申请/专利权人：上海交通大学医学院附属瑞金医院

申请日：2019-08-07

公开（公告）日：2023-05-26

公开（公告）号：CN110314222B

主分类号：A61K38/05

分类号：A61K38/05;A61P35/02;A61K31/4045;A61K31/16

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.26#授权;2019.11.05#实质审查的生效;2019.10.11#公开

摘要：本发明涉及硼替佐米和帕比司他或伏立诺他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。本发明证实帕比司他和伏立诺他能够恢复MLL白血病耐药细胞的敏感性，并在小鼠体内逆转硼替佐米耐药性，减少耐药细胞的产生，延长生存期。本发明有助于解决MLL白血病的耐药难题，进一步提高该类恶性肿瘤在个性化医疗时代的治疗效果。

主权项：1.硼替佐米和帕比司他的组合物在制备治疗对硼替佐米耐药型MLL白血病的药物中的应用，其特征在于，所述组合物中，硼替佐米和帕比司他的摩尔比为20:1或2:1。

全文数据：硼替佐米和帕比司他或伏立诺他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用技术领域本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及硼替佐米和帕比司他或伏立诺他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。背景技术蛋白酶体抑制剂proteasomeinhibitor，PI能有效地诱导肿瘤细胞凋亡，自20世纪90年代末以来，已经在多种恶性肿瘤上进行了临床试验。目前已有三种蛋白酶体抑制剂硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米获得美国食品药品监督管理局foodanddrugadministration，FDA的批准应用于临床治疗多发性骨髓瘤multiplemyeloma，MM和套细胞淋巴瘤mantle-celllymphoma，MCL。硼替佐米bortezomib，商品名valcade，万轲是第一个被批准应用于临床的蛋白酶体抑制剂。硼替佐米能够结合26S蛋白酶体的催化部位，从而抑制β5、β2和β1亚基的蛋白水解活性。该抑制剂最初被批准用于复发和难治性多发性骨髓瘤患者的一线治疗，作为单一治疗药物显示出令人印象深刻的临床效果，并且随后成功地与其他药物联合使用以改善临床结果。硼替佐米的临床疗效在许多不同的药物联用组合中进行了评估，包括与来那度胺lenalidomide和地塞米松dexamethasone、免疫调节药物immunomodulatorydrugs，IMiDs、CD38单克隆抗体达雷木单抗daratumumab、组蛋白去乙酰化酶histonedeacetylase，HDAC抑制剂等的联合使用，均导致了积极的治疗效果。11q23染色体易位导致的混合谱系白血病mixedlineageleukemia，MLL是一种常见的急性白血病，在急性淋巴细胞性白血病acutelymphoblasticleukemia，ALL和急性髓系白血病acutemyeloidleukemia，AML中均有发现，约占全部急性白血病数量的10％，尤其是婴儿白血病以及拓扑异构酶抑制剂治疗引起的继发性白血病中更是占到了80％以上。MLL白血病极为凶险，预后极差，即使是干细胞移植也不能显著改善其预后，被认为是最难治的一类白血病，亟需寻找有效的治疗方法。近年来，随着对MLL生物学功能以及MLL白血病发病机制的深入研究，多个MLL白血病的新型靶标，包括GSK3、BRD4、DOT1L等分子相继被发现，相应的治疗策略也应运而生。最近蛋白酶体抑制剂被发现能够通过激活MLL融合蛋白的内在肿瘤抑制活性，导致细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡，从而特异性地杀死MLL白血病细胞，并成功地在临床上被加以运用，取得了很好的治疗效果，为治疗MLL打下良好的基础。虽然蛋白酶体抑制剂极大地改善了多发性骨髓瘤、淋巴瘤的治疗效果，但是患者最终均不可避免地出现耐药性，最终导致肿瘤复发。