申请/专利权人：中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)

申请日：2021-12-06

公开（公告）日：2023-01-24

公开（公告）号：CN113981151B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.01.24#授权;2022.02.18#实质审查的生效;2022.01.28#公开

摘要：本发明公开了一种鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的方法及其试剂盒，属于病毒分子检测领域。为克服临床上缺少对基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒鉴别的方法，本发明提供一种基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的鉴别方法以及引物和探针，所涉及引物和TaqMan探针是依据乙脑病毒的prMM基因保守区和盖他病毒的E2基因保守区进行设计，其可以有效鉴别乙脑病毒和盖他病毒，具有较高特异性和灵敏度的优点，可以为乙脑病毒和盖他病毒基因型的快速检测、临床诊断以及流行病学调查提供更好的方法支持。

主权项：1.一种鉴别基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的非诊断目的的方法，其特征在于，其是通过设计基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的引物对和TaqMan探针进行的多重RT-qPCR进行鉴别，其中基因Ⅰ型乙脑病毒的TaqMan探针JEV-G1-P的核酸序列如SEQIDNO:1所示，基因Ⅲ型乙脑病毒的TaqMan探针JEV-G3-P的核酸序列如SEQIDNO:2所示；基因Ⅴ型乙脑病毒的TaqMan探针JEV-G5-P的核酸序列如SEQIDNO:3所示；盖他病毒的TaqMan探针GETV-P的核酸序列如SEQIDNO:4所示；其具体包括如下步骤：1多重RT-qPCR检测反应体系及反应程序的确定：配置RT-qPCR反应体系，其包括基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的正向引物各0.4μl，基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的反向引物各0.4μl，基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的TaqMan探针各0.4μl，样本2μl，TaqManMix10μl和无RNA酶水4μl；其反应程序如下：95℃1min；95℃40s，60℃20s，40个循环；在每个循环结束时收集荧光信号；2按照步骤1的多重RT-qPCR检测反应体系及反应程序对阳性对照病毒质粒分别绘制基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒检测的标准曲线；3按照步骤1的多重RT-qPCR检测反应体系及反应程序对待测样本进行鉴定，根据样本扩增曲线判定病毒种类；其中所述的基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型乙脑病毒和盖他病毒的TaqMan探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团，其中用于检测基因Ⅰ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为FAM；检测基因Ⅲ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为VIC；检测基因Ⅴ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为CY5；检测盖他病毒的探针的报告荧光基团为HEX，所述的淬灭荧光基团均为BHQ-1；其中基因Ⅰ型和Ⅲ型乙脑病毒共用一对PCR扩增引物对，正向引物JEV-G13-F序列如SEQIDNo：5所示，反向引物JEV-G13-R序列如SEQIDNo：6所示；基因Ⅴ型乙脑病毒的引物对中正向引物JEV-G5-F序列如SEQIDNo：7所示，反向引物JEV-G5-R序列如SEQIDNo：8所示；盖他病毒的引物对中正向引物GETV-F序列如SEQIDNo：9所示，反向引物GETV-R序列如SEQIDNo：10所示。

全文数据：

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