申请/专利权人：广东省实验动物监测所

申请日：2018-04-18

公开（公告）日：2023-03-14

公开（公告）号：CN110387437B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.14#授权;2019.11.22#实质审查的生效;2019.10.29#公开

摘要：本发明公开了一种小鼠脑脊髓炎病毒RT‑RPA引物组、试剂盒及其检测方法，可以实现实时检测小鼠脑脊髓炎病毒，在恒温条件下20分钟即可完成反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高的特点。本发明的反应检测灵敏度达到1×101copies，为快速检测提供了技术支持，在病原微生物检测中有极高的应用价值。

主权项：1.一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测试剂盒，其特征在于，包含引物组和探针；其中，所述引物组的核苷酸序列如下所示：TMEV-F：5’-TTCCTATGGAGATGACCTATTAATTGGAAC-3’；TMEV-R：5’-TCAGAGGAAAGGTGGTGGTCTTGTTGGCAG-3’；所述探针的核苷酸序列如下所示：TAATCTTATAACCGAAGGGGGCTAATCTTT-THF-TTTAACAAGATTAAA。

全文数据：一种检测小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA扩增方法及其试剂盒技术领域本发明涉及病原微生物检测技术研发领域，具体涉及一种快速检测小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA方法及其试剂盒。背景技术小鼠脑脊髓炎病毒Theiler’smurineencephalomyelitisvirus，TMEV是实验动物小鼠种群中常见的病毒性病原之一。该病毒属于微RNA病毒科，心病毒属Cardiovirus。TMEV基因组包含一个单股负链RNA，长度约8100bp。在小鼠群中，TMEV感染是一个比较普遍的疾病，已经有研究报道其感染率为8％～35％。小鼠感染该病毒后大多数无可见临床症状，呈隐性感染；但是可以导致感染小鼠发生免疫反应进而引发免疫紊乱等病理现象，这不仅对小鼠本身造成身体伤害，而且还会干扰生命科学研究的结果，因此TMEV是国家标准中SPF级小鼠需要排除的病原体。近年来有研究发现，将TMEV接种在大鼠的大脑，可以导致其发生可见的临床症状，如后肢瘫痪和体重减轻等症状。目前，TMEV诊断方法主要分为血清学检测和病原学检测。血清学检测主要有酶联免疫吸附试验ELISA、免疫荧光试验IFA等。由于免疫功能缺陷动物如裸鼠或者基因改造小鼠等，不能和正常小鼠产生一样的免疫反应；病毒感染早期机体尚未产生抗体，该阶段进行抗体检测势必导致假阴性结果；而且无法对小鼠笼具和垫料等病毒可能污染的环境进行检测，因此血清学检测应用具有局限性。病原学检测方法尤其是RT-PCR，操作简单、灵敏度高，已经成为病毒监测的一个重要分子学技术手段。但是普通PCR还是荧光定量PCR，都至少需要一个小时反应时间，而且需要昂贵的仪器，许多基层单位和偏远地区无法承担。因此，一种能检测小鼠脑脊髓炎病毒的重组酶聚合酶扩增RPA的试剂为目前所需。发明内容本发明的首要目的在于提供一对检测小鼠脑脊髓炎病毒的引物组和探针；本发明的另一目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒的试剂盒；本发明的再一目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒的检测方法。本发明所采取的技术方案是：一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的引物组，其核苷酸序列如下所示：TMEV-F：5’-TTCCTATGGAGATGACCTATTAATTGGAAC-3’；TMEV-R：5’-TCAGAGGAAAGGTGGTGGTCTTGTTGGCAG-3’。一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的荧光探针，其核苷酸序列如下：TAATCTTATAACCGAAGGGGGCTAATCTTT-THF-TTTAACAAGATTAAA。一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。进一步的，该试剂盒中还含有目的基因的重组酶聚合酶扩增试剂。一种小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测方法，包含以下步骤：1提取样品RNA；2以提取的RNA作为模板，使用上述所述的引物组TMEV-F、TMEV-R，以及上述所述的探针进行RT-RPA扩增反应获得扩增产物；3对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否含有小鼠脑脊髓炎病毒。进一步的，向RPA扩增试剂试剂盒说明书推荐反应的50ul扩增体系中加入10μM的引物各2μL，10μM的探针0.6μL、2μLRNA。进一步的，步骤2的扩增反应条件为：39℃恒温反应20min。本发明的有益效果是：本发明提供的试剂盒可对小鼠脑脊髓炎病毒进行快速检测，反应时间只需要20分钟，并且可以在恒温条件下实时监测扩增产物，具有准确性高、特异性好，重复性高的特点，而且使用轻便的荧光检测仪即可反应，有利于在广大基层单位以及临床实践中推广应用。附图说明图1是本发明小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA方法的特异性扩增曲线图；图2是本发明小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA的灵敏度扩增曲线图，从左到右1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100copiesμl的标准品的扩增结果；图3是本发明小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA的临床样品验证实验结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1特异性引物的设计本发明根据公开发表的小鼠脑脊髓炎病毒基因组序列，分析其序列最为保守的部分进行引物的设计；对所设计的引物进行初步的筛选，获得一组适用于RPA的灵敏度和特异性较好的引物对，其核苷酸序列如下：TMEV-F：5’-TTCCTATGGAGATGACCTATTAATTGGAAC-3’SEQ.ID:NO.1；TMEV-R：5’-TCAGAGGAAAGGTGGTGGTCTTGTTGGCAG-3’SEQ.ID:NO.2；扩增片段长度为104bp；探针序列如下：TAATCTTATAACCGAAGGGGGCTAATCTFAM-dTTTHFTBHQ-dTTAACAAGATTAAA3’spacerSEQ.ID:NO.3。