申请/专利权人：信雅生物科技（苏州）有限公司

申请日：2017-09-13

公开（公告）日：2017-12-15

公开（公告）号：CN107475299A

主分类号：C12N15/867(2006.01)I

分类号：C12N15/867(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;C12Q1/02(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.05.28#发明专利申请公布后的驳回;2018.01.09#实质审查的生效;2017.12.15#公开

摘要：本发明涉及一种人源STIM1基因在促进非小细胞肺癌细胞系A549和SK‑MES‑1细胞系增殖中的应用。本发明通过慢病毒敲减非小细胞肺癌细胞系A549和SK‑MES‑1的内源性STIM1的表达，通过MTS增殖检测、吉姆萨平板克隆染色、流式细胞仪检测细胞周期、裸鼠皮下成瘤等方法对STIM1促进非小细胞肺癌增殖做出判断，结果表明敲减内源性STIM1的表达可抑制非小细胞肺癌细胞系A549和SK‑MES‑1细胞的增殖和细胞克隆形成能力，细胞周期阻滞于G2M期。裸鼠实验表明，抑制STIM1的表达能显著抑制A549细胞在裸鼠体内的生长，肿瘤体积明显小于对照组。

主权项：一种研究STIM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法，其包括如下步骤：培养非小细胞肺癌细胞系A549细胞和SK‑MES‑1细胞；通过慢病毒载体构建与包装，获得敲减人源STIMI基因的病毒，其特征在于：敲减人源STIMI基因所使用的慢病毒序列如下：STIM1‑shRNA‑1序列5’‑CCTGGATGATGTAGATCATAA‑3’、STIM1‑shRNA‑2序列5’‑AGAAGGAGCUAGAAUCUCAC‑3’，无关对照Scr‑shRNA序列5’‑TTCTCCGAACGTGTCACGT‑3’；利用慢病毒感染非小细胞肺癌A549和SK‑MES‑1细胞，研究STIM1在非小细胞肺癌中发挥的作用。

