申请/专利权人：中国医科大学

申请日：2017-10-26

公开（公告）日：2023-05-30

公开（公告）号：CN109706115B

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.30#授权;2019.05.28#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：本发明涉及小鼠干细胞培养技术，具体说是一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法。包括骨髓提取、间充质干细胞原代培养、传代培养、冷冻保存、复苏、细胞表面分子鉴定、向脂肪细胞以及成骨细胞分化鉴定。其中所采用的细胞培养液为低糖DMEM基础细胞培养液中添加胎牛血清。建立的间充质干细胞细胞系形态为成纤维细胞样，本发明方法操作简单，重复性高，所建立的细胞系可以连续传代，能提供大量的间充质干细胞，并且可向脂肪细胞和成骨细胞分化，可直接用于小鼠功能基因的研究。不仅可望成为干细胞功能与调控机制的研究平台，而且可促进基于间充质干细胞组织工程的实际应用。

主权项：1.一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，其特征在于：1）配制细胞培养液：以DMEM培养液为基础再加入占细胞培养液总体积20%胎牛血清，100UmL青霉素，100μgmL链霉素和1%谷氨酰胺，于4℃下保存备用；2）原代培养：取6-8周龄小鼠，颈椎脱臼法处死，经75%酒精喷湿小鼠腹部，取出双侧腿骨，置于含75%酒精的离心管中浸泡5分钟；浸泡后用无菌纱布擦拭腿骨，小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入含5mLDPBS的直径为60mm的无菌培养皿中，剪去腿骨两端，用DPBS冲洗出骨髓，反复吹打使细胞打散，静置3min，取70mm无菌滤器过滤至50mL离心管，300g离心10min，弃上清，待用；向小鼠骨髓中加入步骤1）配制细胞培养液得到悬浮细胞液，而后将悬浮细胞液于37℃、含5%的CO2和5%的O2的混合气体下培养，培养4天后弃掉培养液，再加入步骤1）配制的细胞培养液继续培养；3）传代培养：待上述原代培养细胞贴壁融合至第10天时，加入含0.25%浓度的胰蛋白酶进行消化细胞，而后利用步骤1）配制的细胞培养液，以1:1对细胞进行首次传代培养，之后每5-7天以1:2或1:3进行传代，直至第20代；进而小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系建立成功；所述DMEM培养液中葡萄糖含量为1500mgL；所述胎牛血清为经过二次过滤的胎牛血清；小鼠骨髓间充质干细胞细胞系构建时，细胞培养箱中含5%O2并于4天后首次更换培养液。

全文数据：一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法技术领域本发明涉及小鼠干细胞培养技术，具体说是一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法。背景技术动物模型是生物医学研究中不可或缺的工具。有研究统计显示，91％的文献使用各种品系的小鼠，7.6％的文献使用大鼠，只有不到2％的文献使用兔子、白鼬、豚鼠和恒河猕猴作为模式动物。利用常用的动物模型-小鼠，培养与构建细胞系是进行细胞生物学、发育生物学、毒理学、免疫学以及组织工程学研究的基础。间充质干细胞Mesenchymalstemcells,MSCs是人们研究最深入的干细胞种类之一，而骨髓Bonemarrow,BM是MSCs的一个重要来源。BM-MSCs是一种具有高度增殖和分化潜能的干细胞，常维持在低分化状态，既可参与损伤组织修复，也在各类疾病发生中发挥重要作用。在一定条件诱导下可分化为多种组织细胞，如：成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及肌肉细胞等。BM-MSCs的培养及细胞系构建，是进行干细胞功能基因研究的重要辅助手段。小鼠BM-MSCs的培养及鉴定，虽然有见报道，但是由于骨髓中间充质干细胞含量低、混有大量的造血干细胞、操作者及培养系统的不同以及没有特异性的细胞表面表达分子，因而使这项技术成为研究小鼠骨髓间充质干细胞的首要难题。