递送至脾的抗原呈递细胞，优选专职性抗原呈递细胞，例如树突细胞和或巨噬细胞。优选地，所述纳米颗粒在靶器官或靶组织处释放RNA，和或进入靶器官或靶组织的细胞中。优选地，所述靶器官或靶组织是脾，所述靶器官或靶组织处的细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞。在一个实施方案中，当进行了全身性施用时，所述纳米颗粒不靶向或基本不靶向肺和或肝，或不在或基本不在肺和或肝累积。在一个实施方案中，靶向脾或在脾中累积的纳米颗粒的量是靶向肺或在肺中累积的量的至少5倍，优选至少8倍，优选至少10倍，优选至少20倍，优选至少50倍，优选至少100倍，优选至少1000倍或甚至更高。根据本发明，全身性施用优选通过肠胃外施用，优选通过静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用。由本文所述纳米颗粒中包含的RNA编码的抗原优选是疾病相关抗原，或者其引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。本发明的药物组合物还可包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和或赋形剂。本发明的药物组合物还可包含至少一种佐剂。本发明的药物组合物可配制成用于全身性施用。本发明的药物组合物可用于诱导免疫应答，特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫应答，例如针对癌症的免疫应答。因此，所述药物组合物可用于预防性和或治疗性处理涉及疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的疾病，例如癌症。优选地，所述免疫应答是T细胞应答。在一个实施方案中，所述疾病相关抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中，包含在本文所述的纳米颗粒中的RNA不包含假尿苷残基，并且优选不包含经修饰的核苷。本发明还涉及用于将抗原递送至脾的抗原呈递细胞优选为专职性抗原呈递细胞，例如树突细胞和或巨噬细胞或在脾的抗原呈递细胞优选为专职性抗原呈递细胞，例如树突细胞和或巨噬细胞中表达抗原的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于对象。本发明还涉及用于在对象中诱导免疫应答优选针对癌症的免疫应答的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。本发明还涉及用于在对象中刺激、引发和或扩增T细胞的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。本发明还涉及用于在对象中治疗或预防涉及抗原的疾病优选癌症疾病的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。在以上方面中，所述疾病可为肿瘤生长和或肿瘤转移。因此，本发明还涉及在患有肿瘤发生和或肿瘤转移或处于其风险下的对象中治疗或预防肿瘤生长和或肿瘤转移的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。在一个方面中，本发明还提供了用于本文所述的治疗方法的本文所述的药剂和组合物。本发明还涉及本文所述的颗粒。本发明还涉及用于生产包含RNA的纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：a提供配制在氯化钠溶液中的RNA，以及b向所述RNA添加脂质体。所述氯化钠溶液可为水溶液。水可用于制备氯化钠溶液，并且在一个实施方案中，其可为所用的唯一溶剂。在一个实施方案中，所述氯化钠溶液包含约50mM至约300mM，优选约100mM至约200mM，优选约150mM的氯化钠。在一个实施方案中，所述氯化钠溶液是等渗的氯化钠溶液。所述脂质体可在水中配制。在一个实施方案中，通过将所述脂质体注入所述RNA制剂中来将所述脂质体添加至所述RNA中。根据上述方法生产的纳米颗粒可为如本文所述的纳米颗粒。由下文的详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。附图说明图1：在水a中、PBSb中，以及在添加2.2mMCaCl2c和22mMCaCl2d后的PBS中，在不同DOTMARNA电荷比21、11、12、14下的F4RNA脂质体复合物的尺寸。图2：在不同缓冲剂中以及11和21的DOTMARNA电荷比正电荷过量下的DOTMAChol脂质体F5和脂质体复合物的尺寸。图3：在使用不同量的CaCl2进行RNA缩合后，在11和12的电荷比下F5RNA脂质体复合物的平均尺寸。图4：具有DOTMADOPE脂质体的RNA脂质体复合物的理化特征选择结果的概览。X轴是DOTMA和RNA之间的电荷比。顶部：通过PCS测量得到的粒径；中间：多分散性指数；底部：相同制剂的ζ电势。引入线来引导眼睛。图5：a在水中以及添加浓缩缓冲剂后的PBS1×中、氯化钠150mM中、葡萄糖Glu5％中或磷酸盐缓冲的葡萄糖中，12的电荷比下F4Luc-RNA脂质体复合物的平均尺寸。与在所有缓冲条件下导致聚集在此未示出的11比率相比，比率为12的脂质体复合物的尺寸为约220nm。b尺寸的多分散性范围为0.23至0.34，指示了胶体稳定性。图6：a在选定的DOTMARNA电荷比下F4RNA脂质体复合物的平均尺寸。电荷比为1∶1.8至1∶1.4的脂质体复合物的粒径为约160nm。在负电荷过量电荷比1∶1.2降低时，粒径被测定为183nm。b所有测试的电荷比导致脂质体复合物具有低于0.2的小的多分散性指数。图7：a未经挤出F4-原始、使用孔径为400nmF4-400、200nmF4-200、100nmF4-100或50nmF4-50的聚碳酸酯膜挤出后的水中的DOTMADOPE脂质体1∶2的平均尺寸。DOTMARNA电荷比为12的相应的脂质体复合物，在水中2：以及在PBS缓冲剂中3：。b具有经挤出脂质体的脂质体复合物的尺寸多分散性范围为0.10至0.28。然而，由未经挤出的脂质体形成的脂质体复合物也示出充分窄的尺寸分布。图8：冻干前和冻干并用水重构后测定的DOTMADOPE脂质体F4的平均尺寸a和多分散性指数b。图9：具有不同DOTMADOPE比率的脂质体的粒径。对于具有高DOPE90％级分的脂质体，颗粒在PBS中不稳定并且聚集。图10：具有包含不同DOTMADOPE比率的脂质体的脂质体复合物的粒径。DOTMADOPE比率为91至46时，脂质体复合物具有限定粒径＜300nm以及低的PI值＜0.2。当具有更高的DOPE级分时，得到更大的粒径以及高的PI值。图11：使萤光素酶-RNA20μg与不同量的F4脂质体复合complex以得到4.8∶1、2.4∶1、1.2∶1、1.2∶2、1.2∶4的F4∶RNA比率，将复合物注射到BALBc小鼠中后的体内萤光素酶活性和体外萤光素酶活性。图12：来源于图11中描绘之实验的器官中总萤光素酶信号的分布。图13：使萤光素酶-RNA20μg与F11或F12脂质体复合，将复合物注入BALBc小鼠中后的体内萤光素酶活性和体外萤光素酶活性。图14：使萤光素酶-RNA20μg与F2或F5脂质体复合，将复合物注入BALBc小鼠中后的体内萤光素酶活性和体外萤光素酶活性。图15：使萤光素酶-RNA20μg在1×PBS中稀释A或在水中未稀释B和C，与在1×PBS中稀释B或在水中未稀释A和C的F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，注射复合物后定量小鼠的脾中的萤光素酶活性。所有复合物的最终PBS浓度设置为1×PBS。图16：使萤光素酶-RNA20μg与0.125mM或1mM的CaCl2预复合或不预复合，并与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率混合，注射复合物后定量小鼠的脾中的萤光素酶活性。图17：使萤光素酶-RNA20μg或F4脂质体在1×PBS中或154mMNaCl中稀释，并以1.2∶2的F4∶RNA比率混合，注射复合物后定量小鼠脾中的萤光素酶活性。图18：，使用154mM的NaCl替代1×PBS作为稀释缓冲剂，使与1mM至4mM的CaCl2预混合的萤光素酶-RNA20μg与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率混合，注射复合物后定量小鼠的脾中的萤光素酶活性。图19：A将萤光素酶-RNA5μg在25％或50％的小鼠血清中孵育30分钟。然后通过电穿孔进入源自人单核细胞的未成熟DC。18小时后通过标准体外萤光素酶测定来评估萤光素酶活性。B将通过标准方案使萤光素酶-RNA20μg与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，然后在50％小鼠血清的存在或不存在下孵育30分钟。用这些制剂经静脉内注射至BALBc小鼠中，在小鼠的脾中对萤光素酶活性进行体内定量。图20：使Cy5-RNA40μg与用罗丹明标记的F4脂质体F4-rho复合1.2∶2；脂质体∶RNA，将复合物注射至BALBc小鼠后，评估脾中的细胞群对Cy5-RNA或F4-rho的摄取。图21：将与F4复合1.2∶2；脂质体∶RNA的HA-RNA40μg、单独的F4或PBS作为对照注射至C57BL6小鼠中后，评估A树突细胞的成熟状态通过CD86和CD40的上调显示以及BIFNa和TNFa的血清浓度。图22：使SIINFEKL-RNA20或40μg与F4脂质体以不同的脂质体：RNA比率复合，用复合物免疫接种C57BL6小鼠后评估A抗原特异性CD8+T细胞的频数以及B记忆应答。图23：C57BL6小鼠的Kaplan-Meier存活曲线，使SIINFEKL-RNA40μg与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，C57BL6小鼠接受三次经静脉内的混合物免疫接种，或不进行处理，并将2×105B16-OVA肿瘤细胞皮下注射至所述小鼠的肋部。图24：C57Bl6小鼠在皮下接种2×105B16-OVA肿瘤细胞至肋部后的单个肿瘤生长，使SIINFEKL-RNA40μg与F4脂质体或F12脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，所述小鼠接受了七次复合物经静脉内的免疫接种。将没有SIINFEKL-RNA的单独脂质体用作对照处理。图25：C57B16小鼠在皮下接种2×105B16-OVA肿瘤细胞至肋部后的KaplanMeier存活曲线，使SIINFEKL-RNA40μg与F4脂质体或F12脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，所述小鼠接受了七次经静脉内的复合物免疫接种。将没有SIINFEKL-RNA的单独脂质体用作对照处理。图26使萤光素酶-RNA20μg与不同量的F5脂质体复合以得到4.8∶1、2.4∶1、1.2∶1、1.2∶2、1.2∶4的F5∶RNA比率，将复合物注射至BALBc小鼠中后的体内萤光素酶活性和体外萤光素酶活性。图27：来源于图26中描绘之实验的器官中总萤光素酶信号的分布。图28：RNA的预制剂以及RNA-脂质体复合物溶液的重构。图29：根据临床配制方案重构的RNA脂质体复合物的DLS测量的结果。得到的脂质体复合物粒径的有限的分布证实该混合方法的稳健性。图30：经挤出的脂质体前体和非经挤出的脂质体前体的1∶2脂质体复合物的粒径和多分散性指数。图31：使萤光素酶-RNA20μg与在PBS中的小脂质体或大脂质体复合，以得到尺寸不同的脂质体复合物，将复合物注射至BALBc小鼠中后的体内萤光素酶活性。图32：注射不同尺寸的萤光素酶-RNA脂质体复合物后，小鼠的脾中萤光素酶活性的定量。较大的脂质体复合物由较大的脂质体装配，具有较高的活性，与该脂质体的脂质组分无关。图33：通过以“标准”形式和10×浓缩形式使用NaCl缓冲剂和PBS缓冲剂形成脂质体复合物。在后一种的情况下，添加110的体积以得到相同的终浓度。所有的脂质体复合物具有大约相同的尺寸，但是由浓缩溶液得到的那些稍小。图34：在图33中测量的脂质体复合物的活性luc的表达。从趋势看，由非浓缩的缓冲剂得到的脂质体复合物具有较高活性。用标准生理盐水处理得到最高的活性。图35：以不同浓度将NaCl添加至RNA后形成的脂质体复合物。NaCl终浓度在所有情况下都相同，因为浓缩的溶液添加较少的体积。从趋势看，脂质体复合物的尺寸随着所添加的NaCl溶液浓度的降低而增大。因为较大的脂质体复合物活性比较小的脂质体复合物高，所以，认为使用0.9％NaCl150mM产生了最佳的活性。图36：具有不同混合比率DOTMA核苷酸比率的脂质体复合物在重构后立即测量以及在2小时后和在24小室后测量的尺寸Zave和多分散性指数PI。图37：体内测试的具有不同电荷比的RNA脂质体复合物的DLS测量结果。图38：注射不同尺寸的萤光素酶-RNA脂质体复合物后，小鼠的脾中萤光素酶活性的定量。具体实施方式虽然以下详细描述了本发明，但是应理解，本发明并不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些是可变化的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制本发明的的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。在下文中将描述本发明的要素。虽然这些要素与具体实施方案一起列出，但是应理解，它们可以任何方式和任意数目进行组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例和优选实施方案不应被解释为仅将本发明限制于明确描述的实施方案。此描述应被理解为支持并涵盖将明确描述之实施方案与任意数目之公开和或优选要素组合的实施方案。此外，除非在上下文中另有说明，否则在本申请中的所有描述的要素的任何排列与组合都应被视为通过本申请的说明书公开。优选地，本文所使用的术语如在“Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：IUPACRecommendations”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.编著，1995HelveticaChimicaActa，CH-4010Basel，Switzerland中所描述的进行定义。除非另有说明，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学的常规方法以及在本领域文献中所解释的重组DNA技术参见例如，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，J.Sambrook等编著，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor1989。在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有说明，否则词语“包含”“包括”应理解为表示包含所述成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可被排除，即，该主题由所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组组成。除非在本文中另有说明或与上下文明显相矛盾，否则在描述本发明的上下文中尤其是权利要求书的上下文中未使用数量词修饰的名词和类似的指代应解释为涵盖单数和复数二者。本文列举的数值范围仅旨在充当逐一列举落入该范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文中另有说明，否则每个单个值都将并入说明书中，就如其在本文中被单独记载一样。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言例如，“例如”的使用仅旨在更好地阐述本发明，而不构成对另外要求的本发明范围的限制。在本说明书中没有语言应被解释为表示任何未要求保护的要素对实施本发明必不可少。本说明书的整个文本中引用了几篇文献。本文引用的每篇文献包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书手册、使用说明等无论上文或下文均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于这些公开。本发明描述了施用后诱导免疫应答的药剂和组合物，所述免疫应答特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞例如癌细胞的细胞免疫应答。特别地，本发明预期了RNA编码诱导免疫应答的抗原性蛋白质或肽本文中也称为“抗原”的用途，所述免疫应答特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的T细胞应答。这些抗原性蛋白质或肽可包含基本与疾病相关抗原或其一个或更多个片段的序列对应的或者与其相同的序列。在一个实施方案中，所述抗原性蛋白质或肽包含来自疾病相关抗原的MHC呈递的肽序列。用编码完整或基本完整的疾病相关抗原或其片段例如I类MHC肽和II类MHC肽的RNA进行免疫使得能够诱导I类MHC应答和或II类MHC应答，从而刺激T细胞，例如能够裂解病变细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，和或CD4+T细胞。这样的免疫还可诱导体液免疫应答B细胞应答，导致产生针对该抗原的抗体。因此，本发明的药物组合物可用于基因疫苗接种，在基因疫苗接种中通过向对象中引入编码抗原性蛋白质或肽的合适RNA分子来刺激免疫应答。本文公开的药剂和组合物可用作治疗性或预防性疫苗，用于治疗或预防疾病，例如，本文公开的疾病。在一个实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤抗原。在该实施方案中，本文描述的药剂和组合物可用于治疗癌症或癌转移。优选地，病变器官或组织的特征为病变细胞，例如表达疾病相关抗原，并且优选为在MHC分子环境下呈递疾病相关抗原的癌细胞。术语“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体应答，优选指细胞免疫应答，或细胞免疫应答和体液免疫应答。所述免疫应答可为保护性防止性预防性和或治疗性的。“诱导免疫应答”可意为，在诱导前针对特定抗原或表达抗原的细胞没有免疫应答，但是其还可意为在诱导前针对特定抗原或表达抗原的细胞有一定水平的免疫应答，并且在诱导后所述免疫应答得到增强。因此，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答后，所述对象受到保护免于发生疾病，例如感染性疾病或癌症疾病，或者通过诱导免疫应答使疾病症状减轻。