申请/专利权人：青岛农业大学

申请日：2021-09-03

公开（公告）日：2023-03-07

公开（公告）号：CN115737910A

主分类号：A61L27/20

分类号：A61L27/20;A61L27/50;B82Y5/00

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.03.24#实质审查的生效;2023.03.07#公开

摘要：本发明公开了一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素甘油二酯纳米乳液制备方法。制备出硫酸软骨素和甘油二酯的纳米乳液，可刺激软骨细胞高效分泌粘多糖。以硫酸软骨素为原料与甘油二酯混合进行修饰得到纳米乳液，通过明显促进软骨分泌粘多糖以解决传统软骨修复材料韧性差、支撑性能低、在植入后无法及时有效地发挥承重缓冲等难题，为其在软骨组织工程中应用提供实验基础。

主权项：1.一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素甘油二酯纳米乳液制备方法，包括以下步骤：S1、将一定质量比的硫酸软骨素和甘油二酯CS+DAG在60℃下搅拌2h至混合均匀，得到油相；S2、将茶皂甙在60℃下溶于蒸馏水中搅拌至完全溶解，得到水相；S3、将步骤S1的油相等体积且缓慢均匀加入步骤S2的水相中，在60℃下用高剪切混合器处理，混合均匀后得到粗乳液；S4、将步骤S3的粗乳液在60℃、高压微射流作用下均质2次，收集得到纳米乳液，冷却后于4℃密封冷藏；S5、选取无特定病原体SPF级成年雄性SD大鼠1只，将其麻醉、处死，无菌操作摘取膝关节软骨；S6、将步骤S5的关节软骨无菌操作剪成1mm3左右的小碎块后，放入50mL无菌小烧杯中，按1倍体积加入0.25%胰蛋白酶水溶液，按一定体积比加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶水溶液，37℃摇床消化6h以上,经200目不锈钢筛网过滤后离心去上清，加入已在37℃恒温箱中复温的RPMI1640培养液30mL，得到软骨细胞悬液；S7、将步骤S6的软骨细胞悬液分装入3只25mL的培养皿中，补足RPMI1640培养液至15mL皿，于培养箱中进行培养，隔日换培养液1次，每周传代1次，传至第3代，取第3代软骨细胞待用；S8、将步骤S7的第3代软骨细胞稀释成细胞悬液，然后按照一定体积比加入白细胞介素-1β溶液，混匀，于培养箱中孵育72h，1500rpm，10min离心去上清，得到骨关节炎细胞模型；S9、将步骤S8的骨关节炎细胞模型加入100μL的步骤S4的纳米乳液，再加RPMI1640培养液至15mL皿，于培养箱中孵育4周、8周、12周分别得到不同孵育周期的骨关节炎细胞培养液，对其进行粘多糖含量测定；S10、称取步骤S9的骨关节炎细胞培养液50g，加入pH7.0、0.2molL500mL磷酸缓冲液50mL，先进行37℃加热预处理5min，加入一定浓度胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶，利用恒温水浴反应装置在恒定pH7.2和温度37℃下进行酶解反应90min，用0.1molLNaOH溶液滴定维持pH恒定变动范围为±0.1；S11、酶解反应完毕后，在100℃沸水中加热5min，冷却至室温，接着离心分离得一次上清液，加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀，在4℃下静置12h，离心后得二次上清液，加入3倍无水乙醇，再离心得沉淀物，最后用无水乙醇洗涤后，冷冻升华干燥得到粘多糖，结果换算为ugmg（粘多糖骨关节炎细胞培养液。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 青岛农业大学 一种促进软骨高效分泌粘多糖的硫酸软骨素/甘油二酯纳米乳液制备方法

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