虽然有通过密度梯度离心、流式细胞仪或者免疫磁珠等方法对小鼠BM-MSCs进行分离纯化，但是由于上述技术成本较高、过程繁琐、对细胞活性影响较大，所以未被广泛使用。目前使用较多的是差速贴壁法和密度梯度离心法，但分离出的骨髓间充质干细胞中都有不同程度混杂有其他细胞。密度梯度离心法分离的原代细胞相对较纯，但是操作较为繁琐，同时增加污染机会，不适用于连续传代和长期培养。目前基于差速贴壁法提取小鼠BM-MSCs没有较全面详细的描述，更未见构建细胞系。发明内容本发明的目的是针对目前小鼠间充质干细胞提取培养方法复杂、重复性差的问题，提供一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为：一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，1配制细胞培养液：以DMEM培养液为基础再加入占细胞培养液总体积20％胎牛血清，100UmL青霉素，100μgmL链霉素和1％谷氨酰胺，于4℃下保存备用；2原代培养：向小鼠骨髓中加入步骤1配制的细胞培养液得到悬浮细胞液，而后将悬浮细胞液于37℃、含5％的CO2和5％的O2的混合气体下培养，培养4天后弃掉培养液，再加入步骤1配制的细胞培养液继续培养；3传代培养：待上述原代培养细胞贴壁融合10天时，加入含0.25％浓度的胰蛋白酶进行消化细胞，而后利用步骤1配制的细胞培养液，以1:1对细胞进行首次传代培养，之后每5-7天以1:2或1:3进行传代，直至第20代；进而小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系建立成功；其中，加入1ml25cm2底面积含0.25％浓度的胰蛋白酶消化细胞。所述DMEM培养液中葡萄糖含量为1500mgL；所述胎牛血清为经过二次过滤的胎牛血清。所述小鼠骨髓为取6-8周龄小鼠，颈椎脱臼法处死，经75％酒精喷湿小鼠腹部，取出双侧腿骨，置于含75％酒精的离心管中浸泡5分钟；浸泡后用无菌纱布擦拭腿骨，小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入含5mlDPBS的直径为60mm无菌培养皿中，剪去腿骨两端，用DPBS冲洗出骨髓，反复吹打使细胞打散，静置3min，取70μm无菌滤器过滤至50mL离心管，300g离心10min，弃上清，待用。所述剪去腿骨两端，用注射器吸取DPBS，从股骨或胫骨中冲洗出骨髓，直至骨发白每只小鼠的每一个股骨或胫骨需要用3-4mlDPBS冲洗。本发明所具有的优点如下：本发明通过优化操作方法提高BM-MSCs纯度、维持非分化状态、保持分化潜能、可连续传代培养，不仅可以为干细胞在基础医学的研究中提供平台，也为组织工程学中的组织器官修复与代替开辟一条新的路径，具体为：1.采用本发明方法构建的小鼠骨髓间充质干细胞细胞系可以进行连续传代，目前已传至20代，其能提供大量的间充质干细胞，细胞形态为长梭形的成纤维上皮样，生长曲线正常，其中，CD29、CD44和Sca-1呈阳性表达，CD11b、CD19和CD45呈阴性表达。而且，以脂肪分化诱导培养液以及成骨分化诱导培养液进行诱导培养，细胞可向脂肪细胞以及成骨细胞分化。2.本发明方法易于操作、方法简便，可以将小鼠骨髓来源细胞经原代培养和传代培养的方式，获得可以连续传代且能维持非分化状态、具有良好生长状态、纯度较高的间充质干细胞，并通过提供给细胞更接近于体内生理状态的生存环境，使细胞更易保持其生物学特性。具体是指本发明中的骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法操作简单，重复性强，较之前报道的其他间充质干细胞细胞系建立中的密度梯度离心、流式细胞仪或者免疫磁珠等原代培养方法更容易掌握和操作。附图说明图1为本发明实施例提供的相差显微镜下原代培养和传代培养的小鼠骨髓间充质干细胞图，其中A为骨髓间充质干细胞原代图100×，B为骨髓间充质干细胞13代图100×。图2为本发明对比例提供的骨髓间充质干细胞的生长曲线图，其中A为21％，10％和5％氧浓度下细胞生长曲线图，B为首次换液时间为1天和4天的细胞生长曲线图。图3为本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞细胞表面分子表达图。