例如，可在患有病毒性疾病的患者中或在处于发生病毒性疾病之风险的对象中针对病毒性抗原诱导免疫应答。例如，可在患有癌症疾病的患者中或在处于发生癌症疾病风险下的对象中针对肿瘤抗原诱导免疫应答。在这种情况下，诱导免疫应答可意为，所述对象的疾病状态减轻，所述对象没有发生转移，或处于发生癌症疾病风险下的对象没有发生癌症。“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“针对抗原的细胞应答”或类似术语意为，包括针对表达抗原并且以由I类或II类MHC呈递抗原为特征之细胞的细胞应答。所述细胞应答涉及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当“辅助细胞”或“杀伤细胞”。辅助T细胞也称为CD4+T细胞通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞也称为细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL杀伤病变细胞例如受感染细胞或癌细胞，防止产生更多的病变细胞。在一些优选实施方案中，本发明涉及针对表达一种或更多种肿瘤抗原并且优选由I类MHC呈递该肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CTL应答刺激。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个能引发免疫应答的表位和或免疫应答所针对的表位的任何分子，优选肽或蛋白质。优选地，本发明上下文中的抗原是这样的分子，其任选在加工后诱导优选特异性针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫应答。特别地，“抗原”涉及指这样的分子，其任选在加工后被MHC分子呈递，并特异地与T淋巴细胞T细胞反应。因此，抗原或其片段应能够被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别，抗原或片段能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别该抗原或片段之T细胞受体的T细胞进行克隆扩增。在本发明实施方案的上下文中，抗原或片段在MHC分子的环境下优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞和或病变细胞呈递，其导致针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫应答。根据本发明，设想了作为用于免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中所述免疫应答优选为细胞免疫应答。抗原优选为对应于或来自于天然存在的抗原的产物。该天然存在的抗原可包括或可来自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其一部分。术语“病原体”涉及病原微生物，并且包括病毒、细菌、真菌、单细胞生物和寄生虫。病原病毒的实例有人免疫缺陷病毒HIV、巨细胞病毒CMV、疱疹病毒HSV、甲肝病毒HAV、HBV、HCV、乳头瘤病毒和人嗜T细胞病毒humanT-lymphotrophicvirus，HTLV。单细胞生物包括疟原虫、锥体虫、阿米巴虫等。术语“疾病相关抗原”是指所有具有病原显著性的抗原，并且包括“肿瘤抗原”。根据本发明，期望诱导针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原并且优选在MHC分子的环境下呈递疾病相关抗原之细胞的免疫应答。优选地，疾病相关抗原是天然存在的抗原。在一个实施方案中，疾病相关抗原在病变细胞中表达，并且优选由细胞的MHC分子呈递。由包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原应诱导针对待靶向的疾病相关抗原或表达待靶向之疾病相关抗原的细胞的免疫应答。因此，由包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可对应于或者可包含疾病相关抗原或其一个或更多个免疫原性片段，例如疾病相关抗原的一个或更多个MHC结合肽。因此，由包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可为重组抗原。本发明上下文中的术语“重组”意为“通过基因工程来制造”。优选地，“重组物质”例如本发明上下文中的重组核酸不是天然存在的。本文所用术语“天然存在的”是指物质可以在自然界中找到的事实。例如，存在于生物体包括病毒中且可从天然来源分离，并且没有在实验室中被人有意改造的肽或核酸是天然存在的。在一个优选实施方案中，抗原可为肿瘤抗原，即，癌细胞的组分，例如在癌细胞中表达的、可来自细胞质、细胞表面或细胞核的蛋白质或肽，特别是主要在胞内出现或作为癌细胞上的表面抗原的那些。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原carcinoembryonalantigen、α1-胎蛋白、异铁蛋白以及胚胎性硫糖蛋白抗原fetalsulphoglycoprotein、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白。根据本发明，肿瘤抗原优选包括任何这样的抗原，其在肿瘤或癌中以及在肿瘤细胞或癌细胞中表达，并且任选表征肿瘤或癌以及肿瘤细胞或癌细胞的类型和或表达水平。在本发明上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”优选涉及在正常条件下在有限数量的组织和或器官中或在特定的发育阶段特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤抗原可为在正常条件下在胃组织中优选在胃黏膜中、在生殖器官中例如在睾丸中、在滋养层组织例如在胎盘或在生殖系细胞中特异性表达，并且在一种或更多种肿瘤组织或癌组织中表达或异常表达。在此上下文中，“有限数量”优选是指不超过3，更优选不超过2或1。本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即，在正常条件下在某个分化阶段的某个细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症睾丸抗原，即，在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及生殖系特异性抗原。在本发明的上下文中，所述肿瘤抗原优选在正常组织中不表达，或仅很少表达。优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴别癌细胞。在本发明上下文中，对象例如，患有癌症疾病的患者的癌细胞表达的肿瘤抗原优选是所述对象的自身蛋白质。在一些优选实施方案中，本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官即，当被免疫系统损伤时不导致对象死亡的组织或器官中，或者免疫系统不可及或难以触及的身体器官或结构中特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿瘤抗原之间，肿瘤抗原的氨基酸序列相同。优选地，肿瘤抗原由表达该抗原的癌细胞呈递。可在本发明中使用的肿瘤抗原的实例为p53、ART-4，BAGE、β-连环蛋白mbeta-cateninm、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4m、CEA、紧密连接蛋白家族的细胞表面蛋白例如，CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT或hTRT、LAGE、LDLRFUT、MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11，或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1Melan-A、MC1R、肌球蛋白m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190小BCR-abLp190minorBCR-abL、Pm1RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TELAML1、TPIm、TRP-1、TRP-2、TRP-2INT2、TPTE和WT，优选WT-1。术语“表位”是指分子例如抗原中的抗原决定簇，即，指被免疫系统识别例如，由T细胞识别，特别是当在MHC分子的环境下呈递时的该分子的一部分或片段。蛋白质例如肿瘤抗原的表位优选包含所述蛋白质的连续部分或不连续部分，并且为优选5至100个，优选5至50个，更优选8至30个，最优选10至25个氨基酸长，例如，所述表位可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个氨基酸长。特别优选的是，在本发明上下文中的表位是T细胞表位。根据本发明，表位可与MHC分子例如在细胞表面上的MHC分子结合，因此可为“MHC结合肽”。术语“MHC结合肽”是指与I类MHC和或II类MHC分子结合的肽。在I类MHC肽复合物的情况下，结合肽通常为8至10个氨基酸长，尽管更长或更短的肽可为有效的。在II类MHC肽复合物的情况下，结合肽通常为10至25个氨基酸长，并且特别地为13至18个氨基酸长，虽然更长和更短的肽可为有效的。根据本发明，由被包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段，例如疾病相关抗原的肽片段本文中也称为抗原肽，优选为MHC结合肽。根据本发明的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够刺激免疫应答的抗原的部分或片段，所述免疫应答优选为针对抗原或者表达抗原并优选呈递所述抗原之细胞例如病变细胞，特别是癌细胞的细胞应答。优选地，抗原的免疫原性片段能够刺激针对以由I类MHC呈递抗原为特征之细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原应答性CTL。优选地，其为被T细胞受体识别即，特异性结合的抗原的部分，特别是如果其在MHC分子的环境下被呈递更是如此。某些优选的免疫原性片段与I类或II类MHC分子结合。本文所用的免疫原性片段被认为与I类或II类MHC分子“结合”，如果这样的结合使用本领域已知的任何测定可检测。优选地，根据本发明的抗原的免疫原性片段是I类和或II类MHC呈递的肽，或者可被加工以产生I类和或II类MHC呈递的肽。优选地，抗原的免疫原性片段包含与该抗原片段的氨基酸序列基本相对应，并且优选与之相同的氨基酸序列。优选地，所述的抗原片段是I类和或II类MHC呈递的肽。如果肽被直接呈递即，不经加工，特别是不经切割，则其具有适合与MHC分子特别是I类MHC分子结合的长度，并且优选为7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨基酸长，更优选8至11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长。如果肽是包含额外序列的更大实体例如，多肽的一部分，并且将在加工后特别是经过切割后被呈递，则通过加工产生的肽具有适合与MHC分子特别是I类MHC分子结合的长度，并且优选为7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨基酸长，更优选8至11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长。优选地，将在加工后呈递的肽序列源自抗原的氨基酸序列，即，其序列与抗原片段基本对应并且优选完全相同。因此，由包含在本文所述的纳米颗粒中的RNA编码的抗原，可包含与MHC呈递的疾病相关抗原片段基本相对应并优选完全相同的7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨基酸长，更优选8至11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长的序列，并且在加工后构成呈递的肽。具有与由I类MHC呈递的肽序列基本相对应的氨基酸序列的肽可有一个或更多个残基差异，所述残基对于肽在由I类MHC呈递时的TCR识别或对于肽与MHC的结合不是必要的。这样的基本相对应的肽还能够刺激具有期望特异性的CTL，并且可视作免疫等效的。当由MHC呈递时，肽应当可以被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别，则所呈递的肽能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别所呈递之肽的T细胞受体的T细胞进行克隆扩增。优选地，抗原肽特别是如果在MHC分子的环境下呈递能够刺激免疫应答，优选针对它们来自的抗原或表达该抗原并且优选呈递该抗原之细胞的细胞应答。优选地，抗原肽能够刺激针对由I类MHC呈递抗原之细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原应答性CTL。这样的细胞优选是本发明目的的靶细胞。“靶细胞”应当意为作为免疫应答例如细胞免疫应答靶标的细胞。靶细胞包括这样的细胞，其表达抗原例如疾病相关抗原，并优选呈递所述抗原特别地，呈递所述抗原意为在细胞中加工抗原，并在细胞上的MHC分子环境下呈递该抗原的一个或更多个片段。靶细胞包括任何不期望的细胞，例如受感染的细胞或癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞是表达如本文所述的抗原并优选由I类MHC呈递所述抗原的细胞。“抗原加工”是指抗原降解成加工产物例如，将蛋白质降解成肽，并且将这些片段中的一个或更多个与MHC分子相关联例如，通过结合来被细胞优选抗原呈递细胞呈递至特异性T细胞，所述加工产物是所述抗原的片段。抗原呈递细胞APC是在其表面在主要组织相容性复合物MHC的环境中呈递即，展示抗原的细胞。这包括其中呈递抗原的仅一个片段或更多个片段的情况。T细胞可用它们的T细胞受体TCR识别该复合体。抗原呈递细胞加工抗原，并将它们呈递至T细胞。专职性抗原呈递细胞在将抗体内化通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用，然后在它们的膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常有效。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物，并与其相互作用。然后抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞活化。表达共刺激分子是专职性抗原呈递细胞的典型特征。专职性抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞其具有最广的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞、巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。树突细胞DC是白细胞类群，其将在外周组织中捕获的抗原经II类和I类MHC两种抗原呈递途径呈递给T细胞。公知树突细胞是免疫应答的强力诱导者，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。为方便起见，将树突细胞分为“未成熟”细胞和“成熟”细胞，这可用作区分两个良好表征的表型的简单方式。然而，该术语不应被解释为排除分化的所有可能中间阶段。未成熟的树突细胞的特征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常表征为这些标志物的较低表达，但是负责T细胞活化的细胞表面分子例如，I类和II类MHC、粘附分子例如，CD54和CD11以及共刺激分子例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB高表达。树突细胞的成熟是指该抗原呈递树突细胞导致T细胞引发prime的树突细胞活化状态，而由未成熟树突细胞进行的呈递则导致耐受。树突细胞的成熟主要由以下引起：被先天受体检测到的具有微生物特征的生物分子细菌DNA、病毒RNA、内毒素等、促炎性细胞因子TNF、IL-1、IFN、通过CD40L与树突细胞表面的CD40连接，以及从正在经历应激细胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可通过在体外用细胞因子培养骨髓细胞来衍生，所述细胞因子例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF和肿瘤坏死因子α。与幼稚T细胞相互作用所需的II类MHC蛋白不在非专职性抗原呈递细胞中组成型表达；其仅在非专职性抗原呈递细胞受到某些细胞因子例如IFNγ的刺激后表达。可通过用编码包含待呈递之肽的肽或蛋白质的核酸例如，编码抗原的核酸例如，RNA转导抗原呈递细胞，从而使该细胞装载MHC呈递的肽。用mRNA转染树突细胞是一种有前景的刺激强抗肿瘤免疫的抗原装载技术。术语“免疫源性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括辅助T细胞CD4+T细胞和包括溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞CTL，CD8+T细胞。T细胞属于被称为淋巴细胞的白血球群组，并且在细胞介导的免疫中发挥核心作用。可通过在其细胞表面的称为T细胞受体TCR的特殊受体的存在来将它们与其他淋巴细胞类型例如B细胞和自然杀伤细胞区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了若干种不同的T细胞亚群，每一种都具有不同的功能。辅助T细胞在免疫过程中协助其他白血球，包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。因为它们在其表面表达CD4蛋白，所以这些细胞也被称为CD4+T细胞。当在抗原呈递细胞APC表面表达的II类MHC分子将肽抗原呈递给辅助T细胞时，辅助T细胞被活化。在活化之后，它们迅速分裂，并分泌称为细胞因子的小蛋白质，这些蛋白质调节或协助主动免疫应答。细胞毒性T细胞破坏病变细胞，例如，受感染的细胞如受病毒感染的细胞和癌细胞，并且也参与移植排斥。因为它们在其表面表达CD8糖蛋白，所以这些细胞也被称为CD8+T细胞。