全文数据：研究STIM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种研宄人源STIM1基因的新方法及其应用，特别是涉及研宄人源STM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法及其应用。背景技术[0002]肺癌是最常见的肺原发恶性肿瘤，大多数起源于支气管粘膜上皮。肺癌基本病理类型分为小细胞肺癌SCLC、非小细胞肺癌NSCLC，其中80%的肺癌属于NSCLC。大量资料表明，长期吸烟是肺癌的一个重要致病因素，还与环境、职业等因素密切相关。尽管近年来在诊断和治疗均取得了较大进展，但预后仍然较差，其5年生存率仍15%。因此，进一步深入研究其发病机制，寻找新的治疗靶点，将为治疗非小细胞肺癌提供新的思路。[0003]大量研宄表明，在细胞的癌变过程中，Ca2+相关的胞内讯息传递有不正常的活化现象。基质交感蛋白1stromalinteractionmolecularl，STIMl与钓池操纵的钓离子通道Store-OperatedCa2+Channels，S0C的激活高度相关，是近几年研宄的热点。[0004]STIM1基因位于人类染色体11P15.5区域，其编码蛋白的分子量约为77KDa[7]。STIM1蛋白属I型膜蛋白，有很多预测的蛋白相互作用和信号功能区，如N端信号肽、EF-hand结构域、SAM结构域，单次跨膜TM片段，C端Coiled-coi1结构域、ERM结构域、SP结构域、Poly-K结构域尾巴等。[0005]STIM1主要定位在内质网ER膜上。细胞静息时，STIM1均匀分布在ER上，在库耗竭的基础上，广泛分布于ER中的STIM1重新移位到质膜与ER连接处，形成泪孔，与质膜中相对应的Orail相互作用而激活S0C，从而引起钙离子内流。[0006]STIM1在很多成人及儿童肿瘤中广泛表达，包括肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾上腺癌、肝母细胞瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌及睾丸癌。然而，在不同细胞株中过表达STIM1会引起不同的生物学效应:在G401棒状肿瘤及横纹肌肉瘤细胞株中可抑制细胞生长且引起细胞死亡;在啮齿类动物的肌原纤维细胞株中不依赖于细胞分化而引起细胞周期停滞;在乳腺癌细胞株中则没有观察到变化。由此可以看出，STIM1的生物学效应有其细胞类型特异性。[0007]为了研宄STIM1在非小细胞肺癌中发挥的作用，本发明采用慢病毒感染高表达STM1的非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1，运用MTS、平板克隆染色、流式细胞仪，裸鼠皮下成瘤等方法检测STIM1对肺腺癌细胞增殖及凋亡的影响。发明内容[0008]本发明的目的之一在于提供一种研究人源STM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法。[0009]本发明的目的之二在于根据研宄人源STIM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法得出的结论，给出人源ST顶1基因在非小细胞肺癌增殖中的应用。[0010]本发明的目的之三在于提供研究人源STM1基因的序列、慢病毒和宿主细胞。[0011]本发明通过如下技术方案实现：[0012]—种研宄STIM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法，其包括如下步骤：[0013]1•培养非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞；[0014]2•运用慢病毒感染细胞，对照组为无关序列scr-shRNA，实验组STIM1-shRNA-1、STIM1-shRNA-2两个序列，其中，Scramble序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3,，STIM1-shRNA-1序列为：5’-CCTGGATGATGTAGATCATAA-3,，STIM卜shRNA-2序列为：5,-AGAAGGAGCUAGMUCUCAC-3’。对照组和实验组均带有GFP绿色荧光标签;3.通过以下方法来研究STIM1在非小细胞肺癌中的作用：[0015]1用Westren检测慢病毒敲减STIM1的敲减效率；[0016]⑵通过MTS检测敲减ST1M1后细胞增殖能力[0017]⑶利用平板克隆检测敲减STIM1后细胞克隆形成能力；[0018]⑷利用流式细胞仪检测敲减STIM1后对细胞周期的影响。[0019]5运用裸鼠皮下成瘤技术，在体内层面研究STIM1基因对肿瘤生长的影响。[0020]结果表明：敲减非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞的STIM1基因后，细胞的增殖能力均显著下降，细胞平板克隆形成能力均显著减低，细胞周期阻滞于G2M期，裸鼠体内A549细胞在裸鼠体内的生长受到显著抑制，肿瘤体积明显小于对照组。[0021]根据以上实验结果，得出敲减人源STIM1基因在抑制非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞增殖中有良好的应用；敲减人源SHM1基因在阻滞非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞周期中有良好的应用;敲减人源STIM1基因在裸鼠体内促进非小细胞肺癌肿瘤生长中有良好的应用。[0022]研究人源SHM1基因的序列为敲减人源STIMI基因，其特征在于：[0023]STIM卜shRNA-1序列为：5’-CCTGGATGATGTAGATCATAA-3’，[0024]STIM卜shRNA-2序列为：5’-AGMGGAGCUAGMUCUCAC-3，[0025]Scramble序列为：5,-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3，[0026]研究人源STIM1基因的慢病毒为敲减人源STIMI基因所使用的慢病毒，其特征在于：[0027]STIM卜shRNA-1序列为：5’-CCTGGATGATGTAGATCATM-3’，[0028]STIM卜shRNA-2序列为：5,-AGAAGGAGCUAGMUCUCAC-3，[0029]Scramble序列为：5’-TTCTCCGMCGTGTCACGT-3’[0030]研宄人源STIMI基因的宿主细胞为使用敲减人源STIMI基因所使用的慢病毒感染的非小细胞肺癌A549和SK-MES-1细胞，其特征在于：[0031]STMl-shRNA-1序列为：5’-CCTGGATGATGTAGATCATAA-3’，[0032]STIMl-shRNA-2序列为：5’-AGAAGGAGCUAGAAUCUCAC-3’[0033]Scramble序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’附图说明[0034]图1为:慢病毒感染非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞，提取蛋白，Western检测STIMI蛋白的表达。