图4为本发明实施例提供的诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化图，其中A为第2代骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞图100×，B为第2代骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞图200×，C为第12代骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞图100×，D为第12代骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞图400×。图5为本发明实施例提供的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化图，其中A为第2代骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞图100×，B为第2代骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞图200×，C为第12代骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞图100×，D为第12代骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞图400×。具体实施方式下面结合附图和实施实例对本发明做进一步的解释说明。本发明对目前的C57BL6小鼠骨髓间充质干细胞细胞系构建方法进行了优化，构建方法操作简单，重复性强，较之前报道的其他小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的建立方法更容易掌握和操作，应用价值极大，为多领域实验研究提供了基础生物材料和技术支持。实施例1小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系的建立方法，步骤如下：1配制细胞培养液：取低糖1500mgL葡萄糖DMEM培养液，向培养液中加入占细胞培养液总体积20％二次过滤的胎牛血清，100UmL青霉素，100μgmL链霉素，1％谷氨酰胺，于4℃下保存备用。2骨髓提取：取6-8周龄小鼠，颈椎脱臼法处死，75％酒精喷湿小鼠腹部，取出双侧腿骨，置于含75％酒精的离心管中浸泡5分钟。无菌纱布擦拭腿骨，小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入含5mlDPBS的直径为60mm的无菌培养皿中。无菌条件下剪去腿骨两端，用1mL注射器抽取DPBS反复冲洗骨髓腔至15mL离心管中，直至骨发白。反复吹打使细胞打散，静置3min，取70μm无菌滤器过滤至50mL离心管。300g离心10min，弃上清。3原代培养：弃去上清后加入1mL步骤1配制细胞培养液悬浮细胞，而后将悬浮液转至培养瓶中于含5％CO2、21％O2或者10％、5％O2的37℃培养箱中培养。1天或者4天后弃掉培养瓶中的培养液，加入5mL步骤1配制的细胞培养液继续培养。4传代培养：待上述原代培养细胞贴壁融合至第10天时，加入1ml25cm2底面积含0.25％浓度的胰蛋白酶进行消化细胞而后利用步骤1配制细胞培养液使细胞悬起进行传代培养，以1:1进行传代。第一次传代后，待细胞长满瓶底，以1.6×106个细胞cm2密度进行1:2或者1:3进行传代，以后5-7天传代1次，直至第20代。进而细胞系建立成功。目前该细胞系已经传至20代。细胞已能稳定增殖。该细胞系主要细胞类型为长梭形的类上皮样细胞如图1A、B所示。实施例2小鼠骨髓来源间充质干细胞培养时氧气浓度对比1细胞培养时氧气浓度设置根据实施例1中步骤3，将提取的原代细胞置于氧浓度为5％、10％或21％的37℃培养箱中培养，4天后弃掉培养瓶中培养液，加入5mL步骤1配制的细胞培养液继续培养。待细胞贴壁融合至第10天时进行传代培养，传代培养具体过程参照实施例1中步骤4。2细胞生长曲线绘制为了分析培养于不同氧气含量下的间充质干细胞的生长情况，取第2代细胞，按照1×104个细胞孔的密度在96孔板中接种，将细胞置于含5％CO2、21％O2或者10％、5％O2培养箱中37℃培养。