这些细胞通过结合与I类MHC有关的抗原来识别其靶标，所述I类MHC存在于身体的几乎每个细胞表面上。大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合物存在的T细胞受体TCR。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，其由独立的T细胞受体α和βTCRα和TCRβ基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞表示T细胞的一个小亚型，其表面上具有独特的T细胞受体TCR。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。该组T细胞较αβT细胞更为不常见总T细胞的2％。所有T细胞都源自骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺，并通过细胞分裂扩增以产生大量不成熟的胸腺细胞。早期胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此归类为双阴性CD4-CD8-细胞。随着它们通过发育而发展，它们成为双阳性的胸腺细胞CD4+CD8+，并最终成熟为单阳性CD4+CD8-或CD4-CD8+胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。T细胞活化的第一信号通过T细胞受体与由另一个细胞上的主要组织相容性复合物MHC呈递的短肽结合来提供。这确保了只有具有对该肽特异的TCR的T细胞被活化。伴侣细胞通常是专职性抗原呈递细胞APC，在初次应答的情况下通常为树突细胞，但B细胞和巨噬细胞也可为重要的APC。由I类MHC分子呈递至CD8+T细胞的肽的长度为8至10个氨基酸长；由II类MHC分子呈递至CD4+T细胞的肽更长，因为II类MHC分子的结合裂口cleft末端是开放的。术语“克隆扩增”是指特定实体被扩增的过程。在本发明上下文中，该术语优选用于免疫应答的上下文中，其中淋巴细胞受到抗原的刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。根据本发明，可通过在体内将抗原或抗原肽包含进抗原呈递细胞中来在体内产生细胞毒性T淋巴细胞。所述抗原或抗原肽可体现为RNA。该抗原可被加工以产生针对MHC分子的肽伴侣，而其片段可无需进一步加工而被呈递。特别是如果这些片段可与MHC分子结合，则为后者的情况。所产生的细胞呈递目的复合物，并被自体细胞毒性T淋巴细胞识别，然后所述自体细胞毒性T淋巴细胞增殖。可通过多种方法来检测CD4+或CD8+T细胞的特异性活化。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子例如淋巴因子的产生或溶细胞活性的产生。对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测T细胞的增殖。对于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测溶细胞活性的产生。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括I类MHC分子和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号转导很重要，其中，MHC蛋白或分子结合肽，并将它们呈递用于T细胞受体的识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并且将自体抗原来自该细胞自身的肽片段和非自体抗原例如，入侵微生物的片段展示给T细胞。MHC区被分成三个亚类，I类、II类和III类。I类MHC蛋白包含α链和β2-微球蛋白不是由15号染色体编码的MHC的一部分。它们将抗原片段呈递给细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，特别是在抗原呈递细胞上，II类MHC蛋白包含α链和β链，并且它们将抗原片段呈递给辅助T细胞。III类MHC区编码另一些免疫组分，例如补体组分和一些编码细胞因子的组分。在人中，MHC区中编码细胞表面上的抗原呈递蛋白的基因是指人白细胞抗原HLA基因。然而，缩写MHC常常用于表示HLA基因产物。HLA基因包括九个所谓的典型MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。“以呈递抗原为特征的细胞”、“呈递抗原的细胞”、“由细胞呈递的抗原”、“所呈递的抗原”或类似的表述意为在MHC分子的环境中特别是I类MHC分子，呈递其表达的抗原或源自该抗原的片段例如通过加工的所述抗原的细胞，特别是病变细胞或靶细胞例如受感染的细胞或癌细胞，或者抗原呈递细胞。类似地，术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以特别是用I类MHC呈递抗原为特征之细胞的疾病。细胞的抗原呈递可通过用核酸例如编码该抗原的RNA转染细胞来实现。术语“免疫等效物”意为免疫学上等效的分子，例如，对于免疫学效应的类型如对体液免疫应答和或细胞免疫应答的诱导、所诱导的免疫反应的强度和或持续时间，或者所诱导的免疫反应的特异性表现出例如相同或基本相同的免疫学性质和或发挥相同或基本相同的免疫学效应的免疫等效的氨基酸序列。在本发明上下文中的术语“免疫效应功能”包括任何由免疫系统组分介导的，导致例如杀伤受感染细胞或癌细胞或者抑制肿瘤生长和或抑制肿瘤发生包括抑制已知肿瘤扩散和转移的功能。优选地，在本发明上下文中的免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。这样的功能包括：在辅助T细胞CD4+T细胞的情况下，在II类MHC分子的环境中通过T细胞受体识别抗原或抗原肽，释放细胞因子和或活化CD8+淋巴细胞CTL和或B细胞；以及在CTL的情况下，在I类MHC分子的环境中通过T细胞受体识别抗原或抗原肽，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解来消除在I类MHC分子的环境中呈递的细胞即，以由I类MHC呈递抗原为特征的细胞；产生细胞因子例如IFN-γ和TNF-α，以及特异性溶细胞性杀伤表达抗原的靶细胞。根据本发明，核酸优选为脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA，更优选RNA，最优选体外转录的RNAIVTRNA或合成RNA。根据本发明，核酸包括基因组DNA、eDNA、mRNA、以重组方式产生的分子和化学合成的分子。根据本发明，核酸可为单链或双链，以及线性或共价地闭合成环的分子形式。核酸可用于例如以RNA的形式引入即，转染细胞，所述RNA可通过在体外从DNA模板转录来制备。此外，RNA可在应用之前通过序列稳定化、加帽和聚腺苷酸化来修饰。核酸可包含于载体中。本文所用术语“载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体例如λ噬菌体、病毒载体例如腺病毒载体或杆状病毒载体baculoviralvector，或人造染色体载体例如细菌人造染色体BAC、酵母人造染色体YAC或P1人造染色体PAC。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒载体以及病毒载体，并且一般包含期望的编码序列以及在特定宿主生物体例如细菌、酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物中或在体外表达系统中表达该可操作连接的的编码序列所需的合适的DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增某个期望的DNA片段，并且可缺少表达期望DNA片段所需的功能序列。在本发明上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并优选完全或基本由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及经修饰的RNA，其通过添加、缺失、替换和或改变一个或更多个核苷酸而区别于天然存在的RNA。这样的改变可包括向RNA的末端或内部例如，在RNA的一个或更多个核苷酸处添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可指代类似物或天然存在RNA的类似物。根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”，其意为“信使RNA”并且涉及使用DNA作为模板生成的、编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5’非翻译区5’-UTR、蛋白或肽编码区以及3’非翻译区3’-UTR。mRNA在细胞内和体外具有有限的半衰期。优选地，使用DNA模板通过体外转录来产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，通过体外转录或化学合成来得到RNA。体外转录方法是本领域技术人员已知的。例如，存在多种市售的体外转录试剂盒。在本发明上下文中，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。然后RNA可以被翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”。术语“体外转录”涉及其中RNA特别是mRNA在无细胞系统中优选使用合适的细胞提取物来进行体外合成的过程。优选地，克隆载体适用于产生转录物。这些克隆载体一般称为转录载体，并且根据本发明术语“载体”涵盖克隆载体。根据本发明，RNA可通过对合适DNA模板的体外转录得到。调控转录的启动子可为用于任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体例子是T7、T3和SP6RNA聚合酶。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体来得到。cDNA可通过反转录RNA来得到。优选地，克隆载体用于生成转录物，其通常称为转录载体。术语“表达”在本文中以其最广的含义使用，并且包括RNA和或蛋白质或肽的生成。对于RNA，术语“表达”或“翻译”特别是指肽或蛋白质的生成。表达可为瞬时的或可为稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意为该表达与对照相比发生了改变，优选升高了，所述对照例如在未患有与某蛋白质例如肿瘤抗原异常表达或不正常表达相关之疾病的对象中的状态。表达升高是指升高至少10％，特别是至少20％，至少50％或至少100％，或更多。在一个实施方案中，表达仅在病变组织中发生，而在健康组织中表达受到抑制。术语“特异性表达”意为蛋白质基本仅在特定的组织或器官中表达。例如，肿瘤抗原特异性地在胃黏膜中表达，意为所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，而在其他组织中不表达，或者在其他组织或器官类型中未表达至显著程度。因此，仅在胃黏膜细胞中表达并以显著较低的程度在任何其他组织例如睾丸表达的蛋白质是在胃黏膜细胞中特异性表达的。在一些实施方案中，肿瘤抗原还可在正常条件在多于一种组织类型或器官中特异性表达，例如，在2个或3个组织类型或器官中，但是优选不超过3个不同的组织或器官类型。在这种情况下，则为肿瘤抗原在这些器官中特异性表达的。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下在肺和胃中以优选大致相等的程度表达，则该肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。根据本发明，术语“翻译”涉及在细胞的核糖体内的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列组装以形成蛋白质或肽。根据本发明，术语“RNA编码”意为，如果处于合适的环境中，优选在细胞内，例如在抗原呈递细胞内，特别是在树突细胞内，RNA可以被表达以产生其编码的蛋白质或肽。根据本发明，可以根据需要对RNA的稳定性和翻译效率进行调节。根据本发明，在RNA的上下文中所用的术语“修饰”包括对RNA进行非天然地存在于所述RNA中的任何修饰。在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。这样的未加帽的5’-三磷酸的去除可通过用磷酸酶处理RNA来实现。根据本发明，RNA可具有经修饰的核糖核苷酸以提高其稳定性和或降低其细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，胞苷部分地或完全地优选完全地被5-甲基胞苷所取代。替选地或另外地，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，尿苷部分地或完全地优选完全地被假尿苷所取代。在一个实施方案中，术语“修饰”涉及给RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指在mRNA分子5’端存在的帽结构，并且一般由经不常见的5’-5’三磷酸键与mRNA连接的鸟核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。术语“常规的5’-帽”是指天然存在的RNA5’-帽，优选7-甲基鸟苷帽m7G。在本发明上下文中，术语“5’-帽”包括5′-帽类似物，其与RNA帽结构类似并且当优选在体内和或在细胞中连接在RNA上时，经修饰后其具有使RNA稳定和或增强RNA翻译的能力。优选地，RNA的5’末端包含具有以下通式的帽结构：其中，R1和R2独立地为羟基或甲氧基，并且W-、X-和Y-独立地为氧、硫、硒或BH3。在一个优选实施方案中，R1和R2是羟基，并且W-、X-和Y-是氧。在另一个优选实施方案中，R1和R2之一优选R1是羟基，而另一个是甲氧基，并且W-、X-和Y-是氧。在另一个优选实施方案中，R1和R2是羟基，并且W-、X-和Y-之一优选X-是硫、硒或BH3，优选是硫，而其他的是氧。在另一个优选实施方案中，R1和R2之一优选R2是羟基，而另一个是甲氧基，以及W-、X-和Y-之一优选X-是硫、硒或BH3，优选是硫，而其他的是氧。在上式中，右手边的核苷酸通过其3’基团与RNA链连接。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过在存在所述5’-帽或5’-帽类似物的情况下对DNA模板进行体外转录来实现，其中所述5’-帽通过共转录的方式被包含进入所产生的RNA链中，或者RNA可通过例如体外转录来产生，并且可使用加帽酶cappingenzyme例如痘苗病毒加帽酶在转录后将5’-帽连接至RNA。RNA可包含进一步的修饰。例如，在本发明中使用的RNA的进一步修饰可为延长或截短天然存在的多腺甘酸polyA尾，或者改变5’-或3’-非翻译区UTR，例如，引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如，用一个或更多个拷贝优选两个拷贝的来源于球蛋白例如，α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，优选β-球蛋白，更优选人β-球蛋白基因的3’-UTR交换现有的3’-UTR或将其插入。具有多A序列未被遮蔽的RNA比具有多A序列被遮蔽的RNA更高效地翻译。术语“多A尾”或“多A序列”涉及通常位于RNA分子的3’端的腺苷酸A残基序列，“未遮蔽多A序列”意为，RNA分子3’末端的多A序列以多A序列的A结尾，并且在位于3’末端的A后即，多A序列的下游没有其他核苷酸。此外，约120个碱基对的长多A序列导致RNA的最佳转录稳定性和翻译效率。因此，为了提高根据本发明所使用的RNA的稳定性和或表达，可修饰RNA使其以与多A序列结合的形式存在，所述多A序列具有优选为10至500个，更优选30至300个，甚至更优选65至200个，尤其是100至150个腺甘酸残基的长度。在一个尤其优选的实施方案中，多A序列具有约120个腺苷酸残基的长度。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和或表达，该多A序列可为未遮蔽的。此外，将3’非翻译区UTR并入RNA分子的3’非翻译区可导致增强的翻译效率。通过引入两个或更多个这样的3’非翻译区可实现协同效应。3’非翻译区可与它们被引入的RNA同源或异源。在一个特定实施方案中，3’非翻译区来源于人β-球蛋白基因。上述修饰的组合即多A序列的并入、多A序列的解掩蔽以及一个或更多个3’非翻译区的引入对RNA的稳定性以及翻译效率的提高具有协同影响。为了提高根据本发明使用的RNA的表达，其可在编码区即，编码所表达的肽或蛋白质的序列中进行修饰优选不改变所表达的肽或蛋白质序列，从而提高GC含量，以提高mRNA稳定性，并且进行密码子优化，并从而增强细胞中的翻译。术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的活性、量或数目的一半所需的时间段。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可预期的是，半衰期长的RNA将进行延长时间的表达。当然，如果根据本发明期望降低RNA的稳定性和或翻译效率，则可修饰RNA以干扰上述提高RNA的稳定性和或翻译效率的元件的功能。本文所述的纳米颗粒的平均“直径”或“尺寸”一般是根据已建立的方法制备的纳米颗粒的“设计尺寸”或预期尺寸。尺寸可为直接测量的大小，例如平均直径或最大直径，或可通过间接测定来确定，例如过滤筛选测定。粒径的直接测量通常通过动态光散射来进行。通常来说，来自动态光散射测量的结果以Z平均平均尺寸的量度和多分散性指数PI或PDI多分散性的量度来表示。由于在制造过程中会产生小的尺寸变化，所以所述测量的高至40％的变化是可接受的，并且视为落在所述尺寸范围内。或者，尺寸可通过过滤筛选测定来确定。例如，如果至少97％的颗粒通过所述尺寸的“筛型”过滤器，则颗粒制备物小于所述尺寸。优选地，如果递送至即，转染进细胞，特别是存在于体内的细胞例如树突细胞，则RNA表达其编码的蛋白质、肽或抗原。术语“转染”涉及将核酸特别是RNA引入细胞。为了本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞例如抗原呈递细胞中，或由这样的细胞摄取核酸，其中所述细胞可存在于对象例如患者中。根据本发明，优选的是，将编码抗原的RNA引入细胞导致表达所述抗原。