申请/专利权人：北卡罗来纳大学教堂山分校

申请日：2016-12-14

公开（公告）日：2023-05-26

公开（公告）号：CN108602859B

主分类号：C07K14/015

分类号：C07K14/015;C12N15/35;C12N15/861;A61K35/761

优先权：["20151214 US 62/266,941"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.26#授权;2018.12.14#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明涉及转导效率提高的修饰细小病毒衣壳蛋白、包括所述衣壳蛋白的病毒载体及利用所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。

主权项：1.一种细小病毒衣壳蛋白，包括来自腺相关病毒AAV血清型的衣壳蛋白氨基酸序列，其中可变区1VR1的环选自AAV1衣壳蛋白氨基酸残基261至273，除了AAV2、AAV3b、AAV4和AAV5，所述可变区1的环通过删除与或替换一个或多个氨基酸残基进行修饰，由于所述残基编排的氢键模式被靶向破坏，导致环内区域失稳，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率与或修饰组织特异性得到提高。

全文数据：増强细小病毒载体递送的修饰衣壳蛋白优先权声明[0001]本申请要求2015年12月14日提交的序列号为62266,941的美国临时申请的权益，通过引用，该临时申请全文纳入本申请中。联邦支持声明[0002]本发明得到美国政府支持，是美国国立卫生研究院拨款项目AI080726、DK084033、HL112761、AI072176、AR064369和GM007050完成的发明。美国政府享有本发明的某些权利。技术领域[0003]本发明涉及转导效率提高的修饰细小病毒衣壳蛋白、包括所述衣壳蛋白的病毒载体及利用所述衣壳蛋白递送核酸至细胞或受试者的方法。背景技术[0004]目前，重组腺相关病毒rAAV的各种血清型被用于各种临床试验中（例如，rAAVl用于脂蛋白脂酶缺乏症、rAAV2用于莱伯先天性黑朦症，rAAV8用于血友病）。在这些血清型中，rAAVl被认为最适合肌内（i.m.递送，不管是直接治疗肌肉疾病例如，肌肉萎缩症或从治疗性蛋白质分泌到血液中受益的病症例如，α-1抗胰蛋白酶AAT缺乏症）。这种方法的主要局限是即使施用高剂量的rAAV，转基因表达也一直低于治疗剂量。例如，虽然rAAV-AAT临床试验结果表明，肌内注射后，血清中AAT浓度呈现剂量依赖性增加，但是，在高剂量队列中，仅实现〜3%靶向AAT表达。由于该队列要求每次注射1.35mL，共肌内注射100次，因此，将剂量提高到疾病治疗必需水平可能并不可行。最近批准的rAAVl-类药物格利贝拉Glybera也报告了类似现象。要使rAAV基因增强治疗成为以上疾病的实用选择，必须改善其在肌肉组织内的转导效率。[0005]提高转基因表达的工作分为内源法与或外源法，在内源法中，rAAV衣壳和转基因本身被修饰从而增强转导，在外源法中，在施用rAAV的同时开展补充治疗。虽然外源法，如免疫抑制法改善了转导，但是，将rAAV生物学新发现整合到临床试验设计中的方法一直是最成功的策略。随着众多天然AAV血清型，及其偏好的组织转导模式的研究，这一点得到了很好地证明。这样可以使AAV血清型与靶器官正确配对例如，肌内递送rAAV的临床试验表明，采用rAAVl显然比以前采用的rAAV2更成功）。此外，血清型比较生物学和结构分析促进了rAAV的定向演变和合理工程操作，开发了新一代翻译载体。[0006]人们已经辨别了最常见rAAV血清型的衣壳结构。每个衣壳结构包括60个重复单体，所述单体由保守桶状核心组成，周围散布构成衣壳表面拓扑的大环。通过将rAAV2与同源性最低血清型rAAV4的结构进行对比，定义了共9个可变区（VR;VRI至VRIXJR的氨基酸含量导致每个血清型的不同表型，例如，受体结合、抗原反应性及转导效率。将rAAV2的VR原型rAAV与更有效的肌肉转导子如rAAVl比较，使首个工程rAAV衣壳进入临床试验。rAAV2.5由rAAVl五个氨基酸接枝的rAAV2衣壳组成，隔离它们在肌肉内对rAAVl效率的作用。随访研究表明，要明显增强rAAV2在肌肉内的效率，只需改变单个氨基酸；即在264位置后插入不同的氨基酸，从而创建新位置265。持续的临床前研究表明，rAAV2的翻译性受到血清型，如rAAVl和rAAV6的高效率，及群内rAAV2中和抗体高主导性限制。通过调节衣壳骨架上的表面氨基酸，这些“新一代”血清型的传导效率进一步得到提高。[0007]随着rAAVl已经成为肌肉骨骼应用的首选，rAAVl在67%肌内临床试验中使用，过去5年中在86%肌内临床试验中使用，因此，改善rAAVl效率对临床转化来说正当其时。本发明提供具有改善特点的修饰衣壳蛋白，适合用于制备具有广泛用途，包括基因治疗的载体。发明内容[0008]本研究分析了rAAV衣壳结构，以制定设计用于改善肌肉转导的工程策略。与rAAV2265插入突变相反，从rAAVl衣壳删除位置265最高程度地提高了肌肉组织内的转基因递送和表达。此外，通过同源建模和突变分析，鉴定了衣壳共同作用别构性控制rAAV6和rAAV2转导效率的两个区。该结果提供了因破坏氢键结合模式而使VRl环区域失稳的机理。该发现允许对这些血清型合理突变，从而使转导效率提高至少一个数量级。此外，嵌合体rAAV血清型内的临床AAT转基因表达比亲代rAAVl提高达12.5倍，支持这些构建体在临床试验中应用。该研究证明了采用rAAV衣壳结构建模和分子剖析的合理设计方法，用于改善更适合翻译研究的递送制剂。[0009]本发明的一个方面涉及一种细小病毒衣壳蛋白，包含来自AAV血清型或T=I二十面体衣壳结构的任何其它细小病毒的衣壳蛋白氨基酸序列，其中可变区IVRl的环包括AAVl衣壳蛋白氨基酸残基258至272或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基，所述可变区1的环通过删除与或替换一个或多个氨基酸残基进行修饰，由于所述残基编排的氢键模式被靶向破坏，导致环内区域失稳，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率得到提高。