申请/专利权人：新乡学院

申请日：2019-07-15

公开（公告）日：2023-05-23

公开（公告）号：CN110646614B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/569;G01N33/535;G01N33/543

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.23#授权;2020.02.04#实质审查的生效;2020.01.03#公开

摘要：IBDV抗体的ELISA试剂盒和测试方法、有效抗体效价确定方法，ELISA试剂盒包括，1）包被IBDV抗原的酶标板；2）1:3000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY；其中，所述包被IBDV抗原的酶标板，通过IBDV抗原浓度稀释到10ng孔后，包被上述稀释液到反应板相应孔后制作而成，IBDV抗原为由杆状病毒表达系统制备的rVP2蛋白，检测结果是依据ELISA检测方法的SP值进行判定。依据ELISA检测方法的SP值检测结果是阳性时，检测结果是阳性时，说明有效抗体水平高，能够中和IBDV，不需要重新免疫疫苗；检测结果SP值阴性时，说明抗体水平较低不具有保护力，容易感染病毒，需要重新进行疫苗的免疫。因此，本发明建立的ELISA试剂盒抗体阳性检出率高，并且能够指导生产上疫苗的免疫，减少经济损失。

主权项：1.一种IBDV抗体的ELISA测试方法，其特征在于：包括以下步骤，IBDV抗体的ELISA测试盒包括1）包被IBDV抗原的酶标板；2）1:3000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY；其中，所述包被IBDV抗原的酶标板通过IBDV抗原浓度稀释到10ng孔，包被到反应板制作而成，所述IBDV抗原为由杆状病毒表达系统制备的rVP2蛋白；ELISA测试盒还包括以下试剂：标准阳性血清、标准阴性血清、包被液、洗涤液、封闭液、洗涤液、显色液和终止液，所述包被液由1.465gNaHCO3和0.975gNa2CO3溶于超纯水中，调pH为9.6定容至500mL制备而成，所述洗涤液为0.01mol·L-1PBST溶液；所述洗涤液和封闭液均由2.5g脱脂奶粉加入PBST中混匀，定容至50mL制备而成；所述终止液由11mL浓硫酸缓慢滴入69mL超纯水中制备而成；所述显色液为TMB单组分显色液；利用ELISA测试盒进行ELISA测试方法包括如下步骤：S1.包被抗原：取0.2μg·mL-1的IBDV抗原稀释液到反应板酶标孔中，每孔50~100μL，4℃过夜包被，上层为液体，包被抗原吸附在酶标板上，使用时37℃回温1h；S2.弃包被液：用洗涤液冲洗反应板先洗三次洗去表面包被液，再洗3次，后洗时每次5min，每孔加入100~200μL封闭液，置于37℃培养箱，孵育1h；S3.弃封闭液：用洗涤液冲洗反应板冲三次，洗三次，洗时每次5min，将稀释过的待测标准阴性、阳性血清加入到相应孔中，每孔50~100μL，置于37℃培养箱，孵育0.5h；待测标准阴性、阳性血清的稀释比均为1:400，PN≥2.1，且阳性血清的OD450大于2.0，阴性血清的OD450小于0.3为标准选取适合的抗原包被浓度和待检血清稀释比；S4.弃一抗：用洗涤液冲洗反应板冲三次，洗三次，洗时每次5min，每孔加入50μL按照1:3000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY，37℃孵育1h；S5.弃二抗：用洗涤液冲洗反应板冲三次，洗三次，洗时每次5min，每孔加入80~100μL的TMB单组份显色液，37℃避光显色时为15min后加入50μL的终止液，利用酶标仪测定OD450值；S6.临界值确定：利用上述方法检测待测阴性血清样品，每个样品两个重复，并设立阳性对照，当样品OD450≤0.4时样品为阴性，当样品OD450≥0.487时样品为阳性。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 新乡学院 IBDV抗体的ELISA试剂盒和测试方法、有效抗体效价确定方法

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