根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含两个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个，并且多至优选8个、10个、20个、30个、40个或50个，特别是100个通过肽键共价连接的氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，优选具有超过100个氨基酸残基的肽，但是一般来说，术语“肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文中可互换使用。术语“细胞”优选是完整细胞，即，未曾释放其正常胞内组分例如酶、细胞器或遗传物质、具有完整膜的细胞。完整细胞优选是有活力的细胞viablecell，即，能够进行其正常的代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可用外源核酸转染的任何细胞。根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞例如，大肠杆菌或真核细胞例如，树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞。外源核酸可以以下方式在细胞内找到：i本身游离地分散，ii并入重组载体中，或iii整合进宿主细胞基因组DNA或线粒体DNA中。尤其优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。该细胞可来源于大量组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。本文所用术语“纳米颗粒”是指具有使颗粒适于全身性施用特别是肠胃外施用的直径的任何颗粒，特别是通常为小于1000纳米nm的核酸。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于600nm的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于400nm的直径。本文所用的术语“纳米颗粒制剂”或类似术语是指包含至少一种纳米颗粒的任何物质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是均匀的纳米颗粒集合。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是分散系或乳剂。一般来说，当组合至少两种不混溶的材料时形成分散系或乳剂。术语“脂质体复合物”或“RNA脂质体复合物”是指脂质与核酸例如RNA的复合物。当常常还包含中性“辅助”脂质的阳离子脂质体与核酸混合时，脂质体复合物自发地形成。ζ电势Zetapotential是在胶体系统中的电动电位electrokineticpotential的科学术语。从理论角度来看，ζ电势是在界面双层中的滑动面位置相对于远离所述界面的体相流体bulkfluid中的点的电势。换言之，ζ电势是分散介质与结合至分散的颗粒的流体的静止层之间的电势差。ζ电势广泛用于对处于双层的电荷量级进行定量。ζ电势可使用理论模型和实验确定的电泳迁移率或动态电泳迁移率测量结果来计算。电动现象和电声现象是计算ζ电势的常用数据源。电泳可用于评估颗粒的ζ电势。在实践中，分散系的ζ电势可通过横跨分散系施加电场来测量。分散系中的具有ζ电势的颗粒将以和ζ电势量级成比例的速度向相反电荷的电极迁移。该速度可使用激光多普勒测试仪LaserDopplerAnemometer的技术来测量。由这些移动的颗粒引起的入射激光束的频移或相移可测量为颗粒的迁移率，并且可通过输入分散剂粘度和介电常数，并应用Smoluchowski理论来将该迁移率转换成ζ电势。电泳速度与电泳迁移率成比例，所述电泳迁移率为可测量参数。存在若干种理论将电泳迁移率与ζ电势相关联。可使用合适的系统例如Nicomp380ZLS系统来确定ζ电势。这样的系统常常测量液体混悬系中的电泳迁移率和带电颗粒稳定性。这些值是混悬系中的颗粒施加的斥力的预测，并且与胶体系统的稳定性直接相关。ζ电势可根据下述方案来测量。电荷是引起物质在接近其他带电物质时受力的物理性质。电荷分为两种类型，称为正电荷和负电荷。其电荷具有相同符号的带电颗粒彼此排斥，而其电荷具有不同符号的颗粒彼此吸引。宏观物体例如颗粒的电荷是组成该颗粒的电荷的总和。本文所述的纳米颗粒可具有相等数量的正电荷和负电荷，在这种情况下，它们的电荷彼此抵消，得到为零的净电荷，从而使得所述纳米颗粒呈中性。净电荷是整个物体例如化合物上的电荷。具有总净正电的离子是阳离子，而具有总净负电的离子是阴离子。可通过根据阳离子脂质与RNA的+-电荷比调节正电荷比负电荷并使RNA与阳离子脂质混合来形成本文所述的纳米颗粒。本文所述的纳米颗粒中的阳离子脂质与RNA的+-电荷比可通过以下方程来计算。+-电荷比＝[阳离子脂质的量mol＊阳离子脂质中的正电荷总数]∶[RNA的量mol＊RNA中的负电荷总数]。RNA量和阳离子脂质的量可容易地被本领域技术人员鉴于纳米颗粒制备时的载量而确定。根据一个实施方案，适于本发明的纳米颗粒中正电荷与负电荷的比率是使其可具有总负电荷或为中性或接近中性的总电荷。如果本发明提及电荷，例如正电荷、负电荷或中性电荷，或者阳离子化合物、负离子化合物或中性化合物，则其一般意为所提到的电荷存在于选定的pH例如生理pH下。例如，术语“阳离子脂质”意为在选定pH例如生理pH下带有净正电荷的脂质。术语“中性脂质”意为在选定pH例如生理pH下不带净正电荷或负电荷，并且可以以不带电或中性的两亲离子形式存在的脂质。本文中的“生理pH”意为约7.5的pH。预期于本发明的纳米颗粒载剂carrior例如脂质载剂包括RNA可与之结合例如，通过与RNA形成复合物或形成封闭或包封RNA的囊泡的任何物质或载体vector。这可导致RNA的稳定性相比于裸露的RNA提高。特别地，可提高RNA在血液中的稳定性。阳离子脂质、阳离子聚合物及其他带正电的物质可与带负电的核酸形成复合物。这些阳离子分子可用于与核酸复合，从而分别形成例如所谓的脂质体复合物或聚合物复合物polyplex，并且已示出这些复合物将核酸递送至细胞中。纳米颗粒RNA制备物可通过多种方案并从多种RNA复合化合物complexingcompound中得到。脂质、聚合物、寡聚物或两亲分子是典型的复合剂。在一个实施方案中，复合化合物包含至少一种选自以下的试剂：精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸或组蛋白。根据本发明，精蛋白可用作阳离子载剂。术语“精蛋白”是指具有相当低分子量、富精氨酸并且尤其被发现在多种动物如鱼的精细胞中代替体组蛋白而与DNA结合的多种强碱性蛋白质的任一种。特别地，术语“精蛋白”是指在鱼精子中发现的蛋白质，其为强碱性、可溶于水、不因加热而聚结并且水解后主要产生精氨酸。它们以纯的形式用于胰岛素的长效制剂，并且用于中和肝素的抗凝效应。根据本发明，本文所用术语“精蛋白”意为包含从天然来源或生物来源得到或衍生的任何精蛋白氨基酸序列，包括其片段和所述氨基酸序列的多聚体multimeric形式，或该形式的片段。此外，该术语涵盖了人造的并且为特定目的特别设计的合成的多肽，并且其无法从天然来源或生物来源中分离。根据本发明使用的精蛋白可为硫酸盐化的精蛋白或精蛋白盐酸盐。在一个优选实施方案中，用于生产本文所述的纳米颗粒的精蛋白来源是精蛋白5000，其包含在等渗盐溶液中的高于10mgml5000肝素-中和单位每ml的精蛋白。脂质体是微小的脂质囊泡，其常常具有一个或更多个的囊泡形成性脂质例如磷脂的双层，并且能够包封药物。在本发明的上下文中可使用的不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡MLV、小单层囊泡SUV、大单层囊泡LUV、空间稳定的脂质体SSL、多泡囊泡multivesicularvesicles，MV和大多泡囊泡largemultivesicularvesicle，LMV，以及本领域已知的其他双层形式。脂质体的尺寸和层数lamellarity将取决于制备方法，并且待使用囊泡类型的选择将取决于优选的施用模式。存在若干种其他形式的其中脂质可存在于水性介质中的超分子组织结构，包括层状相、六方相和反六方相、立方相、胶束、由单层monolayer构成的反胶束。这些相还可与DNA或RNA组合得到，并且其与RNA和DNA的相互作用可对相的状态产生很大影响。所述的相可存在于本发明的纳米颗粒RNA制剂中。对于由RNA和脂质体形成RNA脂质体复合物，可使用任何合适的形成脂质体的方法，只要其提供预期的RNA脂质体复合物即可。脂质体可使用标准方法来形成，例如，逆相蒸发法REV、乙醇注射法、脱水-再水化法DRV、声波法或其他合适的方法。在形成脂质体后，该脂质体可经筛选以得到具有基本均匀尺寸范围的脂质体群。形成双层的脂质通常具有两条烃链特别是酰基链和头部基团，所述头部基团可为极性或非极性。形成双层的脂质由天然存在的脂质或合成来源的脂质构成，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸phosphatideacid、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中所述两条烃链的长度通常为约14至22个碳原子长，并且具有不同的不饱和程度。用于本发明组合物的另一些合适的脂质包括糖脂和甾醇，例如也可用于脂质体中的胆固醇及其多种类似物。阳离子脂质通常具有亲脂部分，例如甾醇链、酰基链或二酰基链，并且具有总净正电荷。脂质的头部基团通常带正电。阳离子脂质优选带有1价至10价的正电，更优选1价至3价的正电，更优选1价的正电。阳离子脂质的实例包括但不限于：1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷DOTMA；二甲基双十八烷基铵DDAB；1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP；1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷DODAP；1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵DODAC、1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1，3-二甲基羟乙基铵DMRIE和2，3-二油酰氧基-N-[2精胺甲酰胺乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵2，3-dioleoyloxy-N-[2sperminecarboxamideethyl]-N，N-dimethyl-1-propanamiumtrifluoroacetate，DOSPA。优选为DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选为DOTMA。此外，出于结构稳定性等的考虑，本文所述的纳米颗粒优选还包含中性脂质。所述中性脂质可从RNA-脂质复合物的递送效率的角度来适当地选择。中性脂质的实例包括但不限于：1，2-二-9Z-十八酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DOPE、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱DOPC、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂sphingoemyelin、脑磷脂、甾醇和脑苷脂。优选为DOPE和或DOPC。最优选为DOPE。在其中阳离子脂质体包含阳离子脂质和中性脂质二者的情况下，可从脂质体的稳定性等角度来适当确定阳离子脂质与中性脂质的摩尔比。根据一个实施方案，本文所述的纳米颗粒可包含磷脂。所述磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的实例包括但不限于三种类型的脂质：i两亲来源的PC的天然形式、部分氢化的形式或完全氢化的形式、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、鞘磷脂SM；ii带负电的磷脂：其包括例如磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI、磷脂酸PA、磷脂酰甘油PG、二棕榈酰基PGdipalmipoylPG、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG；其中缀合物使两亲离子型磷脂带负电的合成衍生物，例如甲氧基-聚乙烯、甘醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺mPEG-DSPE的情况；以及iii阳离子磷脂，其包括例如其磷酸单酯被O-甲基化以形成阳离子脂质的磷脂酰胆碱或鞘磷脂。RNA与脂质载剂的结合可通过例如RNA填充载剂的孔隙空间，以使载剂以物理的方式限制RNA来进行，或者通过共价结合、离子结合或氢键结合来进行，或者通过非特异性键吸附来进行。无论是哪种结合模式，RNA都必须保持其治疗性能，即抗原编码性能。“多分散性指数PolydispersityIndex，PI”是在颗粒混合物中单个颗粒例如脂质体的均匀或不均匀的尺寸分布的量度，其表示混合物中颗粒分布的宽度。PI可例如如本文所述来确定。本文所用术语“二价阳离子”旨在意为带正电的具有正2电荷的元素、原子或分子。该术语包括金属离子例如Ca2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Ni2+和或Cu2+。根据本发明的二价阳离子还包括这些离子的盐形式。二价盐形式的具体实例包括CaCl2、ZnCl2、MnSO4、MnCl2和MgCl2以及上述示例性二价阳离子与例如氯离子Cl、硫酸根SO4、乙酸根和或磷酸根的盐形式的其他组合。除以上举例的那些以外的二价阳离子和盐形式是本领域公知的，并且当其用于本文时被涵盖于该术语的含义中。术语“一价离子”包括带有正1电荷的阳离子。通常，该术语包括碱金属例如锂、钠、钾、铷和铯。术语“部分portion”是指级分fraction。对于特定结构例如氨基酸序列或蛋白质，术语其“部分”可表示所述结构的连续或不连续的级分。优选地，氨基酸序列的一部分包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％，优选至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％的氨基酸。优选地，如果所述部分是不连续级分，则所述不连续级分由结构的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个部分构成，每个部分是结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续级分可由所述氨基酸序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个部分，优选不超过4个部分构成，其中每个部分优选包含氨基酸序列的至少5个连续氨基酸，至少10个连续氨基酸，优选至少20个连续氨基酸，优选至少30个连续氨基酸。术语“部分”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续的元件。例如，结构例如氨基酸序列或蛋白质的一部分是指所述结构的连续元件。结构的部分、一部分或片段优选包含所述结构的一个或更多个功能属性。例如，表位、肽或蛋白质的部分、一部分或片段优选在免疫学上与衍生其的表位、肽或蛋白质等价。在本发明上下文中，结构例如氨基酸序列的“一部分”优选包含全部结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％，优选由其组成。本文使用的“降低”或“抑制”意为引起总体水平降低的能力，优选降低5％或更高、10％或更高、20％或更高，更优选50％或更高，并且最优选75％或更高。术语“抑制”或类似的短语包括完全抑制或基本上完全抑制，即，降低至零或基本上降低至零。术语例如“升高”或“增强”优选是指升高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。本文描述的试剂、组合物和方法可用于治疗患病例如，以出现表达抗原并呈递抗原肽的病变细胞为特征的疾病的对象。可治疗和或预防的疾病的实例涵盖所有表达本文所述抗原之一的疾病。特别优选的疾病是感染性疾病例如病毒性疾病和癌症疾病。本文描述的试剂、组合物和方法还可用于免疫或疫苗接种，以预防本文描述的疾病。根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括感染性疾病和癌症疾病，特别是本文描述的感染性疾病和疾病的那些形式。根据本发明的待治疗的疾病优选为涉及抗原的疾病。根据本发明，“涉及抗原的疾病”或类似的表述意为，抗原在病变组织或器官的细胞中表达。病变组织或器官的细胞中的表达可相比于健康组织或器官的状态升高。在一个实施方案中，表达仅在病变组织中发生，而在健康组织中表达受到抑制。根据本发明，涉及抗原的疾病包括感染性疾病和癌症疾病，其中疾病相关抗原优选分别为感染原的抗原和肿瘤抗原。优选地，涉及抗原的疾病优选是涉及表达抗原并在MHC分子特别是I类MHC的环境下呈递该抗原的细胞的疾病。术语“正常组织”或“正常状态”是指在健康对象中的健康组织或状态，即，非病理状态，其中“健康”优选意为未受感染的或未患癌症的。癌或癌症医学术语为恶性肿瘤是一类这样的疾病，其中一群细胞表现出不受控制的生长分裂超出了正常限制、侵入入侵并破坏相邻的组织，并且有时转移通过淋巴或血液扩散至身体的其他部位。癌的这三个危害属性使其与自我限制的并且不侵入或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌形成肿瘤，即，通过细胞称为赘生性细胞或肿瘤细胞的异常生长而形成的肿胀或病变，但是一些像白血病不是这样。根据本发明，术语“癌”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌症、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉ENT癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌，及其转移。其实例是，肺癌、乳房癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌，或上述癌种类或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌还包括癌转移。能够用本发明的纳米颗粒和药物组合物治疗的癌症的实例包括：恶性黑色素瘤、所有种类的上皮瘤结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌等、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、神经胶质瘤等。