我们在病人体内应用蛋白酶体抑制剂治疗MLL白血病时也同样碰到了病人产生耐药性的问题，从而导致治疗失败，这也严重影响了蛋白酶体抑制剂的临床应用。专利文献CN109789138A，公开日2019.05.21，公开了一种用于治疗血液癌症的药物组合物，其包含化学式1的组蛋白脱乙酰酶HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂或免疫调节药物，和甾体抗癌剂。并通过测量治疗协同效应证明根据该发明的组合物的改善的功效，发现当作为HDAC抑制剂的第一活性成分与第二活性成分和第三活性成分组合施用时，该发明的组合物显示出协同效应，因此具有优异的针对血液癌症，特别是多发性骨髓瘤的抗癌活性。专利文献CN101528037A，公开日2009.09.09，公开了一种使用SAHA和硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括给予患者：iSAHA辛二酰苯胺异羟肟酸或其可药用盐或水合物；和ii1R-3-甲基-1-[[2S-1-氧代-3-苯基-2-[吡嗪基羰基氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸硼替佐米，或其可药用盐或水合物，其中对于21天周期的第4-11天的至少一个治疗周期，每天口服给予200mg至800mgSAHA或其可药用盐或水合物，和对于21天周期的第1、4、8和11天的至少一个治疗周期，每天静脉内给予0.7-1.3mgm2硼替佐米或其可药用盐或水合物。南方医科大学2008级博士学位论文“联合信号传导通路抑制剂逆转急性髓系白血病耐药及其机制研究”，公开了LBH589、Bortezomib能够明显下调HL-60ADM细胞MRP1的表达，提高细胞阿霉素摄取率，逆转耐药，而两药联合效果更加明显；LBH589联合Bortezomib处理HL-60ADM细胞，可以降低PI3KAktNF-κB信号通路活性，上调P53蛋白的表达，抑制Bcl-2和XIAP蛋白表达，促进Caspase-3、8和PARP的裂解激活，共同参与逆转AML耐药。然而目前未见针对耐药型MLL白血病效果显著的药物。发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种硼替佐米和帕比司他或伏立诺他的组合物的新用途。第一方面，本发明提供了硼替佐米和帕比司他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。所述组合物中，硼替佐米和帕比司他的摩尔比为20:1或2:1。第二方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有硼替佐米和帕比司他，剂型为注射剂，所述硼替佐米和帕比司他溶于同一溶剂体系中。第三方面，本发明提供了硼替佐米和帕比司他的组合物在制备逆转MLL白血病耐药细胞的耐药性的试剂中的应用。所述MLL白血病耐药细胞为发生MLL异位重排的B细胞白血病细胞株RS4；11或SEM。第四方面，本发明提供了硼替佐米和伏立诺他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。所述组合物中，硼替佐米和伏立诺他的摩尔比为1:20。第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有硼替佐米和帕比司他，剂型为注射剂，所述硼替佐米和伏立诺他溶于同一溶剂体系中。第六方面，本发明提供了硼替佐米和伏立诺他的组合物在制备逆转MLL白血病耐药细胞的耐药性的试剂中的应用。所述MLL白血病耐药细胞为发生MLL异位重排的B细胞白血病细胞株RS4；11或SEM。本发明优点在于：MLL白血病因其独特的异位重排机制，导致其恶性程度很高，目前仍然是悬在患者头上的“利剑”，尤其是其在婴儿白血病中有极高的比例，从而导致了严重的影响，因此开发相应的治疗策略并改善其应用显得尤为迫切。但因为MLL白血病发病及产生耐药的机制目前并不明确，加上血液系统肿瘤本身为一组异质性很强的疾病，因此耐药MLL白血病治疗药物的研究困难重重。本发明提供了一种蛋白酶体抑制剂硼替佐米和HDAC抑制剂帕比司他panobinostat,LBH589和伏立诺他vorinostat,SAHA在MLL白血病中的联合治疗策略，相对于蛋白酶体抑制剂的持续单药治疗，使用蛋白酶体抑制剂和HDAC抑制剂的联合治疗策略，能够通过减少耐药细胞的产生，从而清除患者体内肿瘤，延长患者生存期，更为有效地治疗MLL白血病。