实施例2检测TMEV的RT-RPA试剂盒的建立试剂盒包括以下组分：1实施例1所设计的引物组和探针；2目的基因扩增的重组酶聚合酶试剂，该RT-RPA试剂购自杭州众测公司；3RT-RPA扩增反应体系。实施例3阳性标准模板制备、RT-RPA检测方法1RNA标准模板的制备提取小鼠脑脊髓炎病毒RNA，以保守区域设计引物引物序列如下用OneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒Takara公司进行RT-PCR获得长度为800bp的保守序列。引物的核苷酸序列为：上游引物F：TGGAACTGACCCGGATGTTGSEQ.ID:NO.4下游引物R：GCGTACACCCTAGTGGCTTCSEQ.ID:NO.5反应体系为：RT-PCR反应程序为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸40s，循环35次；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段纯化后与pGEM-TEasy载体连接，转化到大肠杆菌，挑取单菌落培养，提取质粒并双酶切进行鉴定，阳性质粒pGEM-TMEV进行测序。将pGEM-TMEV质粒线性化后纯化，用体外转录试剂盒RibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystemsPromega公司说明进行目的基因的转录，获得体外转录本TMEV-RNA，并且根据分光光度计测定的RNA浓度计算拷贝数。2RT-RPA扩增目的基因扩增的重组酶聚合酶试剂购自杭州众测公司向RPA扩增试剂试剂盒说明书推荐反应的50uL扩增体系中加入10μM的RPA引物TMEV-F、TMEV-R各2μL，10μM的探针0.6μL、2μLRNA。扩增反应程序为：39℃反应20min。3结果分析将配置完成的反应管放置于荧光检测仪，根据仪器检测到的荧光信号，观察是否生成荧光信号曲线。结果判断标准如下：在20分钟内，有明显的扩增曲线生成，判断为阳性样本；没有明显的扩增曲线生成，判断为阴性样本。实施例4RT-RPA检测方法特异性实验分别提取小鼠肝炎病毒MHV、小鼠诺如病毒MNV、仙台病毒SV、小鼠肺炎病毒PVM、小鼠脑脊髓炎病毒TMEV的病毒基因组作为模板，ddH2O作为对照组进行RT-RPA检测。如图1所示，只有TMEV有荧光扩增曲线生成，而MHV、MNV、SV和PVM四个病毒和对照组没有扩增曲线，呈平滑状。说明本发明的检测方法特异性良好。实施例5RT-RPA检测方法灵敏度实验将实施例3中制备的RNA模板，测定浓度并换算为目的基因的拷贝数，并且进行10倍稀释，得出100到106copiesμl共7个稀释度，使用上述反应体系和反应条件进行RT-RPA灵敏度的检测，同时设立阴性对照组。结果如图2所示，到101copies反应时，有荧光扩增曲线，检测到小鼠脑脊髓炎病毒，说明该方法的灵敏度较好。本发明检测限达到了101copies。实施例6临床样品的RT-RPA检测验证1、RNA的制备采集14个经实验感染TMEV的小鼠脑组织，制备匀浆后提取基因组RNA。2、RT-RPA扩增目的基因扩增的重组酶聚合酶试剂购自杭州众测公司按照RT-RPA试剂的生产商建议，向RPA扩增试剂盒说明书推荐反应的50ul扩增体系中加入10μM的RPA引物TMEV-F、TMEV-R各2μL，0.6μL的浓度为10μM探针、2μLRNA。扩增反应程序为：39℃反应20min。3.实验结果见图3，RT-RPA结果发现1-12号样品均为阳性，13和14号为阴性；使用常规RT-PCR对样品进行验证，发现1-11号样品为阳性；测序鉴定发现1-11号样品均为TMEV，结果发现本发明结果的正确率高达100％，而且比普通RT-PCR敏感性更高。以上所述为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING广东省实验动物监测所一种检测小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA扩增方法及其试剂盒5PatentInversion3.5130DNA人工引物1ttcctatggagatgacctattaattggaac30230DNA人工引物2tcagaggaaaggtggtggtcttgttggcag30344DNA人工引物3aatcttataaccgaagggggctaatcttttttaacaagattaaa44420DNA人工引物4tggaactgacccggatgttg20520DNA人工引物5gcgtacaccctagtggcttc20

权利要求：1.一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的引物组，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：TMEV-F：5’-TTCCTATGGAGATGACCTATTAATTGGAAC-3’；TMEV-R：5’-TCAGAGGAAAGGTGGTGGTCTTGTTGGCAG-3’。2.一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的探针，其特征在于，其核苷酸序列如下：TAATCTTATAACCGAAGGGGGCTAATCTTT-THF-TTTAACAAGATTAAA。3.一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有权利要求2所述的探针。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有目的基因的重组酶聚合酶扩增试剂。6.一种小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：1提取样品RNA；2以提取的RNA作为模板，使用权利要求1所述的引物组TMEV-F、TMEV-R，以及权利要求2所述的探针进行RT-RPA扩增反应获得扩增产物；3对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否含有小鼠脑脊髓炎病毒。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，向RPA扩增试剂说明书推荐反应的50ul扩增体系中加入10μM的引物各2μL，10μM的探针0.6μL、2μLRNA。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2的扩增反应条件为：39℃恒温反应20min。

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