[0010]本发明的另一个方面涉及本发明所述衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与硫酸肝素结合的AAV血清型或其它细小病毒的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。[0011]本发明的另一个方面涉及一种AAV衣壳蛋白，包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。[0012]本发明的另一个方面涉及一种AAV衣壳蛋白，包括来自AAV2、AAV3a或AAV3b血清型的氨基酸序列，其中所述衣壳蛋白在紧接AAV2衣壳蛋白残基264后面或在紧接AAV3a或AAV3b衣壳蛋白相应残基后面插入一个或多个氨基酸残基，且调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少；其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率得到提高。[0013]本发明的另一个方面涉及一种编码本发明所述衣壳蛋白的多核苷酸、包括本发明所述衣壳蛋白的细小病毒衣壳、包括本发明所述衣壳蛋白的病毒载体及包括本发明所述病毒载体的药物组合物。[0014]本发明的另一个方面涉及一种将核酸递送给细胞的方法，所述方法包括在足以使核酸进入到细胞内的条件下将所述细胞与本发明病毒载体或药物组合物接触。[0015]本发明的另一个方面涉及一种将核酸递送到受试者体内的方法，所述方法包括向受试者施用本发明所述的病毒载体或药物组合物。[0016]本发明的另一个方面涉及一种将核酸递送给受试者的方法，所述方法包括向受试者施用已经在足以使核酸进入到细胞内的条件下与本发明所述病毒载体或药物组合物接触的细胞。[0017]本发明的另一个方面涉及一种产生重组细小病毒粒子的方法，包括向允许细小病毒复制的细胞提供：（a重组细小病毒模板，包括⑴异源核酸，及ii至少一种反向末端重复序列；及b多核苷酸，包括复制蛋白编码序列和编码本发明所述衣壳蛋白的序列;在足够复制和包装重组细小病毒模板的条件下;从而在细胞中产生重组细小病毒粒子。[0018]本发明的这些方面和其它方面将在下面进行更详细的说明。附图说明[0019]图1A-1D示出了肌内注射后rAAVl位置265突变体的体内表征情况。㈧小鼠腓肠肌GC内施用lelOvg。利用7dpi注射7天后时的活动物生物荧光成像，将荧光素酶转基因表达直观显示且进行定量。单位以感兴趣区每分钟计数CPMR0I表示。为了直观显示，rAAVl以与265突变体不同的比例尺显示。这不会影响图像定量。为了对转导表型⑻进行体外定量，收获注射的肌肉并将其裂解，并对组织裂解液开展荧光素酶分析。测量结果以归一化为mg总蛋白的相对光单位RLUmg蛋白质表示。（C采用qPCR测定每个细胞的病毒转基因拷贝数vgcg。⑼在注射IelOvg后，开展rAAVl和rAAVlT265del表达动力学时间过程分析。所有数据表示每组η=4;在A组中，每组示出一个代表性图像。[0020]图2A-2C示出了rAAV6265删除突变体的表型。（AIelOvgrAAV6或rAAV6T265del删除）在注射7天后7dpi的荧光素酶转基因表达。⑻rAAVl浅灰和rAAV6深灰）的VRl衣壳区比对。残基265在rAAVl上以深蓝色突出显示，在rAAV6上以黄色突出显示。采用这些衣壳的结晶坐标在PyMo1中生成图像。⑹向小鼠GC中注射rAAVI-rAAV6点突变体后的转基因表达。数据以相对rAAV6测定表达值的倍数差表示。所有数据表示每组η=4。[0001]图3A-3D直观示出了rAAV6衣壳的氨基酸位置265和531rAAV6点突变例如，rAAV6.1等）已经是普通实验室储备的一部分。对本工作中使用的每个质粒开展DNA测序，以在制备病毒之前验证序列一致性。表8VRl突变体定向突变采用的引物。*准确的rAAVlT265del引物用于建立rAAV6T265del突变体。[0236]活动物研究。所有动物均按照美国国立卫生研究院指南，遵照北卡罗来纳大学教堂山分校IA⑶C批准的协议维持和处理。将包装CBA-荧光素酶或CBA-hAAT转基因的rAAV变体按指示剂量注射到6-8周大雌性BALBc小鼠（JacksonLaboratories体内。每次注射总体积50yL。在注射之前，小鼠采用异氟烷气体麻醉。按120mgkg体重腹膜内注射D-荧光素底物（Nanolight后，米用XenogenIVISLumina成像系统（PerkinElmerCaliperLifeSciences监测指示时间点的焚光素酶转基因表达。采用LivingImage软件（PerkinElmerCaliperLifeSciences开展生物荧光图像分析，荧光素酶表达以CPMR0I感兴趣选择区域每分钟计数报告。[0237]转基因表达和拷贝数的体外定量。对体外荧光素酶分析来说，在注射IeIOvg剂量7天后处死小鼠，并收获注射肌肉组织。将大约50mg的每个组织在冰上切碎。然后，采用组织匀浆机Cole-Parmer将每个组织试样在150yL2X被动裂解缓冲液Promega中均化。将35yL裂解液和IOOyLD-荧光素底物Promega转移到96-孔板，采用Victor2发光计PerkinElmer开展发光分析。组织裂解液的总蛋白浓度采用Bradford分析Bio-Rad测定。在注射IeIOvg剂量3天后，收获注射的GC按照上述说明均化和裂解，采用DNeasy试剂盒Qiagen处理〜25mg组织试样，提取宿主和载体基因组DNA。细胞数量利用专为小鼠核纤层蛋白（管家基因）设计的下述引物，采用qPCR测定：（正向）5’-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3’SEQIDNO:25和（反向）5’-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC-3’（SEQIDNO:26。如上文所述，每个细胞病毒基因组的数量利用专为荧光素酶转基因设计的引物，采用qPCR测定。[0238]肝素竞争。将所示构建体在溶于林格氏盐溶液RSS的250ygmL猪硫酸肝素钠盐Sigma-Aldrich溶液中于4°C转动条件下培养1个晚上或仅在林格氏盐溶液中于4°C转动条件下培养1个晚上。每组每GC注射lelOvg，每次注射总体积50yL。在注射7天后，开展活动物生物荧光成像。[0239]分子建模。rAAVI、rAAV2或rAAV6的三维结构采用PyMo1之前公开的坐标www.pymol.org，以整个衣壳形式展示（来自MavisAgbandje-McKenna博士的礼物）。PyMol对齐指令用于对齐各种结构。