申请/专利权人：江南大学

申请日：2020-05-08

公开（公告）日：2022-12-02

公开（公告）号：CN111500561B

主分类号：C12N9/44

分类号：C12N9/44;C12R1/84

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.12.02#授权;2020.09.01#实质审查的生效;2020.08.07#公开

摘要：一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，属于微生物和酶工程技术领域。本发明采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理，首先将重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115pPICK‑BdP5WB138与10×试剂D反应，随后在冰水中放置，再加入10×试剂E反应。离心收集细胞后用柠檬酸缓冲液悬浮细胞进行超声波破碎。经过两种试剂处理的细胞经超声波处理6min就将细胞全部破碎，破碎液中酶活保留在85%以上。使用本发明所提供的方法及专用处理液可以大幅度减少细胞破碎所需要消耗的电力等成本，减少设备占用时间。

主权项：1.一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，其特征在于步骤如下：（1）对重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115pPICK-BdP5WB138进行发酵，在发酵终点以5000rmin离心2min收集细胞，所获细胞用水悬浮，悬浮液体积控制为原发酵液体积的0.8倍；（2）在步骤（1）细胞悬液中加入原发酵液110体积的10×试剂D，混合后在45℃下反应15min；随后将细胞悬液放入冰水混合物中使悬液迅速冷却，维持10min，再在4℃放置3h；（3）在步骤（2）所得反应液中继续加入步骤（1）所得原发酵液110体积的10×试剂E，混合，随后在60℃反应20min；（4）以5000rmin离心2min收集细胞；用20mmolL、pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液悬浮细胞，控制体积与原发酵液相同；在250W、1s间隔1s条件下进行超声波破碎，20mL上述细胞悬液完全破碎时间不超过6min；步骤（2）所述10×试剂D的配方如下：12.5mMTris-HCl，碱性蛋白酶50UmL，菠萝蛋白酶50UmL，FeSO42mmolL，甘油20gL，乙醇20gL，pH7.4-7.6；所述10×试剂D的配置方法如下：在1L容器中加入800mL去离子水，加入1.51gTris三羟甲基氨基甲烷，0.1molL的盐酸溶液50mL，混合；再加入FeSO4·H2O0.56g，甘油20g，乙醇20g，混合，加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶各50000U，搅拌混合后加水至1L；最后采用pH调节剂调节pH为7.4-7.6；步骤（3）所述10×试剂E具体为：200mM柠檬酸-柠檬酸钠，80mmolLNa2SO4，70mmolLKCl，10mmolLNa2SO3，5mmolLKH2PO4，pH3.4-3.6；所述10×试剂E的配置方法如下：在1L容器中加入800mL去离子水，加入一水合柠檬酸33.6g，二水合柠檬酸三钠11.8g，混合溶解；再加入无水硫酸钠11.4g，氯化钾5.2g，七水合亚硫酸钠2.5g，磷酸二氢钾0.7g，搅拌溶解；最后采用pH调节剂调节pH为3.4-3.6。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江南大学 一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法

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