本发明有助于解决MLL白血病的耐药难题，进一步提高该类恶性肿瘤在个性化医疗时代的治疗效果。本发明同时改善了蛋白酶体抑制剂治疗MLL白血病的临床转化运用效果，对于进一步提高该类药物在个性化医疗时代的效用至关重要。基于本发明，还可采用硼替佐米和伏立诺他的组合物作为试剂，用于处理MLL白血病耐药细胞，研究MLL白血病耐药的发生发展机制及筛选逆转药物等。本发明还得到了硼替佐米和HDAC抑制剂LBH589和SAHA合用的最佳比例，有助于临床药物的开发。附图说明图1.构建MLL耐药细胞株及检测其对硼替佐米的敏感性。AMTT法检测不同的MLL细胞SEM和RS4；11对硼替佐米的敏感性，加入对应浓度的硼替佐米24小时后进行检测。BAnnexinV法检测不同状态的SEM和RS4；11细胞在对应浓度的硼替佐米处理下的细胞凋亡百分比，药物处理时间为16小时。图2.HDAC抑制剂LBH589和SAHA与硼替佐米联合用药。SEM和RS4；11耐受细胞分别用图示对应浓度的LBH589或SAHA与DMSO或50nM硼替佐米联合处理24小时，MTT法检测抑制效果。图3.HDAC抑制剂LBH589和SAHA能够恢复耐药细胞的敏感性。ASEM耐受细胞分别用DMSO、LBH5895nM或SAHA2μM与硼替佐米联合处理，MTT法检测其敏感性。BRS4；11耐受细胞分别用DMSO、LBH58950nM或SAHA2μM与硼替佐米联合处理24小时，MTT法检测其敏感性。图4.HDAC抑制剂在小鼠体内逆转蛋白酶体抑制剂耐药性。A将SEM耐药细胞经尾静脉注射到辐照后的小鼠体内，分别采用不同的方案进行尾静脉注射硼替佐米和或腹腔注射SAHA进行治疗，在图示相应时间抽取小鼠外周血，流式细胞仪检测CD133阳性细胞比例。B在小鼠观察终末期处死小鼠，抽取骨髓细胞进行流式检测CD133阳性细胞比例。C不同处理组小鼠的生存曲线，其中对照组vehicle，n＝8，平均生存期26.4天，SAHA单药治疗组SAHA，n＝7，平均生存期28.3天，硼替佐米单药治疗组bortezomib，n＝7，平均生存期27.9天，联合治疗组bortezomib+SAHA，n＝8，平均生存期40.0天。数据用平均值±标准误差表示，数据统计结果采用双尾t检验或时序检验log-ranktest，n.s.，差异不显著，*P0.05，**P0.01，***P0.001。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例11材料和方法本研究应用了以下几种细胞株：发生MLL异位重排的B细胞白血病细胞株RS4；11和SEM购自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenDMSZ。所有悬浮细胞株均用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养，放置于37℃、5％CO2、95％空气湿度培养箱中培养。细胞隔日换液，调整细胞浓度为5×105个ml和2×106个ml之间。蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药细胞resistantcells由亲代细胞parentalcells中加入浓度逐渐升高的硼替佐米处理至少四周获得。具体的药物浓度为对应亲代细胞的药物半数生长抑制浓度halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50，即加入5nM硼替佐米，每处理三天后换液并加入新的药物继续处理，持续四周。药物处理过程中大多数细胞会凋亡，少数残留细胞存活下来并继续增殖，这群能够耐受药物处理的细胞被称为耐受细胞。6-8周龄雌性NOD-SCID免疫缺陷小鼠购自维通利华实验动物技术公司，饲养于屏障设施动物层流室，饲养温度24-26℃，相对湿度40-60％，室内采用人工照明，自由采食，饲料和水经高温消毒处理。每只小鼠尾静脉注射5×106个SEM耐药细胞，注射细胞后观察白血病发病情况和白血病进程。一般成瘤成功的小鼠，1-2周小鼠骨髓中能检测到CD133阳性细胞，2-3周左右小鼠外周血中能检测到CD133阳性细胞。