申请/专利权人：湖北伯远合成生物科技有限公司

申请日：2020-01-15

公开（公告）日：2023-03-14

公开（公告）号：CN112852849B

主分类号：C12N15/63

分类号：C12N15/63;C12N15/66

优先权：["20191231 CN 2019114206233"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.14#授权;2021.06.15#实质审查的生效;2021.05.28#公开

摘要：本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于大片段DNA无缝组装的系统及组装方法，包括：S1、构建载体系统；S2、将大片段DNA分成多个目标片段，并将目标片段按顺序交替克隆到供给载体D1、D2上；S3、用EN1同时酶切接受载体A和酶切供给载体D1‑seg1，通过组装反应得到pBWRA‑seg1，然后采用EN2酶切pBWRA‑seg1和供给载体D2‑seg2，通过组装反应得到pBWRA‑seg1‑seg2；S4、重复步骤S3，根据确定的组装顺序将目标片段分步组装连接到接受载体A上，形成最终的载体。本发明的核酸内切酶在转基因载体构建、合成生物学、代谢通路研究等方面具有良好应用前景。

主权项：1.一种用于大片段DNA无缝组装的系统，其特征在于，包括由接受载体A、供给载体D1和供给载体D2组成的系统；所述接受载体A的多克隆位点中含有一组核酸内切酶识别靶位点EN1，且按照：“载体骨架---反向EN1靶位点---任意碱基---同源臂13R---正向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述接受载体A的载体骨架中不含有EN1靶位点；所述供给载体D1的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN1靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN2靶位点---任意碱基---正向EN2靶位点---同源臂13R---反向EN1靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D1的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；所述供给载体D2的多克隆位点中含有三组核酸内切酶识别靶位点，且从上游到下游按照：“载体骨架---正向EN2靶位点---反向EN3靶位点---任意碱基---正向EN3靶位点---反向EN1靶位点---任意碱基---正向EN1靶位点---同源臂13R---反向EN2靶位点---载体骨架”排列，所述供给载体D2的载体骨架中不含有EN1、EN2、EN3靶位点；所述核酸内切酶为识别位点和酶切位点不完全重复的DNA内切酶；所述核酸内切酶为识别靶位点长度大于等于12bp的RNA介导的LbCas12a核酸内切酶；所述EN1、EN2和EN3靶位点中含有限制性内切酶的酶切位点，所述EN1、EN2和EN3中限制性内切酶的酶切位点不同，且所述载体骨架不含有EN1、EN2、EN3靶位点以及该限制性内切酶的酶切位点。

全文数据：

权利要求：

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