恶性黑色素瘤是严重的皮肤癌类型。其是由于被称为黑色素细胞的色素细胞不受控制的生长导致。根据本发明，“上皮癌”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。该组占据了最常见的癌，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。淋巴瘤和白血病是源自造血血液形成细胞的恶性肿瘤。肉瘤是发源于胚胎中胚层发育成的一些组织之一的转化细胞的癌。因此，肉瘤包括骨肿瘤、软骨肿瘤、脂肪肿瘤、肌肉肿瘤、血管肿瘤和造血组织肿瘤。母细胞瘤blastictumor或胚细胞瘤是与未成熟组织或胚胎组织类似的肿瘤通常是恶性的。这些肿瘤中的多数常见于儿童。神经胶质瘤是始于脑或脊椎的肿瘤类型。因为其发源于胶质细胞，所以被称为神经胶质瘤。神经胶质瘤最常见的部位是大脑。“转移”意为癌细胞从其原发部位扩散至身体的另一个部分。转移的形成是非常复杂的过程，并且依赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离、对胞外基质的侵入、穿透内皮基底膜进入体腔和血管，然后经血液转运后浸润靶器官。最后，新肿瘤即，继发肿瘤或转移肿瘤依靠血管生成而在靶位点生长。即使在移除原发肿瘤后，肿瘤转移也常会发生，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并发展转移能力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”是指“远端转移distantmetastasis”，涉及远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。能够用本发明的纳米颗粒和药物组合物治疗的感染性疾病的实例包括：病毒感染性疾病，例如AIDSHIV、甲肝、乙肝或丙肝、疱疹带状疱疹水痘、德国麻疹风疹病毒、黄热病、登革热等、黄病毒、流感病毒、出血性感染性疾病马尔堡病毒或埃博拉病毒；细菌感染性疾病，例如军团菌病Legionnaire′sdisease军团菌，Legionella、胃溃疡螺杆菌，Helicobacter、霍乱弧菌，Vibrio、由大肠杆菌、葡萄球菌Staphylococci、沙门氏菌Salmonella或链球菌Streptococci破伤风引起的感染；由原生动物病原体引起的感染，例如疟疾、昏睡病、利什曼病、弓形体病，即由疟原虫Plasmodium、锥体虫Trypanosoma、利什曼虫Leishmania和弓形虫引起的感染；或真菌感染，其由例如，新型隐球菌Cryptococcusneoformans、荚膜组织胞浆菌Histoplasmacapsulatum、粗球孢子菌Coccidioidesimmitis、皮炎芽生菌Blastomycesdermatitidis或白色念珠菌Candidaalbicans引起。“治疗”意为将本文所述的化合物或组合物施用于对象以预防或消除疾病，包括：使对象中的肿瘤的尺寸减小或肿瘤数目降低；阻滞或延缓对象中的疾病；抑制或减缓对象中的新疾病的发生；降低目前患有疾病或曾经患过疾病的对象中症状和或复发的频率或严重程度；和或延长即增加对象的寿命。特别地，术语“疾病的治疗”包括疾病或其症状的治愈；缩短持续时间；减轻、预防、减缓或抑制疾病或其症状的发展或恶化；或预防或延缓疾病或其症状的发作。术语“免疫治疗”是指涉及活化特异性免疫应答和或一种或更多种免疫效应功能的治疗。免疫治疗可使用多种技术的任一种进行，在免疫治疗中，本文提供的药剂发挥从患者中去除表达抗原的细胞的功能。这样的去除可通过增强或诱导患者中对抗原或表达抗原之细胞的特异性免疫应答和或一种或更多种免疫效应功能来进行。在本发明上下文中，术语例如“保护”、“预防”、“预防性的”、“防止性的”或“保护性的”涉及指在对象中预防或治疗或预防并治疗疾病的发生和或蔓延，并且尤其是指将对象发生疾病的可能性降到最低，或指延迟疾病的发生。例如，处于癌症风险中的人将是预防癌症的治疗的候选人。免疫治疗的预防性施用，例如本发明组合物的预防性施用，优选保护接受者免于疾病的发生。免疫治疗的治疗性施用，例如本发明组合物的治疗性施用，可导致抑制该疾病的发展生长。这包括延缓疾病的发展生长，特别是破坏疾病的发展，这优选导致去除该疾病。“有风险”意为对象被识别为与普通群体相比具有高于正常发病尤其是癌症的几率。此外，已患过或目前患有疾病特别是癌症的对象是具有增加的发病风险的对象，因为这样的对象可继续发病。目前患有或曾患过癌症的对象还具有增加的癌转移风险。本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规的治疗方案联合使用，所述常规的治疗方案例如，手术、放疗、化疗和或骨髓移植自体移植、同系移植、异系移植或非亲属移植。癌症治疗是特别需要组合策略的领域，因为，通常两种、三种、四种或甚至更多种癌症药物疗法的组合作用产生比单治疗方法的作用强得多的协同效应。因此，在本发明的另一个实施方案中，使用基于免疫机制或疫苗接种机制例如本发明的方法和药物组合物的癌症治疗可有效地与多种靶向类似或其他特异性机制的其他药物和或方法组合。其中，例如与常规肿瘤疗法、多表位策略、额外的免疫治疗以及靶向血管生成或凋亡的治疗方法的组合例如综述参见，Andersen等，2008：Cancertreatment：thecombinationofvaccinationwithothertherapies.CancerImmunologyImmunotherapy，5711：1735-1743.。对不同的药剂进行顺序施用可在不同检查点checkpoint抑制癌细胞生长，而其他药剂可例如抑制新血管生成、恶性细胞的存活或转移，可能将癌症转化成慢性疾病。以下列举提供了可与本发明组合的抗癌药物和治疗的一些非限制性实例1.化疗化疗是用于多种癌症类型的标准治疗。最常见的化疗药剂起到杀伤快速分裂之细胞的作用，快速分裂是癌细胞的主要属性之一。因此，与影响细胞分裂或DNA合成的常规化疗药物例如烷基化药剂、抗代谢药物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂以及其他抗肿瘤药剂的组合可通过清除抑制细胞、重启免疫系统，通过使肿瘤细胞更易受到免疫介导的杀伤或通过额外地对免疫系统细胞的激活，来显著改善本发明的治疗效果。在许多研究中证实了化疗药物和基于疫苗接种的免疫治疗药物的协同抗癌作用参见例如，Quoix等，2011：TherapeuticvaccinationwithTG4010andfirst-linechemotherapyinadvancednon-small-celllungcancer：acontrolledphase2Btrial.LancetOncol.1212：1125-33.；还参见Liseth等，2010：Combinationofintensivechemotherapyandanticancervaccinesinthetreatmentofhumanmalignancies：thehematologicalexperience.JBiomedBiotechnol.2010：6920979；还参见Hirooka等，2009：Acombinationtherapyofgemcitabinewithimmunotherapyforpatientswithinoperablelocallyadvancedpancreaticcancer.Pancreas383：e69-74。有数百种可用的化疗药物基本适用于组合治疗。可与本发明组合的化疗药物的一些非限制性实例有：卡铂Paraplatin、顺铂Platinol，Platinol-AQ、环磷酰胺Cytoxan，Neosar、多西他赛Taxotere、阿霉素Adriamycin、埃罗替尼Tarceva、依托泊苷VePesid、氟尿嘧啶5-FU、吉西他滨Gemzar、甲磺酸伊马替尼Gleevec、伊立替康Camptosar、甲氨蝶呤Folex，Mexate，Amethopterin、紫杉醇Taxol，Abraxane、索拉菲尼Nexavar、舒尼替尼Sutent、拓扑替康Hycamtin、长春新碱Oncovin，VincasarPFS和长春花碱Velban。2.手术癌症手术是去除肿瘤的手术，其仍然是癌症治疗的基础。手术可与其他癌症治疗组合，以去除任何遗留的肿瘤细胞。使手术方法与随后的免疫治疗相组合是一种已被验证无数次的有前景的方法。3.辐射放疗仍然是癌症治疗的重要组成部分，所有癌症患者中约50％在其病程中接受放疗。放疗的主要目的是使癌细胞丧失其增殖细胞分裂潜能。用于治疗癌症的辐射类型是光子辐射x射线和γ射线和粒子辐射电子束、质子束和中子束。有两种方法将辐射递送至癌症部位。通过将高能射线光子辐射、质子辐射或粒子辐射瞄准aim肿瘤部位来从身体外面递送外部束辐射。通过将密封在导管或胶囊seed中的辐射源直接导入肿瘤位点来从身体内部递送内部照射或短距离放射治疗。适于与本发明组合的放疗技术例如，分级fractionation以分级的方案递送放疗，例如，持续数周给予1.5Gy至3Gy的每日分级剂量、3D适形放疗3DCRT；将辐射递送至全部体肿瘤体积、强度调制放疗IMRT；计算机控制的多种辐射束的强度调制、图像引导的放疗IGRT；包括放疗前进行成像以进行校正的技术，以及立体定位身体放疗SRBT，仅在一些治疗部分中递送非常高的单剂量辐射。放疗方面的综述参见Baskar等，2012：Cancerandradiationtherapy：currentadvancesandfuturedirections.Int.JMedSci.93：193-199。4.抗体抗体优选单克隆抗体通过多种机制来实现其对抗癌细胞的治疗效果。它们可在产生细胞凋亡或程序性细胞死亡方面具有直接作用。它们可阻断信号转导通路的组分例如生长因子受体，有效地阻止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可引起抗个体基因型抗体的形成。间接作用包括募集具有细胞毒性的细胞，例如单核细胞和巨噬细胞。这种类型的抗体介导的细胞杀伤称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性ADCC。抗体还结合补体，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖的细胞毒性CDC。将手术方法与免疫治疗药物或方法相组合是一种成功的方法，如在例如Gadri等，2009：Synergisticeffectofdendriticcellvaccinationandanti-CD20antibodytreatmentinthetherapyofmurinelymphoma.JImmunother.324：333-40中所证实的。以下列举提供了可与本发明组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标括号中的一些非限制性实例：阿巴伏单抗CA-125、阿昔单抗bCD41、阿德木单抗AdecatumumabEpCAM、阿夫土珠单抗CD20、培化阿珠单抗AlacizumabpegolVEGFR2、阿妥莫单抗喷替酸盐CEA、阿麦妥昔单抗AmatuximabMORAb-009、麻安莫单抗AnatumomabmafenatoxTAG-72、阿泊珠单抗HLA-DR、阿西莫单抗CEA、巴维昔单抗磷脂酰丝氨酸、贝妥莫单抗CD22、贝利木单抗BAFF、贝伐单抗VEGF-A、莫-比伐珠单抗BivatuzumabmertansineCD44v6、兰妥莫单抗BlinatumomabCD19、贝伦妥单抗-维多汀BrentuximabvedotinCD30TNFRSF8、莫-坎妥珠单抗Cantuzumabmertansin粘蛋白CanAg、拉-坎妥珠单抗CantuzumabravtansineMUC1、卡罗单抗喷地肽前列腺癌细胞、卡鲁单抗CarlumabCNTO888、卡妥索单抗EpCAMCD3、西妥昔单抗EGFR、泊西他珠单抗CitatuzumabbogatoxEpCAM、西妥木单抗CixutumumabIGF-1受体、Claudiximab紧密连接蛋白、ClivatuzumabtetraxetanMUC1、可那木单抗ConatumumabTRAIL-R2、达西珠单抗DacetuzumabCD40、达洛珠单抗Dalotuzumab类胰岛素生长因子受体I、地诺单抗RANKL、地莫单抗B-淋巴瘤细胞、DrozitumabDR5、依美昔单抗EcromeximabGD3神经节苷脂、依决洛单抗EpCAM、依洛珠单抗ElotuzumabSLAMF7、EnavatuzumabPDL192、恩司昔单抗EnsituximabNPC-1C、依帕珠单抗CD22、厄马索单抗ErtumaxomabHER2neu，CD3、埃达珠单抗Etaracizumab整合素αvβ3、法勒珠单抗Farletuzumab叶酸受体1、FBTA05CD20、FiclatuzumabSCH900105、芬妥木单抗FigitumumabIGF-1受体、Flanvotumab糖蛋白75、夫苏木单抗FresolimumabTGF-β、加利昔单抗GaliximabCD80、GanitumabIGF-I、吉妥珠单抗-奥佐米星CD33、GevokizumabIL-1β、吉瑞昔单抗Girentuximab碳酸酐酶9CA-IX、格莱木单抗-维多汀GlembatumumabvedotinGPNMB、替伊莫单抗CD20、IcrucumabVEGFR-1、伊戈伏单抗IgovomaCA-125、拉-英达西单抗IndatuximabravtansineSDC1、英妥木单抗IntetumumabCD51、伊珠单抗-奥佐米星InotuzumabozogamicinCD22、伊匹木单抗IpilimumabCD152、伊妥木单抗CD30、拉贝珠单抗LabetuzumabCEA、来沙木单抗TRAIL-R2、利韦单抗Libivirumab乙肝表面抗原、林妥珠单抗CD33、莫-洛伏珠单抗LorvotuzumabmertansineCD56、鲁卡木单抗LucatumumabCD40、鲁昔单抗CD23、马帕木单抗MapatumumabTRAIL-R1、马妥珠单抗EGFR、美泊利单抗IL-5、米拉珠单抗MilatuzumabCD74、米妥莫单抗MitumomabGD3神经节苷脂、莫加珠单抗MogamulizumabCCR4、MoxetumomabpasudotoxCD22、他那可单抗C242抗原、他那莫单抗Naptumomabestafenatox5T4、NarnatumabRON、奈昔木单抗NecitumumabEGFR、尼妥珠单抗EGFR、NivolumabIgG4、奥法木单抗CD20、OlaratumabPDGF-Rα、奥纳珠单抗Onartuzumab人散射因子受体激酶、莫奥珠单抗OportuzumabmonatoxEpCAM、奥戈伏单抗CA-125、OxelumabOX-40、帕尼单抗PanitumumabEGFR、帕曲土单抗PatritumabHER3、PemtumomaMUC1、培妥珠单抗PertuzumaHER2neu、Pintumomab腺癌抗原、普托木单抗波形蛋白、雷妥莫单抗RacotumomabN-羟乙酰神经氨酸、Radretumab纤连蛋白外结构域-B、瑞非韦鲁狂犬病毒糖蛋白、雷莫芦单抗RamucirumabVEGFR2，利妥木单抗RilotumumabHGF、利妥昔单抗CD20、罗妥木单抗RobatumumabIGF-1受体、奥马珠单抗SamalizumabCD200、西罗珠单抗SibrotuzumabFAP、司妥昔单抗SiltuximabIL-6、TabalumabBAFF、Tacatuzumabtetraxetanα-甲胎蛋白、帕-他莫单抗TaplitumomabpaptoxCD19、替妥莫单抗Tenatumomab腱生蛋白C、替妥木单抗TeprotumumabCD221、替西木单抗TicilimumabCTLA-4、替加珠单抗TigatuzumabTRAIL-R2、TNX-650IL-13、托西莫单抗CD20、曲妥珠单抗HER2neu、TRBS07GD2、曲美木单抗TremelimumabCTLA-4、西莫白介素TucotuzumabcelmoleukinEpCAM、UblituximabMS4A1、乌瑞鲁单抗Urelumab4-1BB、伏洛昔单抗Volociximab整合素α5β1、伏妥昔单抗肿瘤抗原CTAA16.88、扎芦木单抗ZalutumumabEGFR、ZanolimumabCD4。5.细胞因子、趋化因子、共刺激分子、融合蛋白本发明的另一个实施方案是，将本发明的编码抗原的药物组合物与细胞因子、趋化因子、共刺激分子和或其融合蛋白联合使用，以产生有益的免疫调节效果或肿瘤抑制效果。为了提高免疫细胞对肿瘤的浸润并促进抗原呈递细胞移动至肿瘤引流淋巴结，可使用具有C、CC、CXC和CX3C结构的多种趋化因子。一些最有前景的趋化因子是例如，CCR7及其配体CCL19和CCL21，以及CCL2、CCL3、CCL5和CCL16。其他实例有CXCR4、CXCR7和CXCL12。此外，可使用共刺激分子或调节分子，例如B7配体B7.1和B7.2。还可以使用其他细胞因子，例如特别是白细胞介素例如IL-1至IL17、干扰素例如IFNα1至IFNα8，IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17、IFNα21、IFNβ1、IFNW、IFNE1和IFNK、成血因子、TGF例如TGF-α、TGF-β以及其他TGF家族成员，最后是肿瘤坏死因子家族成员受体及其配体，以及其他刺激分子，包括但不限于：41BB、41BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR、GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、LTβR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、TroyTrade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT，以及CD95FasAPO-1、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、TNF受体相关凋亡介导蛋白TRAMP以及死亡受体-6DR6。特别地，由于其直接影响T细胞的存活和增殖，CD40CD40L和OX40OX40L是组合免疫治疗的重要靶标。综述参见Lechner等，2011：Chemokines，costimulatorymoleculesandfusionproteinsfortheimmunotherapyofsolidtumors.Immunotherapy311，1317-1340。6.细菌治疗研究人员已使用厌氧菌例如诺维氏芽孢梭菌Clostridiumnovyi来消耗贫氧肿瘤的内部。当它们接触到肿瘤的充氧界面上时，这些细菌将死亡，这意味着它们将对身体的其他部分无害。