外周血细胞检测的具体做法为：1.5ml离心管中预先加入10μL肝素，用眼科剪剪断小鼠尾巴末梢，用1.5ml离心管取小鼠外周血，加入5倍体积的红细胞裂解液，室温裂解5min。500g离心5min收集细胞，将细胞均分为两份，其中一份不标记抗体作为对照，用于流式细胞仪设置调整电压；另一份用含有1μL抗CD133荧光抗体的50μLDPBS重悬细胞，室温下孵育20-30min。加入1mLDPBS洗涤，500g离心5min，弃掉上清。每管加入含500μLDPBS缓冲液，用流式细胞仪进行检测，用FlowJo软件进行分析，分别计算不同细胞的阳性比例。小鼠成瘤后进行随机分组处理，对小鼠进行连续4周的治疗，然后对其进行疾病监测，并在其即将死亡时将其处死。动物护理和处死按照上海交通大学动物实验中心动物护理和使用委员会批准的方法进行。骨髓细胞检测的具体做法为：NOD-SCID免疫缺陷小鼠采用颈部脱臼处死。取出小鼠的胫骨，剔除肌肉，置于预冷的含1％BSA的DPBS中。用手术剪将胫骨两端剪掉，1ml注射器冲洗胫骨，获得骨髓细胞。经过70μm的滤网过滤，收集细胞悬液。4℃400g离心5min，弃去上清。用红细胞裂解液ACK裂解细胞5min，加入3倍体积的PBS终止裂解。4℃400g离心5min，弃去上清，获得小鼠骨髓细胞。尾静脉注射SEM耐药细胞的小鼠成瘤后进行随机分组处理。根据实验设计小鼠随机分为三组，移植后7天开始治疗，第一组为对照组，注射相同量的DMSO；第二组为硼替佐米单药治疗组：1mgkg硼替佐米尾静脉注射，每周2次，接受硼替佐米单药治疗的小鼠也同时接受不含药物的药物载体治疗，同时进行腹腔注射相同量的DMSO，一周五次；第三组为SAHA单药治疗组：5mgkgSAHA腹腔注射，每周5次；第四组为硼替佐米和SAHA联合治疗组：1mgkg硼替佐米尾静脉注射，每周2次，同时5mgkg的SAHA腹腔注射，一周五次。所有小鼠均处理4周，从第10天开始每5天抽取一次外周血流式检测记录CD133阳性细胞比例。第25天每组处死3只小鼠，分别取出后腿胫骨中的骨髓细胞并用流式细胞仪检测CD133阳性细胞比例。MTT法检测细胞敏感性：以每孔5×104个细胞接种于96孔板中，单药硼替佐米分别用为0、1、2、5、10、20、50、100nM的浓度梯度进行处理，24h后每孔中加入10μlMTS，37℃孵育4h后，在分光光度计490nm处检测标本吸光度值。每个药物浓度设3个复孔，并重复3次实验。根据药物对细胞的剂量-效应曲线计算IC50。对药物耐受细胞同时联合HDAC抑制剂LBH589和SAHA进行处理溶媒DMSO，观察上述抑制剂与硼替佐米联合使用对药物耐受细胞的影响，联合指数Combinationindex，CI用CompuSyn软件进行计算分析。细胞凋亡检测应用PEAnnexinVApoptosisDetectionKit试剂盒，根据试剂盒相关步骤进行细胞处理。收集1×105个细胞，用预冷PBS洗涤2次，加入100μL1×bindingbuffer重悬并转移至流式管。加入2μLPEAnnexinV和2μL7-AAD，混匀，室温避光孵育15min。加入400μL1×bindingbuffer，1h内进行流式细胞仪检测，用FlowJo软件进行分析，分别计算不同细胞的凋亡比例。2实验结果我们分别对蛋白酶体抑制剂敏感的亲代MLL白血病细胞系SEM和RS4；11分别进行体外加药处理，通过逐步增加培养基中的蛋白酶体抑制剂硼替佐米的浓度，筛选获得耐药细胞株。药物处理大约4周后，这些细胞均对硼替佐米产生了耐药性图1中A。为了进一步验证上述结果，我们对这些体外细胞系模型进行了凋亡检测。通过标记AnnexinV进行流式检测细胞凋亡情况，结果显示，与亲代细胞相比，随着药物剂量的增加耐药细胞株没有出现明显的凋亡，表明这些细胞能够耐受硼替佐米图1中B。为了研究HDAC抑制剂在耐药细胞中的治疗效果，我们用HDAC抑制剂LBH589和SAHA分别与硼替佐米联合用药处理耐受细胞，检测了HDAC抑制剂联合硼替佐米的疗效。我们首先通过MTT实验确定LBH589和SAHA与硼替佐米联合使用的最佳浓度。我们发现，在SEM耐受细胞中，分别用5nMLBH589或2μMSAHA与硼替佐米联合处理，对SEM耐药细胞的杀伤效果最为明显。而RS4；11耐受细胞中，分别用50nMLBH589或2μMSAHA与硼替佐米联合处理，对RS4；11耐药细胞的杀伤效果最为明显图2。