分别在接种后的第1、3、5、7、9天时在每孔中加入培养液总体积10％的CCK溶液，继续在培养箱中培养2小时后用酶标仪在450nm处测量吸光度值。以培养时间为横坐标，以与第一天细胞吸光度值的比值百分比为纵坐标，绘制生长曲线。如图2A所示，当细胞置于含5％CO2、5％O2的培养箱中37℃培养时，增殖能力强于置于21％或者10％O2培养箱中培养的细胞。实施例3小鼠骨髓来源间充质干细胞原代培养首次换液时间对比1细胞培养时首次换液时间设置根据实施例1中步骤3，将提取的原代细胞置于含5％CO2、5％O2的37℃培养箱中培养，1天或者4天后弃掉培养瓶中培养液，加入5mL步骤1配制的细胞培养液继续培养。待细胞贴壁融合至第10天时进行传代培养，传代培养具体过程参照实施例1中步骤4。2细胞生长曲线绘制为了分析不同的首次换液时间下间充质干细胞的生长情况，取第2代细胞，按照1×104个细胞孔的密度在96孔板中接种，将首次换液为1天或者4天的间充质干细胞置于含5％CO2、5％O2培养箱中37℃培养。分别在接种后的第1、3、5、7、9天时在每孔中加入培养液总体积10％的CCK溶液，继续在培养箱中培养2小时后用酶标仪在450nm处测量吸光度值。以培养时间为横坐标，以与第一天细胞吸光度值的比值百分比为纵坐标，绘制生长曲线。如图2B所示，当细胞首次换液时间为4天时，增殖能力强于首次换液时间为1天的细胞。通过上述实施例中不同条件的设置得知，在含5％O2培养箱中培养、并于4天后首次更换培养液的间充质干细胞增殖能力最好。因此后续实施例4采取该培养条件对细胞进行传代培养及鉴定。实施例4小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系鉴定和分化1细胞的冻存与复苏细胞的冻存：选取上述处于指数生长期、细胞密度达到90％以上的传代培养间充质干细胞，按常规方法消化：吸弃培养液，用DPBS冲洗1次，吸弃DPBS，加入1mL的0.25％胰蛋白酶液消化。显微镜下观察到细胞收缩即在原瓶中加入1mL新鲜上述实施例步骤1配制细胞培养液制备细胞悬液。将细胞悬液转移至15mL离心管中，以300g离心10min，去上清。用1mL预混的冻存液含10％二甲基亚砜的上述实施例步骤1配制细胞培养液悬浮细胞，并移至2mL冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，于-80℃冰箱中放置过夜，然后移至液氮中保存，并做好记录。细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，置于37℃水浴中迅速融化，300g离心10min，弃上清。并加入1mL上述实施例步骤1配制的细胞培养液悬浮上述冻存细胞，转移至25cm2培养瓶中，培养瓶放置于含5％CO2、5％O2培养箱中37℃培养，4天后弃上清，再加入5mL上述实施例步骤1配制的细胞培养液继续培养。2细胞表面分子鉴定取13代密度达到90％以上的间充质干细胞，用DPBS冲洗一次，按照常规胰蛋白酶液消化法消化，并加入1mL新鲜上述实施例步骤1配制细胞培养液制备细胞悬液。300g离心10min，弃上清。1mLDPBS重新悬浮细胞，再次300g离心10min，弃上清。1mLDPBS重新悬浮细胞，并计数。每个流式管中取5×105个细胞用于细胞表面分子鉴定。于其中一个流式管中加入anti-CD44-APC、anti-CD11b-PE、anti-CD19-FITC抗体各1uL，于另外一个流式管中加入anti-Sca-1-APC、anti-CD29-PE、anti-CD45-FITC抗体各1uL。4℃避光孵育15分钟。每管中加入500μLDPBS，上机检测上述各分子表达参见图3。结果显示，所提取的间充质干细胞阳性表达CD29、CD44和Sca-1，阴性表达CD11b、CD19和CD45，符合间充质干细胞表面分子表达特征。3诱导细胞向脂肪细胞分化取第2和12代密度达100％的间充质干细胞，用DPBS冲洗一次，加入脂肪分化诱导培养液BiologicalIndustries公司DMEM培养液、10％GIBCO公司胎牛血清、100UmL青霉素、100μgmL链霉素、1％谷氨酰氨、1μM地塞米松、0.125mM吲哚美辛、0.5mMIBMX、5μgmL胰岛素，细胞置于含5％CO2、5％O2培养箱中37℃培养。之后每2-3天换液1次。诱导7天之后进行油红染色，鉴定脂肪细胞分化。