涉及氢键结合的原子对采用MolProbity在晶体结构坐标上计算，并采用KiNG图形软件直观显示kinemage·biochem·duke·edu。[0240]肝素亲和层析。将所示构建体采用与琼脂糖小球Sigma-Aldrich结合的硫酸肝素在4°C转动条件下培养1个晚上。将淤浆转移到微色谱柱Bio-Rad，并用RSS洗脱3次，然后采用日趋严格的NaC1洗脱。在调节溶液中已经存在的NaC1含量以后，将合适数量的NaC1溶于RSS中，配制溶液。收集所有洗脱组分。如上文所述，采用专门设计用于荧光素酶转基因的引物，对每次洗脱中包含的病毒粒子开展qPCR定量测定，从而测定每种洗脱组分中病毒的百分含量。[0241]人AATELISA检测。采用肝素化毛细管Sigma-Aldrich经后眼窝出血采集小鼠血液。采集后，立即将样品做成颗粒状，收集血清，并在-80°C贮存供以后使用。在出血之前，小鼠采用异氟烧气体麻醉。将96-孔板涂覆10mgmL兔子抗-人AAT抗体Sigma-Aldrich在4°C放1个晚上。然后，在室温采用血清稀释溶液含2.5%牛血清白蛋白和0.05%吐温的PBS洗涤和封闭1小时。将所示血清稀释溶液每个样品共IOOyL加入到板中，并在室温培养2小时。采用PBS洗涤4次后，在板中加入IOOyLHRP-结合山羊抗-人AAT抗体（10ugmL;Abcam室温培养1小时。进一步洗涤后，加入TMB底物Pierce显色，并加入10%H2S〇4终止。采用iMark酶标仪Bio-Rad读取光密度。采用这种方法无法检测鼠AAT。实例2rAAVl衣壳位置265突变提高骨骼肌转导[0242]在rAAV2衣壳位置264之后插入天冬氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸建立新位置265，将骨骼肌转导提高了一个数量级，我们假设rAAVl中位置265用D、E或F替换天然存在的苏氨酸将提高这种血清型的骨骼肌转导在此衣壳环中，rAAVl是比rAAV2长的一种氨基酸）。作为对照，从rAAVl删除T265，从而类似未修饰rAAV2。将包装鸡β-肌动蛋白启动子驱动萤火虫荧光素酶（CBA-Iuc转基因的rAAVl、rAAVlT265D、rAAVlT265E、rAAVlT265F和rAAVlT265del注射到鼠腓肠肌GC内，剂量是IelO病毒基因组vg。在注射7天后dpi开展活动物生物荧光成像，从而通过测定发射的光对转基因表达进行定量（图1A。与rAAVl相比，rAAVlT26®、rAAVlT265E和rAAVlT265F的转基因表达分别提高了28-倍、34-倍和36-倍，支持我们之前对rAAV2衣壳骨架的分析。令人吃惊的是，与rAAVl相比，rAAVlT265del将转导提高了大约200-倍。为了更好地了解这种现象，在本研究其它大多数分析中采用265删除突变体。[0243]为了证明用于产生上述数据的图像定量方法准确地表示了注射肌肉组织内的转基因表达水平，切除注射腓肠肌GC，进行均化裂解，并对组织裂解液开展体外荧光素酶分析。在此分析中，当归一化到每_克分析组织相对发射光单位时，与rAAVl相比，rAAVlT265del的转导效率提高了137-倍图1B100-倍）。不管怎样，所有265突变体都超过亲代血清型，其中rAAV6.3T265del时hAAT的血清浓度最大。实例7提高眼睛内的转导效率[0253]将AAV构建体经视网膜下SRI或玻璃体内（IV注射到采用氯胺酮甲苯噻嗪组合麻醉的小鼠中。在鸡抑几动蛋白启动子CBh条件下，所有AAV衣壳均包装报告基因荧光素酶。考察的构建体包括AAVlI-CBh、AAV1T265del1.1-CBh、AAV6T265del6.1-CBh、AAV6K531E6·3-CBh、AAV6T265del_K531E6·3·1-CBh，及我们实验室以前表征的AAV2变体、AAV2.52.5-CBhBowlesetal.，Mol.Ther.202:4432012。采用IVISIumina活动物成像系统，在注射后的所示时间点测定以荧光素酶活性衡量的转基因表达。按120mgkg体重腹膜内注射D-荧光素底物NanoIight后，对小鼠成像，按照IVIS生产商的说明，测定给定兴趣区域内的光子，对图像进行定量。结果如图9和图10所示。[0254]rAAV基因治疗的成功转化的挑战是体内转导效率低。本研究采用rAAV衣壳的结构分析来建立合理的工程策略，明确产生在骨骼肌内转导表型提高的新型衣壳变体。我们实验室的早期报告披露，VRl是rAAV2转导效率的关键决定因素，根据这一点，可以建立总方法。正如我们以前在rAAV2方面发现的那样，rAAVl中位置265处采用各种氨基酸替换，观察到转导得到提高。但是，引人注目的是，通过删除临床上更相关rAAVl的单个氨基酸破坏VR1，所得新型载体的转导提高了几个数量级（图1。仅这种现象对目前使用rAAVl的患者剂量方案具有非常重大的意义，可能向前推进载体生产的简单性。值得指出的是，rAAV6得到了类似的结果，但是仅在二次突变破坏前面表明赋予硫酸肝素结合活性的碱性氨基酸片区以后，才得到这种结果。通过分析衣壳序列同源性，可以采用标记补救方法，定义一起作用调节转导效率和主要受体辨别的两个衣壳表面远区，表明了衣壳拓扑在病毒生命周期期间的复杂作用。[0255]位置265和主要受体结合的对抗关系表明，265删除表型来源于衣壳和结合伙伴之间蛋白质：蛋白质相互作用的修饰。这种情况是在与细胞表面初步粘附时发生或在进入事件后发生还有待确认。与转基因表达有关的唯一可测量的关系是每个细胞载体基因组数量的增加，而不是表达动力学或寿命的增加，这一点强烈地表明265表型是细胞进入现象改变的结果。已经表明，VRl与rAAV2中的受体结合有关，以及与定向进化产生的嵌合载体有关，但是，这些相互作用性质的明确结构细节尚未定义。位置265相对包含三-倍对称轴的突起衣壳负责受体连接的的主要区域的空间关系为这种想法进一步提供了证据。值得注意的是，野生型和突变构建体在以下方面并未发现任何差别：1测试衣壳稳定性的热变性分析，2考察衣壳蛋白比例和尺寸的蛋白质印迹，或3探索衣壳拓扑或空病毒全衣壳总体分布明显差别的电子显微镜。此外，剂量数据表明，265转导提高可以用于各种临床应用例如，AATvs脂蛋白脂肪酶缺乏症）。[0256]众所周知的是，苏氨酸残基磷酸化影响细胞内蛋白质动力学。实际上，rAAV衣壳表面上的选择丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基磷酸化最终导致衣壳蛋白酶体在转基因递送之前被清除，将这些残基突变为无法磷酸化的残基，可以阻止衣壳清除，从而提高转导效率。