随后我们分别用上述浓度的LBH589或SAHA分别与硼替佐米联合使用处理耐药细胞，细胞敏感性检测实验显示，相比于单独使用硼替佐米，联合用药能够明显降低耐受细胞的IC50值，导致耐受细胞耐药性明显下降图3中A和B。我们采用了药物联合指数Combinationindex，CI来判断两种药物之间的协同性，其中CI小于0.9即表明药物具有协同效应，CI小于0.3为强协同效应。我们的结果显示，硼替佐米联合帕比司他或伏立诺他作用于MLL耐药细胞，均表现出了明显的协同性，并且当硼替佐米与伏立诺他的浓度分别为0.1μM和5μM时在SEM和RS4；11细胞中的CI均小于0.1，表明这两种药物之间具有非常强的协同效应。这些结果表明，HDAC抑制剂和蛋白酶体抑制剂联合使用对MLL耐受细胞具有明显的协同作用表1-4。表1不同浓度硼替佐米联合伏立诺他作用于SEM耐药细胞的联合指数表2不同浓度硼替佐米联合帕比司他作用于SEM耐药细胞的联合指数表3不同浓度硼替佐米联合伏立诺他作用于RS4；11耐药细胞的联合指数表4不同浓度硼替佐米联合帕比司他作用于RS4；11耐药细胞的联合指数随后，我们将耐受蛋白酶体抑制剂的SEM细胞移植到NODSCID小鼠体内，评价硼替佐米单独治疗或联合SAHA的体内疗效。NODSCID小鼠预先用SEM耐受细胞尾静脉注射成瘤，1周后开始尾静脉或腹腔注射给药Vehicle、1mgkg硼替佐米、5mgkgSAHA、1mgkg硼替佐米与5mgkgSAHA联用，同时通过CD133抗体标记，流式检测外周血中的肿瘤细胞比例，在小鼠观察终末期处死小鼠，并检测骨髓中的肿瘤细胞的比例。通过外周血和骨髓细胞中的SEM耐受细胞比例检测我们发现，与对照组相比，硼替佐米和SAHA单药治疗均对这些异种移植小鼠没有明显的治疗效果，而与之相比，硼替佐米与SAHA联合使用能明显降低肿瘤细胞比例，表明两药联合使用能够明显增加对小鼠体内SEM耐药细胞的杀伤作用图4中A和B。通过观察小鼠的生存期我们发现，与对照组相比平均生存天数26.375，单独使用硼替佐米平均生存天数27.857和SAHA平均生存天数28.3并不能显著延长小鼠的生存期，但是硼替佐米与SAHA联合使用，能够明显延长小鼠生存期平均生存天数40.0图4中C。这些结果显示，硼替佐米单药治疗对这些移植小鼠没有疗效，这与这些细胞对硼替佐米治疗已经产生了耐受性的结果一致。相比之下，硼替佐米联合SAHA治疗的小鼠表现出明显的反应性和显著提高的总体存活率，这些结果表明蛋白酶体抑制剂联合HDAC抑制剂治疗可能对蛋白酶体抑制剂诱导的耐受细胞有效，提示我们这一联合用药方案在体内是可行的。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.硼替佐米和帕比司他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物中，硼替佐米和帕比司他的摩尔比为20:1或2:1。3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有硼替佐米和帕比司他，剂型为注射剂，所述硼替佐米和帕比司他溶于同一溶剂体系中。4.硼替佐米和帕比司他的组合物在制备逆转MLL白血病耐药细胞的耐药性的试剂中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MLL白血病耐药细胞为发生MLL异位重排的B细胞白血病细胞株RS4；11或SEM。6.硼替佐米和伏立诺他的组合物在制备治疗耐药型MLL白血病的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物中，硼替佐米和伏立诺他的摩尔比为1:20。8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有硼替佐米和帕比司他，剂型为注射剂，所述硼替佐米和伏立诺他溶于同一溶剂体系中。9.硼替佐米和伏立诺他的组合物在制备逆转MLL白血病耐药细胞的耐药性的试剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述MLL白血病耐药细胞为发生MLL异位重排的B细胞白血病细胞株RS4；11或SEM。

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