另一种策略是使用这样的厌氧细菌，其已被能够将无毒前体药物转变成毒性药物的酶转化。随着该细菌在肿瘤的坏死区和低氧区的增殖，这些酶仅在肿瘤中表达。因此，全身性施用的前体药物仅在肿瘤中被代谢成了毒性药物。这已通过非病原性厌氧梭状芽孢杆菌Clostridiumsporogene证实是有效的。7.激酶抑制剂补充癌症治疗的另一大类潜在靶标包括激酶抑制剂，因为癌细胞的生长和存活与激酶活性的解除调节密切连锁。可使用大范围的抑制剂来恢复正常的激酶活性，并因此降低肿瘤的生长。靶向的激酶的组包括：受体酪氨酸激酶，例如BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2ErbB2、IGF-IR、PDGFR-α、PDGFR-β、c-Kit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK；细胞质酪氨酸激酶，例如c-SRC、c-YES、Abl、JAK-2；丝氨酸苏氨酸激酶，例如ATM、AuroraA&B、CDK、mTOR、PKCi、PLK、b-Raf、S6K、STK11LKB1；以及脂质激酶，例如PI3K、SK1。小分子激酶抑制剂有例如PHA-739358、尼罗替尼、达沙替尼，以及PD166326、NSC743411、拉帕替尼GW-572016、卡奈替尼CI-1033、SemaxinibSU5416、瓦塔拉尼PTK787ZK222584、索坦SU11248、索拉非尼BAY43-9006和来氟米特SU101。更多信息参见例如Zhang等，2009：Targetingcancerwithsmallmoleculekinaseinhibitors.NatureReviewsCancer9，28-39。8.Toll样受体Toll样受体TLR家族的成员是先天免疫和获得性免疫之间的重要纽带，并且许多佐剂的作用依赖于TLR的活化。大量已建立的针对癌症的疫苗并入TLR的配体，用于促进疫苗应答。除了TLR2、TLR3、TLR4之外，已特别地研究了TLR7和TLR8以被动免疫治疗方法用于癌症治疗。紧密相关的TLR7和TLR8通过影响免疫细胞、肿瘤细胞和肿瘤肿瘤微环境来促进抗肿瘤应答，并且可通过核苷类似物结构来活化。所有的TLR都已被用作独立的免疫治疗或癌症疫苗佐剂，并且可协同地与本发明的制剂和方法组合。更多信息参见vanDuin等，2005：TriggeringTLRsignalinginvaccination.TrendsinImmunology，271：49-55。9.血管生成抑制剂除了靶向被肿瘤介导的逃逸机制和免疫抑制影响的免疫调节受体的治疗以外，还存在靶向肿瘤环境的治疗。血管生成抑制剂防止肿瘤存活所需的血管的广泛生长血管生成。由肿瘤细胞促进以满足其逐渐升高的营养与氧需求的血管生成例如可通过靶向不同的分子来阻断。可与本发明组合的血管生成介导分子或血管生成抑制剂的非限制性实例有：可溶性VEGFVEGF亚型VEGF121和VEGF165，受体VEGFR1、VEGFR2，以及共受体神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-21和NRP-1、血管生成素2、TSP-1和TSP-2、血管抑制素及相关分子、内皮抑素、血管形成抑制素、钙网蛋白、血小板因子-4、TIMP和CDAI、Meth-1和Meth-2、IFN-α、IFN-β和IFN-γ、CXCL10、IL-4、IL-12和IL-18、凝血酶原三环结构域2、抗凝血酶III片段、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白maspin、血管能抑素、增殖蛋白相关蛋白、网状内皮系统刺激素，以及药物如，贝伐单抗、伊曲康唑、羧胺三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、抑制血管生成的类固醇+肝素angiostaticsteroids+heparin、软骨衍生的血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、2-甲氧基雌二醇、替可加兰tecogalan、四硫钼酸盐、沙利度胺、血小板反应蛋白、催乳素αVβ3抑制剂、利诺胺、塔奎莫得tasquinimod，综述参见SchoenfeldandDranoff2011：Anti-angiogenesisimmunotherapy.HumVaccin.9：976-81。10.小分子靶向的治疗药物小分子靶向的治疗药物一般是对癌细胞内突变蛋白、过表达蛋白或其他关键蛋白之酶结构域的抑制剂。明显且非限制性实例有酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼GleevecGlivec和吉非替尼Iressa。与癌症治疗疫苗组合的靶向一些激酶的小分子例如，舒尼替尼苹果酸盐和或索拉菲尼甲苯磺酸盐的使用，在先前的专利申请US2009004213中也有描述。11.基于病毒的疫苗一些可用的或处于研发阶段的基于病毒的癌症疫苗可与本发明制剂一起用于联合治疗方法。使用这样的病毒载体的一个优点是其固有的引发免疫应答的能力，病毒感染导致的炎性反应产生免疫激活所必需的危险信号。理想的病毒载体应当是安全的，并且不应当引入抗载体的免疫应答，从而使得促进抗肿瘤特异的应答。重组病毒例如痘苗病毒、单纯性疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒adeno-associatedviruses、逆转录病毒和禽痘病毒avipoxvirus已用于动物肿瘤模型，并且基于它们的振奋人心的结果，已经开始了人临床试验。特别重要的基于病毒的疫苗是病毒样类颗粒VLP，其为包含来自病毒外壳的某些蛋白质的小颗粒。病毒样颗粒不包含来自病毒的任何遗传材料，并且不会引起感染，但是它们可构建为将肿瘤抗原呈递在其外壳上。VLP可衍生自多种病毒，例如乙肝病毒或其他病毒家族，包括细小病毒科例如腺相关病毒、逆转录病毒科例如HIV和黄病毒科例如丙肝病毒。一般综述参见Sorensen和Thompsen2007：Virus-basedimmunotherapyofcancer：whatdoweknowandwherearewegoing？APMIS11511：1177-93；针对癌症的病毒样颗粒综述在Buonaguro等，2011：Developmentsinvirus-likeparticle-basedvaccinesforinfectiousdiseasesandcancer.ExpertRevVaccines1011：1569-83；以及Guillén等，2010：Virus-likeparticlesasvaccineantigensandadjuvants：applicationtochronicdisease，cancerimmunotherapyandinfectiousdiseasepreventivestrategies.ProcediainVaccinology22，128-133.12.多表位策略多表位的使用展示了疫苗接种的有前景的结果。组合智能算法系统与快速测序技术使得能够开发肿瘤突变组tumormutanome，并且可提供能与本发明组合的用于个体化疫苗的多表位。更多信息参见2007：VaccinationofmetastaticcolorectalcancerpatientswithmatureddendriticcellsloadedwithmultiplemajorhistocompatibilitycomplexclassIpeptides.JImmunother30：762-772；还有Castle等，2012：Exploitingthemutanomefortumorvaccination.CancerRes725：1081-91。13.继承性AdoptiveT细胞转移例如，肿瘤抗原疫苗接种和T细胞转移的组合在以下文献中描述：Rapoport等，2011：CombinationimmunotherapyusingadoptiveT-celltransferandtumorantigenvaccinationonthebasisofhTERTandsurvivinafterASCTformyeloma.Blood1173：788-97。14.基于肽的靶向治疗肽可与细胞表面受体或肿瘤周围受感染的胞外基质结合。与这些肽结合的放射性核素例如RGD最终杀伤癌细胞，如果核素在细胞的邻近衰变的话。特别地，这些结合基序的寡聚体或多聚体引起了很大的兴趣，因为这可导致增强的肿瘤特异性和亲合力。非限制性实例参见Yamada2011：Peptide-basedcancervaccinetherapyforprostatecancer，bladdercancer，andmalignantglioma.NihonRinsho699：1657-61。15.其他治疗还有许多可与本发明的制剂和方法组合以产生协同效果的其他癌症治疗。治疗的非限制性实例有靶向凋亡的治疗、过热、激素治疗、端粒酶治疗、胰岛素增强治疗、基因治疗和光共动力治疗。术语“免疫”或“疫苗接种”描述因治疗性或预防性原因治疗对象的过程。术语“对象”涉及哺乳动物。例如，在本发明的上下文中，哺乳动物是人、非人灵长类、家养动物例如，犬、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等、实验动物例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈禁的动物例如，动物园中的动物。本文所用术语“动物”也包括人。术语“自体”用于描述源自同一对象的任何物质。例如，“自体移植”是指源自同一对象的组织或器官的移植。这样的方法是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。术语“异体”用于描述由多种不同的元素组成的物质。例如，将一个个体的骨髓移植到不同的个体中，这构成了异体移植。异体基因是源自非所述对象之来源的基因。本发明的药物组合物优选是无菌的，并且包含有效量的本文所述的纳米颗粒，并且任选还包含本文所讨论的其他药剂以产生期望的反应或期望的效果。本发明的药物组合物可与补充的免疫增强物质例如，一种或更多种佐剂一起施用，并且可包含一种或更多种免疫增强物质以进一步提高其效力，优选实现免疫刺激的协同效果。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。在这方面可有多种机制，根据多种佐剂的类型而不同。例如，使DC成熟的化合物例如脂多糖或CD40配体构成第一类合适的佐剂。一般地，影响“危险信号”类型之免疫系统的任何药剂LPS、GP96、dsRNA等或细胞因子例如GM-CSF可用作能够以受控的方式增强和或影响免疫应答的佐剂。CpG寡脱氧核苷酸也可任选用于该环境中，尽管如上所解释的，在某些环境下它们被认为具有副作用。特别优选的佐剂为细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFα、INF-γ、GM-CSF、LT-α，或生长因子，例如hGH。此外，已知的佐剂还有氢氧化铝、弗氏佐剂或油例如最优选ISA51。脂肽例如Pam3Cys也适于用作本发明药物组合物中的佐剂。药物组合物通常以均匀的剂型来提供，并且以本身已知的方法来制备。本发明的药物组合物可例如是溶液或混悬液的形式。本发明的药物组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载剂、稀释剂和或赋形剂，所有这些都优选为可药用的。术语“可药用”是指材料的无毒性，其不影响药物组合物的活性组分的作用。不可药用的盐可用于制备可药用盐，并包括在本发明中。这类可药用盐以非限制的方式包括由以下酸制备的那些：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。用于本发明药物组合物的合适的缓冲物质包括乙酸的盐形式、柠檬酸的盐形式、硼酸的盐形式和磷酸的盐形式。用于本发明药物组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。可注射制剂可包含可药用的赋形剂例如乳酸林格液。术语“载剂”是指天然性质naturalnature或合成性质的有机或无机组分，其与活性组分联用从而促进、增强或得以施用。根据本发明，术语“载剂”还包括一种或更多种适于施用于患者的相容性固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可用于肠胃外施用的载剂物质例如无菌水、林格液、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚烷撑乙二醇polyalkyleneglycol、氢化的萘类，以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯乙交酯共聚物或聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物。当用于本文中时，术语“赋形剂”旨在表示可存在于本发明药物组合物中的所有物质，并且其不是活性成分，例如载剂、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。本文描述的药剂和组合物可经任意常规途径施用，例如通过肠胃外施用，包括通过注射或输注施用。施用优选是肠胃外施用，例如静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用或肌内施用。术语“肠胃外施用”是指以不通过消化道的方式施用，例如静脉内注射或肌肉内注射。全身性施用是一种施用途径，其为肠内施用即，涉及通过胃肠道吸收的施用或为肠胃外施用。适合肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌的水性制备物或非水性制备物，其优选是与接受者的血液等渗的。相容的载剂和溶剂的实例有林格液和等渗氯化钠溶液。此外，通常无菌的混合油也可用作溶液介质或混悬液介质。本文所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与其他剂量一起实现期望的反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选涉及对病程的抑制。这包括减缓疾病的发展，以及特别地，干扰或逆转疾病的进程。在疾病或病症的治疗中，期望的反应还可为延缓或阻止所述疾病或所述病症的发生。本文所述药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数包括年龄、生理状态、体型和体重、治疗的持续时间、所伴随的治疗类型如果存在、特定的施用途径以及类似因素。因此，本文所述的药剂的施用剂量可取决于多种这样的参数。在患者中用起始剂量产生的反应不够的情况下，可使用更高剂量或通过不同的、更局部的施用途径有效实现更高的剂量。通过如下的附图和实施例详细描述了本发明，所述附图和实施例仅用于举例说明的目的，并且不旨在限制。基于所述描述和实施例，本领域技术人员可获得同样包括于本发明中的另一些实施方案。实施例本文所使用的技术和方法通过本身已知的方式以及例如在Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版1989ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y所描述的方式在本文中描述或实施。除非另有说明，否则所有方法包括试剂盒和试剂的使用都根据制造商的说明书来实施。实施例1：材料与方法脂质体的制备脂质体的制造通过不同方案来进行。“膜法”或“乙醇注射”被用于脂质体的制备。对于膜法，将脂质溶解在氯仿中，并将合适的量装入圆底烧瓶中。在旋转蒸发仪中蒸发有机溶剂，通过轻轻摇动烧瓶用水或缓冲剂赋形剂溶液重构该干燥的膜，通常，选择5mM的总脂质浓度。对于乙醇注射，将脂质以合适的摩尔比溶解于乙醇中，使总浓度为100mM至400mM。在搅拌下将乙醇溶液注入水中或缓冲剂赋形剂的水性溶液中。通过跨不同孔径50nm至400nm的聚碳酸酯膜的挤出来调节脂质体的尺寸，和或通过市售的孔径为220nm至450nm的无菌过滤器对其进行过滤，或者可使用临床用途的具有其他孔径1μm至5μm的过滤器Sartorius，Germany，Millipore，Schwalbach，Germany。脂质在水相中的终浓度为5mM至25mM。通过HPLC分析来控制脂质组分。通过动态光散射来测定粒径和ζ电势。脂质体复合物的形成通过不同方案来进行脂质体复合物的形成。详细的步骤在各实验中给出。对于一些实验，用在水中或在缓冲剂或赋形剂的存在下的脂质体溶液直接孵育RNA溶液。脂质体复合物还可通过将在乙醇中的脂质体溶液与在水中或水性缓冲剂赋形剂溶液中的RNA溶液混合来形成。所选的制备方案取决于期望的颗粒特性和生物学应用，并且其将在各实验中进行进一步描述。PCS测量粒径和ζ电势的测量在380ZLS亚微细粒ζ电势分析仪PSSNicomp，SantaBarbara，CA上进行。通过光子关联光谱PCS以90°的散射角、2分钟的平衡时间和15分钟的运行时间来测定尺寸。使用强度加权的Gaussian分析来进行自相关，其给出关于大部分群体bulkpopulation的平均直径和多分散性指数PI的信息。ζ电势使用5Vcm的电场强度、0.4cm的电极间距在水中测量ζ电势。使用Helmholtz-Smoluchowski方程将静电迁移率转化成ζ电势。所有的测量在23℃的温度下进行。场流分级Field-Flow-Fractionation使用配备有长通道275mm长和三角MALS光散射检测仪miniDAWNTREOSWyattTechnologie，Dernbach，Germany的Eclipse3+系统，使用下面的硬件参数来进行不对称流FFFAF4：膜：10kD再生纤维素MicrodynNadir，Wiesbaden，Germany间隔件：250μm间隔件宽21.5mm溶剂：10mMNaNO3检测器流：1.0mL分钟聚焦流：1.5mL分钟注入流：0.2mL分钟横向流梯度：4mL分钟固定15分钟，然后在20分钟内4mL分钟至0.1mL分钟。动物C57BL6小鼠和BALBc小鼠来自Jackson实验室。在整个实验中使用8至10周龄雌性匹配动物。细胞和细胞系B16-OVA是表达鸡卵白蛋白基因OVA的B16-F10黑色素瘤细胞系。在IL-41000Uml和GM-CSF1000Uml的存在下使纯化的CD14+单核细胞分化5天，得到人单核细胞衍生的不成熟的DCiDC。RNA构建体和体外转录用于体外转录裸的编码抗原之RNA的所有质粒都基于pST1-2hBgUTR-A120骨架，其特征是3’人β-球蛋白UTRhBgUTR和120个核苷酸的多A尾，并且允许生成在药理学上改进的体外转录的RNA。SIINFEKL构建体包含鸡OVA的257位至264位氨基酸aa257-264。