4％多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS洗2次，60％异丙醇快速洗1次，加入1mL油红工作液，室温染色30分钟，再次用60％异丙醇快速洗1次，PBS洗2次，倒置显微镜下拍照参见图4。由图4可见培养的间充质干细胞可以向脂肪细胞分化。4诱导细胞向成骨细胞分化取第2和12代密度达80％的间充质干细胞，用DPBS冲洗一次，加入成骨分化诱导培养液BiologicalIndustries公司DMEM培养液、10％GIBCO公司胎牛血清、100UmL青霉素、100μgmL链霉素、1％谷氨酰胺、0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、100mML-抗坏血酸，细胞置于含5％CO2、5％O2培养箱中37℃培养。之后每2-3天换液1次。诱导14天之后进行茜素红染色，鉴定成骨细胞分化。4％多聚甲醛固定细胞15分钟，双蒸水冲洗3次，加入1mL茜素红工作液，37℃染色30分钟，双蒸水冲洗3次，倒置显微镜下拍照参见图5。由图5可见培养的间充质干细胞可以向成骨细胞分化。上述实施例表明，用本发明方法建立的骨髓来源间充质干细胞细胞系，生长曲线正常，纯度较高，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。通过诱导分化实验，也观察到该细胞可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，证实该细胞具有分化潜能。本发明小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系的建立方法重复性强，经流式细胞仪鉴定纯度较高，操作方法简单，不仅适用于C57BL6小鼠，也可以适用于构建其他小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系，例如Bablc小鼠和129小鼠等。

权利要求：1.一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，其特征在于：1配制细胞培养液：以DMEM培养液为基础再加入占细胞培养液总体积20％胎牛血清，100UmL青霉素，100μgmL链霉素和1％谷氨酰胺，于4℃下保存备用；2原代培养：向小鼠骨髓中加入步骤1配制细胞培养液得到悬浮细胞液，而后将悬浮细胞液于37℃、含5％的CO2和5％的O2的混合气体下培养，培养4天后弃掉培养液，再加入步骤1配制的细胞培养液继续培养；3传代培养：待上述原代培养细胞贴壁融合至第10天时，加入含0.25％浓度的胰蛋白酶进行消化细胞，而后利用步骤1配制的细胞培养液，以1:1对细胞进行首次传代培养，之后每5-7天以1:2或1:3进行传代，直至第20代；进而小鼠骨髓来源间充质干细胞细胞系建立成功。2.按权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，其特征在于：所述DMEM培养液中葡萄糖含量为1500mgL；所述胎牛血清为经过二次过滤的胎牛血清。3.按权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，其特征在于：所述小鼠为取6-8周龄小鼠，颈椎脱臼法处死，经75％酒精喷湿小鼠腹部，取出双侧腿骨，置于含75％酒精的离心管中浸泡5分钟；浸泡后用无菌纱布擦拭腿骨，小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入含5mLDPBS的直径为60mm的无菌培养皿中，剪去腿骨两端，用DPBS冲洗出骨髓，反复吹打使细胞打散，静置3min，取70μm无菌滤器过滤至50mL离心管，300g离心10min，弃上清，待用。4.按权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法，其特征在于：所述剪去腿骨两端，用注射器吸取DPBS，从股骨或胫骨中冲洗出骨髓，直至骨发白。5.按权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞细胞系构建时，细胞培养箱中含5％O2并于4天后首次更换培养液。

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