位置265处几种不同类型的氨基酸苏氨酸删除、仿磷酸化或大体积疏水基替换都提高了转导，表明磷酸化不可能负责265突变调节的转导提高。此外，VRl的结构可以在整个环中被破坏，得到转导改善的表型。可能这些破坏将衣壳从与抑制蛋白的相互作用中释放出来，虽然这一点仍有待确认。但是，有证据表明rAAV2存在类似效应，其中衣壳肝素结合能力降低大幅改善了肌肉组织的转导265L实际上，本工作重现了这些数据。人们认为，rAAV2与硫酸肝素蛋白聚糖结合的能力通过病毒组织适应培养逐步发展，与所述受体结合对这种血清型的体内转导效应存在不利影响。同样，在腺病毒时，即使衣壳突变而不与其主要连接tethering受体CAR结合，也维持稳健的肝转导，因为衣壳的替代区能够通过促进与替代受体的生产性相互作用而补偿。[0257]特别是，转导效率在删除位置265后达到峰值。在分析rAAVl内VRl的氢键网络时图8A，值得指出的是，VRl通过主要由位置265编排的氢键网络稳定。实际上，次好的转导子是删除位置264和263得到的，这两者也通过这种网络参与VRl的结构稳定。当然，真正考察这些突变对VRl稳定性影响的唯一方法是分辨这些构建体的晶体结构。但是，非常重要的是，rAAV6在位置265附近的稳定性本身较差（图8B，实际中，rAAV6需要其它突变来复制位置265表型。许多研究试图阐明密切相关的rAAVl和rAAV6之间的表型差异例如，受体偏好和组织嗜性之间的差异）。几乎所有以前的研究都考察了这两种病毒不同的六种衣壳氨基酸，了解这些位置的精确定位能够分析直接影响病毒生命周期的衣壳区。虽然事实如此，但是，我们首次在此证明了这两种血清型结构水平不同的另外一个更精细的衣壳架构层调节病毒生物学以及合理设计探索这些属性的方法。[0258]直接考察注射组织内转基因表达即体外荧光素酶分析，产生137-倍提高vs分泌蛋白质转基因表达（即ELISA测定hAAT的浓度，产生9-倍提到）时，发现rAAVl和rAAVlT265del之间的转导提高测量值之间存在差异，这是另一个引人注目的发现。值得指出的是，在以前比较肌肉注射rAAV2、rAAV2.5和AAV226®分泌hAAT测量的实验中，ELISA方法并未发现任何明显差别，但是，当采用工程衣壳时，与rAAV2相比，荧光素酶表达数量级增加。同样，虽然已经发现，采用荧光素酶分析时，蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以将rAAV2在肝脏组织中的转导提高大约10-倍，但是，当测定分泌因子IX表达的血清型时，提高不到2-倍。由于，例如，细胞内环境VS血清内蛋白质半衰期的差异，以及蛋白质分泌相对蛋白质表达的总效率，因此，从收获组织直接测量转基因表达可能比先采集、然后测定分泌因子更灵敏。当设计rAAV载体，意味着递送编码分泌蛋白质的转基因时，这些发现突出了实现转化应用所需的转导急剧增加。[0259]这些努力的目标是持续改善rAAV载体技术，从而基因治疗成为更实际有效的临床选择，例如，降低实现治疗有益转基因水平所需的载体剂量。这种努力可能减少人们对有关剂量-依赖性毒性的临床关注及减轻临床-级载体的生产工作。在这里，我们提出了一个简单有效的策略，改善目前直接注射靶向骨骼肌的临床试验中采用的rAAV血清型的性能。由于这种策略利用对其它rAAV载体发展重大进步来说非常独特的衣壳区（例如，Tyr-to-Phe衣壳突变体），确定其是否能够与这些技术进步协同整合，进一步优化rAAV载体用于基因治疗，是非常有趣的。由于我们继续对我们的265突变体组全身施用后靶向和提高在心脏组织及全身骨骼肌中表达的潜力进行评估，此处的工作为下一代可翻译rAAV载体的开发提供了初步基础。此外，我们已经产生了一批rAAV衣壳试剂供进一步详细例如，结晶）分析，最终将更全面了解单个氨基酸在rAAV载体生物学中独特且重要的作用。实例8材料和方法[0260]质粒和病毒:所有质粒都来自北卡罗来纳大学基因治疗中心载体核心设施。如前文所述，病毒通过HEK293细胞三次转染，并通过氯化铯密度超速离心法提纯产生Griegeretal.，Nat.Protoc.13:14122006。采用下述设计用于识别荧光素酶转基因的引物集，采用实时定量PCRqPCR分析，测定病毒滴度：（正向）5’-AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3’（SEQIDN0:10和（反向）5’-CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3’（SEQIDNO:11。对每个实验小组来说，相关病毒构建体在使用前采用同一qPCR板滴定。采用定点突变（StratageneQuikChange进行核苷酸删除或替换。表9列出了创建本研究中所有VRl突变体采用的引物序列。在制备病毒之前，先开展DNA测序，确认本研究中使用的每个质粒的序列一致性都是正确的。表9本研究中使用的定点突变引物。*表明PXRl和PXR6构建体采用相同的引物序列。[0261]结构分析和分子建模：所示pdb文件通过M〇IPr〇bity结构验证软件molprobity.biochem.duke.edu处理，必要时，通过包含AsnGlnHis翻转开展H-键优化，根据电子云x-H键长度，添加氢键。然后，针对文件分析所有原子接触和几何形状，并在KiNG中直观显不（kinemage·biochem·duke·edu，确定参与氢键的VRl原子。然后，在PyMolpymol.org中打开PDB，以氢直观显示的棒图表示，而且KiNG中鉴定的氢键采用该测量转化为短划线。[0262]活动物研究:所有动物均按照美国国立卫生研究院指南，遵照北卡罗来纳大学教堂山分校IACUC批准的协议维持和处理。将包装CBA-荧光素酶转基因的rAAV变体按指示剂量注射到6-8周大雌性BALBc小鼠（JacksonLaboratories的尾静脉内。每次注射总体积200yL采用IXI3BS使体积达到200yL。在按120mgkg体重注射D-荧光素底物Nanolight后，米用XenogenIVISLumina成像系统（PerkinElmerCaliperLifeSciences直观显不焚光素酶转基因表达。米用LivingImage软件（PerkinElmerCaliperLifeSciences开展生物荧光图像分析。[0263]转基因表达和拷贝数体外定量:为了获取用于体外荧光分析的组织样本，在注射10天后处死小鼠，并收获指示器官和进行急速冷冻。采用刀片将组织在冰上均化，然后，将大约50mg组织匀浆悬浮在250yL2X被动裂解缓冲液Promega中，采用组织匀浆机Cole-Parmer机械裂解。