HA构建体是密码子优化的流感HA部分序列aa60-285与aa517-527融合，流感毒株APR834，其被设计成组合主要的免疫显性MHC表位。pSTI-萤光素酶-A120Luc包含萤火虫萤光素酶基因15。RNA通过体外转录生成。根据制造商的说明书AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK使用HA构建体作为模板来用Cy5-UTP标记RNACy5-RNA。脂质体复合物的制备与注射除非另有说明，否则按照标准方案，在混合之前，在不含RNA酶的1×磷酸盐缓冲盐水PBSAmbion中将RNA和脂质体预稀释至100μl的终体积。经稀释的RNA和脂质体混合10分钟后，每只小鼠经静脉内注射200μl脂质体复合物溶液。在对于一些实验中，用154mM的不含RNA酶的NaClAmbion替代PBS。流式细胞分析用于流式细胞术的单克隆抗体来自BDPharmingen。在4℃下将低渗裂解的血液样品与特异性mAB一起孵育。通过用胶原酶1mgml；Roche消化来得到脾细胞。如前文所述，用H-2KbSIINFEKL四聚体Beckman-Coulter对SIINFEKL-特异性CD8+细胞定量。在FACS-CantoII分析型流式细胞仪上获取流式细胞数据，并通过使用FlowJoTreeStar软件来分析。电穿孔使用BioRad电穿孔仪，以270V和150μF的电穿孔参数将50μl的RNA溶液通过电穿孔转入iDC。体内生物发光成像BLI使用IVISLumina成像系统CaliperLifeSciences通过体内生物发光成像来评价Luc-RNA的摄取和翻译。简言之，在施用RNA脂质体复合物6小时后，经腹腔注射D-萤光素的水溶液150mg每千克体重BDBiosciences。5分钟后，对发射的光子进行定量1分钟的积分时间。使用IVIS活体成像4.0软件，将目的区域ROI中的体内生物发光定量为平均辐射光子秒cm2sr。将源自动物体内的表达萤光素酶的细胞的光发射强度表征为灰度图像，其中黑色是最小强度的生物发光信号，而白色是最强强度的生物发光信号。在LED低光照明下得到小鼠的灰度参考图像。使用活体成像4.0软件将图像叠加。ELISA根据制造商的说明书采用标准ELISA测定在小鼠血清中检测小鼠的IFN-aPBL和TNFaeBioscience。肿瘤实验为了测定保护性免疫，对小鼠进行三次免疫接种。然后将2×105B16-OVA肿瘤细胞经皮下接种于C57BL6小鼠的肋部中。对于治疗性免疫的评估，首先接种相同数量的肿瘤细胞。然后在肿瘤已经达到2mm至3mm直径后开始免疫接种。每三天测量肿瘤尺寸。当肿瘤直径超过15mm时处死动物。实施例2：缓冲剂离子对RNA脂质体复合物粒径和PI的影响制备阳离子带正电的脂质DOTMA与带负电的RNA之间的电荷比+-不同的脂质体与RNA的脂质体复合物。通过动态光散射PCS和ζ电势测量来研究脂质体的理化性质。缓冲剂通常为药物施用所必须的和离子的使用可导致脂质体复合物的聚集，这使其不适于经肠胃外地施用至患者。为了评价这些对脂质体复合物的平均直径影响，在四种缓冲剂条件下，即，在水、PBS缓冲剂、PBS加2.2mMCaCl2和PBS加22mMCaCl2中，测定不同电荷比的DOTMADOPEF4脂质体[DOTMADOPE1∶1mol∶mol]与RNA的脂质体复合物的颗粒性质。对于这些测量，简言之，通过将RNA添加至预先形成的脂质体来形成脂质体复合物，然后添加缓冲剂。RNA终浓度选择为约100μgml。所有其他浓度被相应地调节，或选择为附图中所给定的值。粒径在图1中示出。DOTMARNA电荷比在每个图表的X轴上给出。a在水中，得到具有限定粒径平均尺寸小于300nm和低的多分散性指数＜0.3的脂质体复合物。所测量的粒径仅轻微受到电荷比的影响。然而，带负电的颗粒比不带电的颗粒平均尺寸200nm至250nm，PI＜0.2更小平均尺寸为100nm至200nm，并且更稳定PI＜0.15。b在PBS缓冲剂中，该相同影响更明显。带正电或中性的电荷比的脂质体复合物形成更大的颗粒通过正电荷部分稳定化。具有中性电荷比的脂质体复合物建立了不稳定的聚集物。相反，带负电的脂质体复合物既稳定如所示的＜0.2的低PI，而且紧凑地具有250nm和更小的平均粒径。c在添加CaCl2后，可观察到粒径增加。然而，在生理Ca++浓度下示出为：2.2mM；在一些细胞类型中该生理浓度可高至5mM，很少高至10mM，带负电的颗粒仍然具有低于500nm的限定的粒径和不高于0.6的多分散性指数。对于带有过量正电荷的样品，尺寸增大至几乎为1000nm。d向样品bPBS添加22mMCaCl2在所有条件下诱导聚集絮凝，设想这是由于磷酸钙颗粒的形成。这些结果证实，在缓冲溶液中例如在PBS缓冲剂中和或在CaCl2的存在下，正电荷比或中性电荷比不适于生产稳定的脂质体制剂。脂质体复合物的稳定性取决于阳离子DOTMA脂质与带电的RNA之间的电荷比+-。此外，制剂缓冲剂的离子强度与二价阳离子的存在都对粒径有强的影响。在生理条件即，pH7.4；2.2mMCa++下，由于中性脂质体复合物或带正电的脂质体复合物的不稳定性，负电荷比率显得必要。对于具有过量负电荷的脂质体复合物，观察到最低聚集趋势。实施例3：正电荷对RNA脂质体复合物稳定性的影响对于正电荷对脂质体复合物稳定性的潜在的有益有害影响参见例如图1b与c进行额外评估，测量DOTMARNA电荷比为11和21的DOTMAChol脂质体F5[DOTMAChol1∶1mol∶mol]与RNA的脂质体复合物在不同缓冲剂中的粒径参见图2。为了比较，还测量了纯脂质体的尺寸。在150mM氯化钠中以及PBS缓冲剂中，正的21DOTMARNA电荷比导致大幅提高聚集的粒径和大于0.4的多分散性指数。该结果显示，正电荷不适于稳定脂质体复合物，并且在生理条件下也预期到带正电的脂质体复合物的聚集。实施例4：由二价阳离子介导的RNA预缩合对RNA脂质体复合物的粒径的影响为了测试在复合之前使用二价阳离子对RNA进行预缩合的影响，在用不同量的CaCl2进行RNA缩合后测定了在11和12的电荷比下F5RNA脂质体复合物的粒径。与实施例2和3不同，此处在形成脂质体复合物之前将离子添加至RNA中。在所有情况下，脂质体的终浓度都为100μM，并且相应地调节RNA浓度。因为对于12的F5RNA来说RNA浓度加倍，所有此处也将CaCl2浓度加倍。用生理浓度的CaCl2即，2.2mM对不带电的RNAF51：1脂质体复合物进行预处理后，所得脂质体复合物颗粒的平均尺寸被增大即，至1.2μm；参见图3。由于该大尺寸，这样的颗粒并非理想地适于药物组合物和或将RNA递送至细胞中。相反，使用带负电的脂质体复合物和低高浓度低：0.3mM；高：4.4mM的CaCl2的两个预缩合实验都产生约200nm350nm的小尺寸颗粒。这些结果显示，RNA可用二价离子进行预缩合。由于该预缩合步骤，在负电荷比下可形成具有限定和紧凑粒径的的脂质体复合物；可防止聚集或粒径的大幅增加。实施例5：RNA脂质体复合物的理化性质在图4中，给出了DOTMA与RNA之间的电荷比+-不同的具有F4DOTMADOPE的RNA脂质体复合物的理化性质结果。如对于带负电的脂质体复合物可见，在11及以上的+-比率下，粒径恒定地为约200nm。ζ电势从+-21单调降低至+-11，并且其恒定保持为较高的过量负电荷。这些结果说明，从11比率开始，重要的颗粒性质即粒径和ζ电势不随过量的RNA而变化。在该范围内，可制造具有良好限定粒径的胶体稳定颗粒。还可在离子和缓冲剂PBS的存在下得到类似的结果。实施例6：缓冲剂组分对带负电的RNA脂质体复合物的稳定性粒径的影响进一步详细研究了脂质体复合物在不同缓冲剂中的稳定性。为了测试过量的负电荷是否在潜在相关缓冲剂体系中导致胶体稳定的脂质体复合物，测定了电荷比为12的F4Luc-RNA脂质体复合物在水中以及将浓缩的缓冲剂添加至PBS1×、氯化钠150mM、葡萄糖5％或磷酸盐缓冲的葡萄糖中的粒径参见图5。在所有测试条件下，粒径不超过300nm，并且PI值明显低于0.4。这些结果说明，如果根据本发明制造，那么电荷比为12带负电的RNA过量的RNA脂质体复合物在不同缓冲条件下都是胶体稳定的。实施例7：负电荷比与粒径稳定性的相关性进一步研究比率为11至12的脂质体复合物的胶体稳定性。在水中测量电荷比为1∶1.8至1∶1.2的F4RNA脂质体复合物的粒径；参见图6。这些结果说明在所测试的电荷比范围中，脂质体复合物的粒径在过量RNA的微小变化下是不变的。与测试的负电荷比1∶1.2至1∶1.8相关，粒径一般为100nm至200nm，并且PI值小于0.2。实施例8：挤出对RNA脂质体复合物的平均粒径和PI值的影响。在本实验中示出可产生不同尺寸的脂质体复合物。为了确定额外的挤出步骤对脂质体或RNA脂质体复合物的平均粒径和PI值的影响，进行挤出实验使用具有不同孔径的聚碳酸酯膜。在图7中示出了由未经挤出的F4DOTMADOPE和由经挤出的F4得到的RNA脂质体复合物在水中或在PBS中的粒径测定结果。该实验证实，除了已经描述的200nm至300nm的尺寸范围，还可生产出更大和更小的颗粒。此处，作为示例，给出了具有400nm至500nm以及＜100nm范围的颗粒。虽然未经挤出的RNA脂质体复合物示出400nm至500nm的平均粒径，但是RNA脂质体复合物的挤出一般导致显著更小的颗粒，其尺寸小于200nm。相反，挤出对多分散性的影响有限；如果与RNA复合，则经挤出和未经挤出的脂质体都导致离散的、良好限定的颗粒并且PI值为0.1至0.3。实施例9：冻干对颗粒性质的影响脂质体复合物在液体混悬液中长期储存是不稳定的，并且会聚集。冻干是一种应对该挑战的技术。研究了冻干对颗粒性质的影响。测定冻干前和冻干并用水重构后的DOTMADOPE脂质体F4的粒径参见图8。这些结果说明，脂质体复合可被冻干而不影响颗粒性质。实施例10：DOTMADOPE比率对颗粒性质的影响。制造了具有不同DOTMADOPE比率的脂质体和脂质体复合物。具有非常高DOPE级分90mol％的脂质体在PBS中不稳定图9。对于脂质体复合物，已处于70mol％的DOPE级分下，粒径显著增大图10。所有其他组分都是稳定的。实施例11：RNA脂质体复合物的体内施用使萤光素酶-RNA20μg与不同量的F4脂质体复合以得到4.8∶1、2.4∶1、1.2∶1、1.2∶2、1.2∶4的F4∶RNA比率，用复合物经静脉内注射BALBc小鼠n＝3。通过在注射脂质体复合物6小时后进行体内成像来评估体内和体外的萤光素酶活性，图11示出了代表性的小鼠和器官组。图12示出来源于图11中描绘的实验之器官中总萤光素酶信号的分布。在4.8∶1的F4∶RNA比率下，F4DOTMA∶DOPE更多进入肺有一点进入脾，在2.4∶1的F4∶RNA比率下，更多进入肺和脾二者，并且在1.2∶1、1.2∶2、1.2∶4的F4∶RNA比率下，仅进入脾。因此，中性脂质体复合物和阴离子脂质体复合物特异性地靶向脾，而阳离子脂质体复合物主要靶向肺与蛋白表达有关。在肝中检测不到表达。使萤光素酶-RNA20μg与F11脂质体或F12脂质体以1.2∶2[F11∶DOTMADOPE1∶2mol∶mol；F12：DOTMADOPE2∶1mol∶mol]的Fx∶RNA比率复合，用复合物经静脉内注射BALBc小鼠n＝5。通过在注射脂质体复合物6小时后进行体内成像来评估体内和体外的萤光素酶活性，图13示出了代表性的小鼠和器官组。在1.2∶2的脂质体∶RNA比率下，F4衍生物F11和F12也靶向脾。使萤光素酶-RNA20μg与F2脂质体或F5脂质体以1∶1[F2：DOTAPDOPE1∶1mol∶mol；F5：DOTMAChol1∶1mol∶mol]的Fx∶RNA比率复合，用复合物经静脉内注射BALBc小鼠n＝5。通过在注射脂质体复合物6小时后进行体内成像来评估体内和体外的萤光素酶活性，图14示出了代表性的小鼠和器官组。在1∶1的脂质体∶RNA比率下，在F2靶向脾的同时，F5靶向脾和肺二者。使萤光素酶-RNA20μg在1×PBS中稀释A或在水中未稀释B和C，与在1×PBS中稀释B或在水中未稀释A和C的F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合。所有复合物的最终PBS浓度设定为1×PBS。然后用A、B或C静脉内注射BALBc小鼠n＝5，并且通过体内成像定量小鼠脾中的萤光素酶活性平均值+SD；参见图15。按照标准混合方案，将脂质体和RNA二者在PBS中稀释最终浓度为1×PBS，然后等体积混合。仅RNA的预稀释和标准方案一样好。不进行RNA在PBS中的预稀释的所有其他方案都得到较差的结果。复合之前优选在RNA溶液中存在离子，以达到好的结果。使萤光素酶-RNA20μg与0.125mM或1mM的CaCl2预复合或不进行预复合，按照标准方案与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率混合。用这些制剂经静脉内注射BALBc小鼠n＝5，在小鼠的脾中对体内萤光素酶活性进行定量平均值+SD；参见图16。当使用PBS作为缓冲剂时，用1mMCaCl2对RNA进行预缩合使萤光素酶信号升高3倍在PBS的存在下更高的CaCl2浓度导致大的颗粒聚集物。用Ca2+对RNA的预缩合有助于提高萤光素酶信号。使在1×PBS中或154mMNaCl中稀释的萤光素酶-RNA20μg或F4脂质体，以1.2∶2的F4∶RNA比率复合。用这些制剂经静脉内注射BALBc小鼠n＝5，在小鼠的脾中对体内萤光素酶活性进行定量平均值+SD；参见图17。使用标准混合方案，用等渗的NaCl替代PBS效果跟PBS一样好。使用标准方案使与1mM至4mM的CaCl2预复合的萤光素酶-RNA20μg，与使用154mM的NaCl替代1×PBS作为稀释缓冲剂的F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率混合。用这些制剂经静脉内注射BALBc小鼠n＝5，在小鼠的脾中对体内萤光素酶活性进行定量平均值+SD；参见图18。当PBS被NaCl替代时，可使用2mMCaCl2导致4.5倍的升高更高的CaCl2浓度不使该信号进一步提高。将萤光素酶-RNA5μg在25％或50％的小鼠血清中孵育30分钟。然后通过电穿孔转入源自人单核细胞的未成熟DC中。18小时后通过标准体外萤光素酶测定来评估萤光素酶活性平均值+SD；参见图19A。通过标准方案使萤光素酶-RNA20μg与F4脂质体以1.2∶2的F4∶RNA比率复合，然后在50％小鼠血清的存在或不存在下孵育30分钟。用这些制剂经静脉内注射BALBc小鼠n＝5，在小鼠的脾中对体内萤光素酶活性进行定量平均值+SD；参见图19B。裸露的RNA在血清的存在下降解。RNA与F4脂质体的复合保护其免受血清中RNA酶介导的降解。使Cy5-RNA40μg与用罗丹明标记的F4脂质体F4-rho复合1.2∶2；脂质体∶RNA，用复合物经静脉内注射BALBc小鼠n＝3。在注射脂质体复合物1小时后，通过流式细胞术评估脾中细胞群对Cy5-RNA或F4-rho的摄取；参见图20。作为专职性抗原呈递细胞APC，脾来源的DC和巨噬细胞高效地内化脂质体包封的RNA以及脂质体本身，而B细胞和T细胞几乎不内化脂质体包封的RNA或脂质体本身。因此，RNA脂质体复合物选择性地被脾源性APC内化。用与F41.2∶2；脂质体∶RNA混合的HA-RNA40μg、单独的F4或PBS作为对照注射C57BL6小鼠n＝3，参见图21。A在处理24小时后，通过流式细胞术来确定脾中树突细胞的成熟状态通过CD86和CD40的上调来显示平均值+SD。B在处理6小时后和24小时后通过ELISA来评估IFNa和TNFa的血清浓度平均值+SD。如通过DC上的活化标志物CD86、CD40的上调所显示的，RNA-F4脂质体复合物活化脾源性DC，而单独的脂质体没有。有趣的是，虽然在以前的实验中在5％至10％的脾源性DC中检测到了RNA-F4脂质体复合物，但是脾中所有DC被活化意味着递送后在脾中存在炎性环境。在所有注射了RNA-脂质体复合物的动物中，6小时后以及24小时后，尽管是低得多的量我们可以在血液中检测到高的IFNa量。我们还可在所有注射了RNA-脂质体复合物的动物中仅在6小时后检测到TNFa，但是处于非常中度的水平。细胞因子的分泌对RNA-脂质体复合物是特异性的，因为单独的PBS和脂质体都不能导致任何显著的细胞因子分泌基线。因此，RNA脂质体复合物活化脾源性DC导致全身性炎症。在第0、3、8和15天用以不同脂质体∶RNA比率与F4脂质体复合的SIINFEKL-RNA20μg或40μg经静脉内免疫接种C57BL6小鼠n＝5，参见图22。A在最后一次免疫接种的5天后第20天通过SIINFEKL-MHC四聚体染色来测定抗原特定性CD8+T细胞的频数平均值+SD。B在第57天进行另一次F4-RNA脂质体复合物的注射，然后在第62天通过SIINFEKL-MHC四聚体染色来评估记忆应答平均值+SD。在用F4脂质体复合物重复免疫接种后生产高位的抗原特异性T细胞免疫A。最后一次免疫接种d576周后，脂质体复合物的加强注射能够扩大在之前的注射中形成的CD8T细胞记忆B。F41.2∶1复合物形成聚集物，同时F41.2∶2复合物被清除。优选F41.2∶2与40μgRNA。因此，可用RNA-脂质体复合物生成强的效应T细胞和记忆应答。在第0、3和8天，用以1.2∶2的F4∶RNA比率与F4脂质体复合的SIINFEKL-RNA40μg，使C57BL6小鼠n＝3经静脉内接受三次免疫接种，或不进行处理。在第14天，将2×105B16-OVA肿瘤细胞经皮下注射至肋部。图23中示出了Kaplan-Meier存活曲线。以预防性的B16-OVA模式施用RNA脂质体复合物实现了完全保护。将2×105B16-OVA肿瘤细胞经皮下接种于C57Bl6小鼠的肋部n＝10，d0。在第10天肿瘤直径2mm至3mm，小鼠接受了七次静脉内免疫接种，用以1.2∶2的F4∶RNA比率与F4脂质体或F12脂质体复合的SIINFEKL-RNA40μg在第10、13、17、24、31、38、45天。将没有SIINFEKL-RNA的单独脂质体用作对照处理。在图24和25中分别示出了单个肿瘤生长和Kaplan-Meier存活曲线。在治疗性模式中，F4+RNA组或F12+RNA组检测到显著延迟的肿瘤生长。三次免疫接种后，在两组中均观察到肿瘤的缩小。使萤光素酶-RNA20μg与不同量的F5脂质体复合以得到4.8∶1、2.4∶1、1.2∶1、1.2∶2、1.2∶4的F5∶RNA比率，用复合物经静脉内注射BALBc小鼠n＝3。通过在注射脂质体复合物6小时后进行体内成像来评估体内和体外的萤光素酶活性，图26示出了代表性的小鼠和器官组。图27示出来源于图26中描绘之实验的器官中总萤光素酶信号的分布。在4.8∶1的F5∶RNA比率下，F5DOTMA∶Chol进入肺，在2.4∶1的F5∶RNA比率下，主要进入肺，但也进入脾，在1.2∶1的F5∶RNA比率下主要进入脾，但也进入肺，在1.2∶2、1.2∶4的F5∶RNA比率下仅进入脾。中性脂质体复合物和阴离子脂质体复合物更特异地靶向脾，而阳离子脂质体复合物主要靶向肺与蛋白表达有关。在肝中检测不到表达。实施例12：脂质体复合物的临床制剂根据之前建立的方案来进行配制，包括两步：即，通过使用等渗氯化钠溶液作为稀释剂对给定的RNA进行预配制，以及通过添加限定量的脂质体来形成脂质体复合物。