然后，将35yL组织裂解液转移到96-孔板中，并与IOOyLD-荧光素底物Promega混合，然后，马上采用Victor2发光计PerkinElmer开展发光分析。组织裂解液的总蛋白浓度采用Bradford分析Bio-Rad测定。此外，采用DNeasy试剂盒Qiagen处理〜25mg上文产生的组织匀浆，提取宿主和载体基因组DNA。细胞数量利用专为小鼠核纤层蛋白管家基因）设计的下述引物，采用qPCR测定：（正向）5’-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3’（SEQIDN0:45和（反向）5’-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC-3’（SEQIDN0:46。如上文所述，每个细胞病毒基因组的数量利用专为荧光素酶转基因设计的引物，采用qPCR测定。实例9rAAV衣壳结构分析，用于鉴定VRl中的氢键网络[0264]我们前面已经证明，删除rAAVl衣壳VRl内的选择氨基酸导致小鼠肌内注射后转导效率呈对数级增加Warischalketal.，Mol.Ther.2015^AAVl晶体结构分析表明，大多数有效VRl删除突变与参与环内氢键网络的氨基酸对应，表明VRl结构元件失稳导致转导表型提高。本研究的目的是确定：1肌内注射后，rAAVIVRl突变体衣壳是否可有效地靶向肌肉组织vs仅转导提高表型），及2VRl结构元件的靶向失稳是否是改善其它rAAV血清型转导的保守方法。为了解决这些问题，采用开放源结构验证软件MolProbityDavisetal.，NucleicAcidsRes.35WebServerissue:W3752007和KiNG中直观显示的VRl氢键图Chenetal.,ProteinSci.1811:24032009，分析了包括rAAVl、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8和rAAV9的一组rAAV衣壳（图11A-11H。根据衣壳晶体结构数据（Govindasamyetal.，J.Virol.8023:115562006;Milleretal.,ActaCrystallogr.Sect.FStruct.Biol.Cryst.Commun.62Pt12:12712006；Xieetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9916:104052002；Lerchetal.,Virology4031:262010；Govindasamyetal.,J.Virol.8720:111872013；Xieetal.,ActaCrystallogr.Sect.FStruct.Biol.Cryst.Commun.64Pt11:10742008；Nametal.,J.ViroI.8122:122602007；Mitche11etal.,ActaCrystalIogr.Sect.FStruct.Biol.Cryst.Commun.65Pt7:7152009和预先存在的它们体内转导表型资料Zincarellietal.,Mol.Ther.166:10732008的获得性，选择这些血清型进行分析。rAAV7没有公开可以获得的结构资料;但是，为了完整起见，在分析中纳入了这种血清型。为了直观化简单起见，然后，将鉴定的氢键模式转化为PyMol图像图12A-12H。[0265]根据这些分析，选择每种血清型中被发现参与环内VRl氢键网络的氨基酸用于删除。表10列出了血清型rAAVl-rAAV9的VRl氨基酸序列及本研究中选择用于突变的氨基酸，以及每个突变假设破坏了多少个氢键。在rAAV7的情况下，根据以前得到的rAAVl的结果Warischalketal.，Mol.Ther.2015，选择了位置265处的苏氨酸突变。在rAAV9的情况下，VRl的结构似乎通过两个位置的氢键稳定，第一个氢键主要由源自残基S263附近的键编排，第二个氢键通过残基S265附近的键编排。因此，除双突变体rAAV9S263del_S265del之夕卜，创建了包含rAAV9S263del和rAAV9S265del的突变体衣壳。但是，双删除突变体无法产生完整的病毒粒子，替代策略是将突变位置S263突变为丙氨酸，同时删除位置S265,创建rAAV9S263A_S265del。关于此研究所有血清型氢键关系的详细原子说明，参考图11图例。表10rAAVl-rAAV9可变区1的氨基酸序列和删除突变。+表示突变后假设破坏的氢键数量。实例10突变后VRl中氢键网络失稳的rAAV衣壳的生物分布[0266]为了直观显示上文详细描述的野生型衣壳和VRl突变体衣壳的组织分布和转导效率，以上组合中的每个成员都采用鸡β-肌动蛋白启动子驱动萤火虫荧光素酶CBA-Iuc报告转基因包装，并经尾静脉注射到小鼠体内，每次注射的剂量是Iell病毒基因组vg。在注射9天后，开展活动物生物荧光成像。注射10天后，处死小鼠，切除选择器官，并进行均化和裂解。然后，对组织裂解液开展体外荧光素酶分析，对载体生物分布进行定量，从而测定转基因表达，并开展qPCR分析，对每个细胞的病毒基因组拷贝数量进行定量。VRl氨基酸的删除导致四种表型：1选择性和稳健地靶向心肌与或骨骼肌，如rAAVl和rAAV6观察到的那样图13;2维持先天性心肌与或骨骼肌转导效率，大幅降低肝脏转导，如rAAV7、rAAV8和rAAV9中看到的那样（图14;3广泛缺乏转导，如rAAV2和rAAV3所示（图15A-15B;及4无法产生完整的病毒粒子，如:rAAV4和rAAV5所不。[0267]rAAVl和rAAV6衣壳的VRl突变导致心肌和骨骼肌组织转导效率大幅增加（图13。与rAAV1相比，采用rAAVIT265de1处理的小鼠心脏组织样本测定的转基因表达高21-倍，腓肠肌GC组织样本高26-倍。其它几种组织包括膈26-倍）、脾3.5倍）、肾（5-倍）、胰腺6-倍及肺8-倍）中rAAVlT265del的转导效率也得到提高（图16A。令人吃惊的是，与rAAVl相比，肝脏转导降低3.5倍（图13B。类似地，心肌和GC中转导的rAAV6T265del比野生型rAAV6高14-倍和3-倍，而肝脏中的转导低28-倍（图13E。在测试的任何其它组织中，rAAV6和rAAV6T265del衣壳测定的转基因表达并未表现出明显的差别（图16BF突变，提高VRl突变衣壳的心脏趋性[0279]已经证明，rAAV衣壳表面的选择酪氨酸残基突变通过避免细胞内衣壳到达细胞核之前发生磷酸化和最终发生蛋白酶体降解，从而提高了rAAV转导效率（Zhongetal.，Virology3812:1942008。我们想要确定这些突变是否与VRl突变衣壳协同作用，提高转导效率，同时维持VRl突变赋予的生物分布表型。由于rAAVl是将心脏和骨骼肌疾病治疗人类研究进行转化时使用最多的血清型（Flotteetal.，Hum.GeneTher.2210:12392011!Greenbergetal.，JACCHeartFail.2I:842014，因此，创建包含Y445F和T265del突变的rAAVl衣壳。虽然以前并未在rAAVl背景下对酪氨酸-至-苯丙氨酸突变进行评价，但是，已经证明，肌内注射Y445F后提高rAAV6的转导效率（Qiaoetal.,Hum.Gene1^12110:13432010。^厶¥1和以厶¥6的衣壳蛋白序列的同源性99%数16七1·，J.Virol.8022:113932006，因此，预期这种突变的作用与rAAVl类似是合理的。虽然如此，还是将rAAV6纳入本分析中。制备包装CBA-Iu的野生型rAAVl和rAAV6衣壳，同时制备T265del和Y445F单突变和双突变衣壳。经尾静脉向小鼠注射Iellvg这些衣壳，注射10天后，切除心脏、肝脏和GC组织样本进行分析。在这两种血清型中，T265del_Y445F双突变衣壳进一步改善了心脏转导效率。rAAVlT265del_Y445F的心脏转导分别是rAAVl和rAAVlT265del的66-倍和9-倍（图23A，而rAAV6T265del_Y445F的心脏转导是rAAV6和rAAV6T265del分别的30-倍和3-倍。T265del_Y445F双突变导致GC组织的影响发生变化，其中与rAAV6T265del相比，rAAV6T265del_Y445F提高3.5-倍（图23B，而rAAVl各突变体之间几乎相同。在这两种血清型中，VRl突变衣壳导致的肝脏脱靶在Y445F突变中完全得到保持。奇怪的是，静脉内递送后，仅Y445F突变无法提高rAAVl或rAAV6的转导效率，虽然细胞培养实验中，与野生型衣壳相比，该突变体显著提高了转导效率。据我们了解，以前并未对这些突变体静脉注射到小鼠体内后进行评价，因此，很难推测它们在这种递送途径时无法超过其亲代的原因。也许，要成功越过血管屏障，需要位置445的酪氨酸残基。总之，这些数据表明，在VRl突变衣壳中纳入Y445F可以进一步增强心脏转导，同时维持肝脏脱靶生物分布特点。[0280]我们在此提供一种新的衣壳工程方法，可用于改善全身递送rAAV的打靶和转导。以前的观察表明，通过删除选择氨基酸，破坏rAAVl衣壳环VRl的稳定性，在肌内注射后明显改善了骨骼肌转导Warischalk，J.K.a.S.，Mol.Ther.2015。提高转导最有效的突变与破坏VRl环内氢键网络最多的突变有关。这些观察引导我们探索rAAVl中VRl靶向失稳是否诱导静脉内施用后优先靶向肌肉组织，及这种方法是否可用于工程制备产生类似结果的其它rAAV血清型。在研究的9种血清型中，我们的策略在提高生物分布性质方面对五种血清型有效。在rAAVl和rAAV6衣壳中，观察到它们在心脏与或骨骼肌组织转导方面的作用稳健提高，而在rAAV7、rAAV8和rAAV9衣壳中，它们在肌肉组织中维持天然转导水平，而在肝脏中的转导效率显著下降。我们注意到其它血清型VRl突变后的明显不良影响，包括rAAV4和rAAV5无法产生完好的病毒粒子及rAAV2和rAAV3b严重缺乏转导。因此，我们的方法提供了对衣壳拓扑的功能洞察，当设计新载体时，可以系统采用或避免采用。[0281]在几乎每类蛋白质包括许多病毒）中，蛋白质氢键网络都调节功能和结构动力学例如，参见Worthetal.，BMCEvol.Biol.l0:1612010。但是，除获得经验结构数据外，目前仅相关证据支持氢键失稳是改善本研究中VRl突变衣壳表型的推动因素。但是，这些证据确实为这种假设提供了合理的支持。首先，这种策略在试验的大多数血清型中有效。其次，rAAV6残基S262和T265构成一起作用的氢键对，从而稳定其它VRl图11F，删除这些残基中的任一个残基都导致相当的生物分布表型（图16C。第三，VRl稳定性似乎取决于rAAV9中氢键伙伴的两个不同组（图11H，仅在它们两者都突变后，才得到期望的肌肉-趋性生物分布表型（图14G;任一个残基单独突变都是无效的（图17D。最后，在rAAV8中，VRl中仅存在一个氢键:位置T265氨基酸侧链氢与本身结合的氢键（图11G。虽然删除T265导致肝脏大幅脱靶（图14E，但删除附近的S266并未出现这种现象（图24。综合VRl失稳对rAAV2、rAAV3b、rAAV4和rAAV5的破坏性影响，证据表明，这种衣壳环精确定义的结构在其生命周期内高度影响rAAV的生产进步。[0282]虽然破坏VRl结构明显导致载体系统性质提高，但仍然不清楚影响这些新表型的机理的其它细节。已经发现，氢键对控制各种病毒的衣壳稳定性和感染效率Tipperetal.J.Virol.8818:102892014；Tsoetal.,J.Mol.Biol.42610:21122014；Rueetal.,J.Virol.7714:80092003;Speiretal.,J.Virol.807:35822006，并另外假设调节rAAV组装Griegeretal·，J.Virol.8011:51992006。但是，设计用于测定rAAV衣壳稳定性的热分解方案Horowitzetal，J.Virol.87⑹：29942013表明，野生型和VRl突变衣壳之间并没有区别。此外，仅衣壳可分离性增加似乎不可能导致载体生物分布广泛变化。rAAV的VRl环位于暴露衣壳表面各单体亚单位之间交界处，因此，可能与其它蛋白质相互作用。众所周知，衣壳内氢键网络调节衣壳与结合伙伴的相互作用，例如，在流感神经氨酸酶聚糖催化（vonGrafensteinetal.，J.Biomol.Struct.Dyn.33l:1042015、人多瘤病毒受体结合Khanetal.，J.Virol.8811:61002014，及HIV-2引起的抗病毒因子TRIM5a侵入Miyamotoetal.,PLoSOne67:e227792011期间。因此，VRl突变可以改变衣壳稳定性，从而防止衣壳与优选细胞表面受体相互作用，实现替代进入细胞核。正如突变衣壳递送到心肌细胞的载体基因组的表达远比野生型衣壳递送的载体基因组更高效这一发现所示，小鼠施用VRl删除突变衣壳后肝脏载体基因组数量一致减少，支持了这种说法。