对于预配制，首先用注射器从NaCl瓶中取出4ml氯化钠0.9％ww在水中溶液，并添加至RNA。然后，从脂质体瓶中取出400μL脂质体2.8mgmL，水中的总脂质，并使用套管内径0.9mm注射至RNA和氯化钠的溶液中。所得到的RNA脂质体复合物制剂5.5ml可通过直接肠胃外注射期望的量来施用，也可在制备为静脉输注液后施用。为此，从RNA脂质体复合物制剂中，取出5.0mL并在含有50ml等渗氯化钠溶液的输液袋中稀释。通过该流程，以稳健并且可重复的方式得到了约300nm至500nm粒径的脂质体复合物制剂；参见图28。可使用的材料和组分如下：组分：·RNA：在10mMHEPES和0.1mMEDTA中，0.5mgml·稀释剂：0.9％NaCl·脂质体：2.68mMDOTMA，1.34mMDOPE，粒径Zave300-500nm·注射器：·5mL注射器：例如，Omnifix，5mL，LuerLock，B.BraunMelsungenAGMelsungen，Germany·1mL注射器：Injekt-FTuberculin，1mL，LuerLock，B.BraunMelsungenAGMelsungen，Germany针头：·0.9×44mm，20G112″，BDMicrolance3，BectonDickinsonS.A.Fraga，Spain根据上述方法生产的RNA脂质体复合物颗粒的尺寸为300nm至500nm；参见图29。实施例13：粒径的影响已证实，脂质体复合物的活性随着尺寸的增加而增加。用于脂质体复合物制剂的脂质体的粒径也影响脂质体复合物的尺寸。较大的脂质体也导致较大的脂质体复合物。研究了使用F4DOTMADOPE50∶50molmol和F12DOTMADOPE66.7∶33.3molmol重构的RNA脂质体复合物的颗粒性质，其实现了不同尺寸的前体。为此，对具有经挤出的脂质体的脂质体复合物和具有未经挤出的、经0.45μm过滤的脂质体的脂质体复合物进行粒径测量。制剂经挤出的尺寸未经挤出的尺寸F4164nm582nmF12163nm637nm表1：用于脂质体复合物制剂的脂质体的尺寸图30示出了脂质体复合物的结果。已证实，不同尺寸的脂质体复合物可通过使用不同尺寸的前体来生产。图31和32的结果显示，脂质体越大，在这些实验中所形成的脂质体复合物越大，所观察到的萤光素酶信号越高。实施例14：氯化钠缓冲剂一些实验已示出，在添加脂质体之前将PBS缓冲剂添加至RNA导致脂质体复合物的活性升高。本文证实，标准盐溶液0.9％例如，150mMNaCl可替代PBS用于RNA缩合。这样的NaCl溶液是可以经批准的医学药品而得到，其促进脂质体复合物-IMP的供给logistics和处理。还证实，浓缩的NaCl和PBS溶液也可用于RNA的缩合，得到相同活性的随后形成的脂质体复合物。此外还示出了详细的尺寸测量，其中在形成脂质体复合物前将经不同程度浓缩的NaCl溶液添加至RNA中。一般地，脂质体复合物的尺寸随着所添加的NaCl溶液浓度的降低而增大；参见图35。因为尺寸增加与活性增加相关参见实施例13，所以添加标准盐水而非经浓缩的盐水被认为产生较高的活性。为了测试在装配之前使用常用的缓冲剂对RNA预配制的影响，在用经不同程度浓缩的PBS缓冲剂或氯化钠溶液处理RNA后测定在1∶2的电荷比下的脂质体复合物的粒径；参见图33和34。之前的混合方案其中脂质体和RNA二者都在PBS1×PBS终浓度中处理然后等体积混合可被采用标准氯化钠溶液0.9％更简化的混合所替代，所述标准氯化钠溶液可作为市售的经批准的医学药品而得到。作为用于脂质体复合物-IMP的混合方案，用等渗盐溶液预配制RNA，然后与水中的脂质体混合。结果显示，可以不同浓度添加一价离子以在脂质体复合物制剂中得到相同的最终离子强度，而不显著影响脂质体复合物的性质。实施例15：脂质体RNA电荷比从理化性质和生物学活性的角度来看，1.3至2的电荷比阳离子脂质与核苷酸的比率是适合的。在该比率下，设想更高级分的RNA被包含于脂质体复合物中，例如比率1∶2。进一步研究了未经挤出的脂质体的脂质体复合物的胶体稳定性、颗粒性质和萤光素酶活性。在等渗盐溶液中以1∶2至1.9∶2的脂质体RNA电荷比装配脂质体复合物，参见图36和37。对于脂质体复合物，在1.7∶2的电荷比下，粒径显著随着时间而增大。根据经挤出的脂质体的脂质体复合物，电荷比为1∶2至1.6∶2的脂质体复合物在过量RNA的微小变化下是不变的，并示出350nm至480纳米的粒径和小于0.3的PI值。如图38所证实的，1.1∶2至1.6∶2的脂质体RNA电荷比导致在脾中的良好活性。所有的比率仅将RNA递送至脾，在不同的脂质RNA比率之间没有显著的性能改变。以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：1.一种包含纳米颗粒的药物组合物，所述纳米颗粒包含编码至少一种抗原的RNA，其中：i所述纳米颗粒中的正电荷数不超过所述纳米颗粒中的负电荷数，和或ii所述纳米颗粒具有中性电荷或净负电荷，和或iii在所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4∶1或更低，和或iv所述纳米颗粒的ζ电势为0或更低。2.项1所述的药物组合物，其中在所述纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为1.4∶1至1∶8，优选1.2∶1至1∶4。3.项1或2所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种脂质。4.项1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质。5.项4所述的药物组合物，其中所述正电荷由所述至少一种阳离子脂质贡献，而所述负电荷由所述RNA贡献。6.项3至5中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种辅助脂质。7.项6所述的药物组合物，其中所述辅助脂质是中性脂质。8.项4至7中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷DOTMA和或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP。9.项6至8中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种辅助脂质包括1，2-二-9Z-十八酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DOPE、胆固醇Chol和或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱DOPC。10.项6至9中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比为10∶0至3∶7，优选9∶1至3∶7、4∶1至1∶2、4∶1至2∶3、7∶3至1∶1或2∶1至1∶1，优选约1∶1。11.项3至10中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质与所述RNA形成复合物，和或包封所述RNA。12.项3至11中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质被包含在包封所述RNA的囊泡中。13.项1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。14.项1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和胆固醇，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。15.项1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTAP和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。16.项1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有约50nm至约1000nm，优选约100nm至约800nm，优选约200nm至约600nm，例如约300nm至约500nm的平均直径。17.项1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒可通过以下的一种或更多种方式得到：i将水相中的脂质体与水相中的RNA一起孵育，ii将溶解于水可混溶有机溶剂中的所述脂质与水溶液中的RNA一起孵育，所述水可混溶有机溶剂例如乙醇，iii逆相蒸发技术，iv对所述产物进行冷冻和融化，v对所述产物进行脱水和再水化，vi对所述产物进行冻干和再水化，或vii对所述产物进行喷雾干燥和再水化。18.项1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过这样的方法来生产，其包括将所述RNA与二价阳离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和或用将所述RNA与一价离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和或将所述RNA与缓冲剂一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中的步骤。19.项1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过包括挤出之步骤和或冻干所述纳米颗粒之步骤的方法来生产。20.项1至19中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾中发生RNA表达。21.项1至20中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后，在肺和或肝中不发生或基本不发生RNA表达。22.项1至21中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾中的RNA表达是肺中RNA表达量的至少5倍。23.项1至22中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾的抗原呈递细胞中，优选专职性抗原呈递细胞中发生RNA表达。24.项23所述的药物组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞和或巨噬细胞。25.项20至24中任一项所述的药物组合物，其中通过肠胃外施用，优选通过静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用来进行全身性施用。26.项1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原是疾病相关抗原，或者其引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。27.项1至26中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或更多种可药用载剂、稀释剂和或赋形剂。28.项1至27中任一项所述的药物组合物，其还包含至少一种佐剂。29.项1至28中任一项所述的药物组合物，其被配制成用于全身性施用。30.项1至29中任一项所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答，优选针对癌症的免疫应答。31.项1至30中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA不包含假尿苷残基，并且优选不包含经修饰的核苷。32.项1至31中任一项所述的药物组合物，其用于预防性和或治疗性处理涉及抗原的疾病，优选癌症疾病。33.一种用于将抗原递送至脾的抗原呈递细胞优选专职性抗原呈递细胞，或在脾的抗原呈递细胞优选专职性抗原呈递细胞中表达抗原的方法，其包括将项1至32中任一项的药物组合物施用于对象。34.项33所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞和或巨噬细胞。35.一种用于在对象中诱导免疫应答，优选针对癌症之免疫应答的方法，其包括将项1至32中任一项的药物组合物施用于所述对象。36.一种用于在对象中刺激、引发和或扩增T细胞的方法，其包括将项1至32中任一项的药物组合物施用于所述对象。37.一种在对象中治疗或预防涉及抗原的疾病，优选癌症疾病的方法，其包括将项1至32中任一项的药物组合物施用于所述对象。38.如前述项中任一项所述的颗粒。39.一种用于生产包含RNA之纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：a提供配制在氯化钠溶液中的RNA，和b将脂质体添加至所述RNA中。40.项39所述的方法，其中所述氯化钠溶液是水溶液。41.项39或40所述的方法，其中溶剂是水。42.项39至41中任一项所述的方法，其中所述氯化钠溶液含有约50mM至约300mM，优选约100mM至约200mM，优选约150mM的氯化钠。43.项39至42中任一项所述的方法，其中所述氯化钠溶液是等渗氯化钠溶液。44.项39至43中任一项所述的方法，其中所述脂质体配制在水中。45.项39至44中任一项所述的方法，其中通过将所述脂质体注入所述RNA制剂中来将所述脂质体添加至所述RNA。46.项39至45中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是前述项中任一项所述的纳米颗粒。

权利要求：1.包含至少一种阳离子脂质和编码至少一种抗原的RNA的纳米颗粒在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于将所述至少一种抗原递送至对象的脾中的专职性抗原呈递细胞，其中在所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1∶1至1∶4，优选1∶1.2至1∶4。2.权利要求1所述的用途，其中在所述纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为1∶1.2至1∶2。3.权利要求1或2所述的用途，其中在所述纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为1.6∶2至1.1∶2。4.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中在所述纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为1.3∶2。5.权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述至少一种阳离子脂质包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷DOTMA和或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP，优选DOTMA。6.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述正电荷由所述至少一种阳离子脂质贡献，而所述负电荷由所述RNA贡献。7.权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒还包含至少一种辅助脂质，其中优选地，所述辅助脂质是中性脂质。8.权利要求7所述的用途，其中所述至少一种辅助脂质包括1，2-二-9Z-十八酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺DOPE、胆固醇Chol和或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱DOPC，优选DOPE。9.权利要求7或8所述的用途，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比为10∶0至3∶7，优选9∶1至3∶7、4∶1至2∶3、7∶3至1∶1或2∶1至1∶1。10.权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至3∶7，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6∶2至1∶2，更优选1.4∶2至1.1∶2。11.权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至3∶7，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTMA和胆固醇，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6∶2至1∶2，更优选1.4∶2至1.1∶2。12.权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为10∶0至3∶7，优选8∶2至3∶7，并且更优选7∶3至5∶5的DOTAP和DOPE，并且其中DOTAP中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.6∶2至1∶2，更优选1.4∶2至1.1∶2。13.权利要求1至12中任一项所述的用途，其中通过动态光散射测量的所述纳米颗粒的多分散性指数为0.5或更低，优选0.4或更低，更优选0.3或更低。14.权利要求1至13中任一项所述的用途，其中通过动态光散射测量，所述纳米颗粒具有50nm至1000nm，优选100nm至800nm，优选200nm至600nm，例如300nm至500nm的平均直径。15.权利要求1至14中任一项所述的用途，其中所述RNA是mRNA。16.权利要求1至15中任一项所述的用途，其中所述抗原是疾病相关抗原，或者其引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。17.权利要求1至16中任一项所述的用途，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞和或巨噬细胞。18.权利要求1至17中任一项所述的用途，其中所述药物组合物还包含一种或更多种可药用载剂、稀释剂和或赋形剂。19.权利要求1至18中任一项所述的用途，其中所述药物组合物还包含至少一种佐剂。20.权利要求1至19中任一项所述的用途，其中所述药物组合物全身性施用于所述对象。

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