此外，这种概念并非没有先例，因为当衣壳突变，消除肝素结合时，rAAV2表现出肌肉革巴向改善和肝脏转导降低Asokanetal.,Nat.Biotechnol.281:792010;Kernetal.，J.Virol.7720:110722003。当突变减少半乳糖结合时，rAAV9还显示出肝脏脱靶，系统地提高了表型（Shenetal.，J.Virol.8619:104082012。值得指出的是，已经表明，VRl突变减少了rAAV2和rAAV6衣壳与硫酸肝素结合的能力Warischalketal.，Mol.Ther.2015。此外，VRl的N-末端区位于衣壳上，距离rAAV9半乳糖-结合点足够近〈3A，两个区之间的直接相互作用是可行的（Belletal.，J.Virol.8613:73262012。这些观察带来了有趣的问题:鉴定用于体外不同rAAV血清型的受体是否是有潜力的细胞培养传代人工产物，如果这些人工产物突变消融的话，rAAV是否具有比以前认为强大很多的体内转导潜力。[0283]从结构方面来看，VRl删除突变使rAAV4和rAAV5无法产生完好的病毒粒子的现象是直接的。在这两种血清型中，VRl构成相对较短的环，主要是与下面β-折叠连接的氢。因此，破坏衣壳此区域的稳定性可能导致总体结构变化，阻止衣壳单体彼此相互作用。VRl删除突变导致rAAV2和rAAV3b转导缺乏的原因还不清楚。尽管无法转导小鼠组织，但是，rAAV2S264del和rAAV3bS262del能够转导培养细胞。因此，小鼠组织任何转导缺乏来源于体内环境的某个方面。将来的实验将进一步剖析这些现象。但是，VRl氨基酸删除无法改善rAAV2并非一无是处，因为它导致一个偶然发现，即在VRl中插入天冬氨酸，产生与删除突变相反的表型：在全身施用载体后，稳健提高肝脏转导。目前尚不了解控制VRl插入突变行为的机械细节。天冬氨酸是人们熟悉的仿磷酸，因此，可能在细胞内重新定向衣壳输送。实际上，人们已经建议对丝氨酸和苏氨酸磷酸化用于标记rAAV衣壳，用于蛋白酶体降解Gabrieletal.，Hum.GeneTher.Meth.242:802013。但是，开放源磷酸化-位点预测软件NetPh〇s2.0并未表明VRl修饰或未修饰作为磷酸化位点，利用蛋白酶体抑制剂的细胞培养实验的数据并不支持265D突变衣壳的表型是蛋白酶体清除减少的结果。另一种可能性是VRl中插入天冬氨酸产生与氨基酸删除相反的效果:稳定VRl结构，而非破坏其结构。人们熟悉天冬氨酸残基通过参与蛋白质内相互作用，如羰基叠加Deaneetal.,ProteinEng.l212:10251999、盐桥（Speareetal.，J.Biol.Chem.27814:125222003和氢键网络Worthetal.，BMCEvol.Biol.lO:1612010稳定蛋白质结构的影响。如果确实如此的话，可以想象，虽然VRl删除突变使衣壳此区域失稳，从而阻止给定受体的相互作用，相反的是，VRl插入天冬氨酸增强了衣壳结构稳定性和由此得到的蛋白质：蛋白质相互作用。大多数265D突变衣壳提高肝脏和GC内载体基因组的数量，表明265D突变提高了细胞进入。但是，在肝脏转导时这似乎比较有利，在265D突变情况下，GC转导效率并未得到提高，表明衣壳的吸附后处理也受到突变的影响。[0284]总之，我们的研究对rAAV衣壳的VRl区对转导效率和体内组织打靶的影响提供了新结构观点。这些观点允许开发两种合理的保守工程策略，在全身施用载体后改善组织打靶。首先，VRl删除突变衣壳组合似乎与临床更相关，因为开发了6种新载体，其打靶心脏的水平等于或超过rAAV9。虽然这是rAAV载体学方面真正有价值的进步，但是，不应忽视265D突变衣壳组合的临床价值。虽然rAAV8—直被认为是小鼠模型最好的肝脏转导子Davidoffetal.，Mol.Ther.11⑹：8752005，虽然在我们的研究中，265D衣壳组合无法超过rAAV8,但值得指出的是，rAAV8可能并非转化人类基因治疗应用最理想的载体。实际上，人们已经发现，rAAV2和rAAV3b变体感染人类肝细胞的效率超过rAAV8Lisowskietal.，Nature，5067488:3822014。因此，我们的VRl突变衣壳组合能够扩展肌肉-或肝脏-定向基因治疗应用的试剂组合。我们希望这种扩展能够使基因治疗个性化更好地向前推进，也许使患者现有的中和抗体谱Louisetal.，Hum.GeneTher.Meth.242:592013帮助选择最适合的血清型，满足各自的需求，必要时提高重新施用载体的能力。[0285]上述说明是为了阐明本发明，不应视为限制本发明。本发明由下述权利要求定义，与所述权利要求相当的内容也包括在本发明中。

权利要求：1.一种细小病毒衣壳蛋白，包括来自腺相关病毒AAV血清型或T=1二十面体衣壳结构的任何其它细小病毒的衣壳蛋白氨基酸序列，其中可变区IVRl的环包括AAVl衣壳蛋白氨基酸残基258至272或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基，所述可变区1的环通过删除与或替换一个或多个氨基酸残基进行修饰，由于所述残基编排的氢键模式被靶向破坏，导致环内区域失稳，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述修饰衣壳蛋白使包括所述衣壳蛋白的病毒载体的转导效率与或修饰组织特异性得到提高。2.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAVl衣壳蛋白氨基酸残基258至272中的一个或多个氨基酸残基或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。3.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAVl衣壳蛋白氨基酸残基261至269中的一个或多个氨基酸残基或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。4.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中AAVl衣壳蛋白的氨基酸残基265或另一个AAV或细小病毒衣壳蛋白的相应氨基酸残基被删除。5.根据权利要求1所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与硫酸肝素结合的AAV血清型或其它细小病毒的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。6.根据权利要求5所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列。7.根据权利要求5所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV6血清型的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基531被替换，从而大幅减少与硫酸肝素的结合。8.根据权利要求7所述的衣壳蛋白，其中所述氨基酸残基531被谷氨酸替换。9.一种腺相关病毒AAV衣壳蛋白，包括来自AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8血清型的氨基酸序列，其中调节衣壳蛋白与硫酸肝素结合的一个或多个氨基酸残基被替换与或删除，其中所述衣壳蛋白与硫酸肝素的结合大幅减少。10.根据权利要求9所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAV6血清型的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基531被替换，从而大幅减少与硫酸肝素的结合。11.根据权利要求10所述的衣壳蛋白，其中所述氨基酸残基531被谷氨酸替换。12.根据权利要求1-11任一项所述的衣壳蛋白，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述衣壳蛋白的肌肉转导提高了至少大约10%。13.根据权利要求1-12任一项所述的衣壳蛋白，其中与包含未修饰衣壳蛋白的病毒载体相比，所述衣壳蛋白的肝脏转导提高了至少大约10%。14.根据权利要求1-13任一项所述的衣壳蛋白，其中至少一个酪氨酸残基被替换，从而改善了心肌转导效率。15.根据权利要求14所述的衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括来自AAVl或AAV6血清型的氨基酸序列，酪氨酸替换是Y445F。16.编码权利要求1-15任一项所述衣壳蛋白的多核苷酸。17.包含权利要求1-15任一项所述衣壳蛋白的细小病毒衣壳。18.—种病毒载体，包括：a权利要求17所述的细小病毒衣壳;及⑹包含重组病毒模板的核酸，其中所述核酸被所述细小病毒衣壳包裹。19.根据权利要求18所述的病毒载体，其是一种AAV载体。20.根据权利要求18或19所述的病毒载体，其中所述病毒载体对骨骼肌、心肌与或膈肌表现出系统嗜性。21.根据权利要求20所述的病毒载体，其中所述病毒载体对骨骼肌表现出系统嗜性。22.根据权利要求18-21任一项所述的病毒载体，其中与包含野生型衣壳蛋白的病毒载体相比，所述病毒载体的肝脏嗜性降低。23.根据权利要求18-21任一项所述的病毒载体，其中与包含野生型衣壳蛋白的病毒载体相比，所述病毒载体的肝脏嗜性提高。24.—种在药学上可接受载体中包含权利要求18-23任一项所述病毒载体的药物组合物。25.—种将核酸递送至细胞的方法，所述方法包括在足以使核酸进入到细胞内的条件下将所述细胞与权利要求18-23任一项所述病毒载体或权利要求24所述药物组合物接触。26.—种将核酸递送至受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求18-23任一项所述的病毒载体或权利要求24所述的药物组合物。27.—种将核酸递送至受试者的方法，所述方法包括向受试者施用已经在足以使核酸进入到细胞内的条件下与权利要求18-23任一项所述病毒载体或权利要求24所述药物组合物接触的细胞。28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。29.根据权利要求26-28任一项所述的方法，其中所述受试者患有下述疾病或存在患下述疾病的风险:肌肉萎缩症、杜氏肌肉萎缩症、贝克型肌肉萎缩症、血友病A、血友病B、多发性硬化、糖尿病、高雪设、法布瑞氏症、庞贝氏症、癌症、关节炎、肌肉萎缩、心脏病、先天性心脏衰竭、外周动脉疾病、内膜增生、神经疾病、癫痫、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、囊性纤维化、地中海贫血、贺勒氏症、斯赖综合征、贺勒氏症、贺勒氏-施艾氏症、亨特氏综合征、沙费利波综合征A、B、C、D、莫基奥综合征、马尔多-拉米综合征等、克腊伯氏病、苯丙酮酸尿症、巴藤病、脊髓大脑共济失调、LDL受体缺陷、高氨血症、贫血、关节炎、视网膜变性疾病、黄斑变性和腺苷脱氨酶缺乏症。30.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述病毒载体或药物组合物施用于骨骼格、心肌与或膈肌。31.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述病毒载体或药物组合物施用于眼睛。32.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述病毒载体或药物组合物施用于大脑。33.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述病毒载体或药物组合物经静脉内施用。34.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述受试者患有肌肉萎缩症或存在患肌肉萎缩症的风险。35.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述受试者患有心脏病或存在患心脏病的风险。36.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述受试者患有充血性心力衰竭或外周动脉疾病或存在患这些病的风险。37.根据权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述受试者患有代谢病或存在患代谢病的风险。38.—种产生重组细小病毒粒子的方法，包括向允许细小病毒复制的细胞提供：a重组细小病毒模板，包括⑴异源核酸，及ii至少一种反向末端重复序列;及b多核苷酸，包括复制蛋白编码序列和编码权利要求1-15任一项所述衣壳蛋白的序列；在足够复制和包装重组细小病毒模板的条件下；从而在细胞中产生重组细小病毒粒子。

百度查询： 北卡罗来纳大学教堂山分校 增强细小病毒载体递送的修饰衣壳蛋白

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