[0035]图2为:MTS检测表明敲减STIM1的表达，能显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞细胞的增殖能力，P〇.〇5。[0036]图3为：平板克隆实验表明敲减STIM1的表达，能显著降低非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞的克隆形成能力，p〇.〇l。[OO37]图4为:流式细胞仪检测表明敲减STIM1的表达，使非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞的细胞周期阻滞于G2M期，P〈0.05。[0038]图5为:裸鼠成瘤实验结果表明敲减STIM1的表达，能显著抑制A549细胞在裸鼠体内的生长。[0039]如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。具体实施方式[0040]具体实施方式1:STIM1慢病毒感染[0041]A549细胞系铺6孔板10小时后，换成含5ugulpolybree的无血清RPMI-1640Medium，加入相应的病毒体积细胞个数*M0I病毒滴度），培养8小时后，将培养基换成含1〇%胎牛血清1^1\〇-16401161111111培养72小时。[0042]具体实施方式2:WeStern检测蛋白表达[0043]感染72小时后，胰酶消化细胞，完全培养基终止消化，巴氏管吹打使细胞脱壁悬浮，混匀后将细胞收集于15ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清;将细胞移至EP管中，根据细胞量加入合适体积的RIPA10ulml的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），吹打混匀，EP管封口膜封闭后放于4°C细胞碎裂超声仪中，500watt，裂解20min;14000g，20min离心，沉淀细胞碎片，上清即为细胞全蛋白，BCA法测定浓度。每孔蛋白上样量为50ug。电泳条件5%浓缩胶80V，50分钟；12%分离胶120V，100分钟。转膜条件100V，100分钟。SHM1—抗稀释比例1:1000，二抗稀释比例1:10000。[0044]检测结果（图1所示:实验组STIMl-shRNA-1、STMl-shRNA-2中STIM1的蛋白表达明显比未处理组及无关序列Scr-shRNA低。[0045]具体实施方式3:敲减内源性STIM1的表达，可显著抑制A549及SK-MES-1细胞的增殖[0046]采用MTS实验检测敲减内源性STIM1表达对人非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1的增殖的影响。取处于生长指数期的未处理组、对照组Scr-shRNA和实验组31']1-3111?祖-1、STIMl-shRNA-2细胞，细胞计数后接种于96孔细胞培养板，每孔2000个细胞，全波长扫描仪490nm波长处测取㈤值，数据分析。[0047]实验结果（图2显示：在A549和SK-MES-1两株细胞中，与未处理组、对照组Scr-shRNA相比，实验组STIMl-shRNA-1、SHMl-shRNA-2细胞增殖速度均明显减慢，差值具有统计学意义，P〇•〇5，说明敲减内源性STIM1的表达后能够显著抑制人非小细胞肺癌细胞A549和SK-MES-1的增殖。[0048]具体实施方式4:敲减内源性STIM1的表达，可显著抑制非小细胞肺癌细胞A549和SK-MES-1的细胞克隆形成能力[0049]采用平板克隆形成实验来检测敲减内源性SHM1表达对人非小细胞肺癌细胞A549和SK-MES-1克隆形成能力的影响。取处于生长指数期的未处理组、对照组Scr-shRNA和实验组STIMl-shRAN-1、SUMl-shRAN-2细胞，计数后接种于6孔细胞培养板，每孔200个细胞，每组设置3个平行复孔，放37°C5%⑶2恒温培养箱中培养14天左右，培养至肉眼可见克隆形成;克隆^成后〃、止培养，弃培养基，PBS缓冲液小心清洗2次，晾干，加imi甲醇固定3〇min，弃甲醇晾干后加入lml吉姆萨染液染色3〇min，洗去染液，晾干;计数大于5〇个细胞的克隆数，做柱状图分析数据。[0050]结果（图3显示：在A549和SK-MES-1两株细胞中，实验组STIMl-shRAN-USTIM1-shRAN-2细胞克隆形成数目均明显比未处理组及对照组Scr—shRNA少，p〇•〇1。说明敲减内源性STIM1表达后，可显著抑制非小细胞肺癌细胞A549和的细胞克隆形成能力。[0051]具体实施方式5:敲减内源性STIM1的表达，可使非小细胞肺癌细胞A549和SK-MES-1的细胞周期阻滞于G2M期[0052]采用流式细胞伩来检测敲减内源性STIM1表达对A549和SK-MES-1细胞细胞周期的影响。取对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞于5〇11离心管中，每组设3个复孔；1200rpm离心5min，弃去上清;4°C预冷的PBSpH7•2-7•4洗涤细胞沉淀1次，1500rpm离心5min，收集细胞;4°C预冷的70%乙醇固定细胞12h;1500rpm离心5min去固定液，PBS洗涤细胞沉淀一次;细胞染色液配制:40XPI母液2mgml:100XRNase母液（10mgml:1XPBS=25:10:1000;细胞染色:根据细胞量，加入lml细胞染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37°C避光温浴30分钟。300目的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。上机时细胞通过率为200-350ce11ss;重复三次以上实验。[0053]检测结果（图4显示：在A549和SK-MES-1两株细胞中，实验组STIMl-shRAN-1、STIMl-shRAN-2细胞较未处理组及Scr-shRNA组均阻滞于G2M期，p0•05，差异具有统计学意义。[0054]具体实施案例6:敲减内源性STIM1的表达，可显著抑制A549细胞在裸鼠体内的生长，肿瘤体积明显小于对照组[0055]取处于生长指数期的A549未处理组、对照组Scr-shRNA和实验组STIMl-shRAN-1、STIMl-shRAN-2细胞，胰酶消化成单细胞悬液，2000rpm，离心5min;PBS液洗两次，弃上清，并用PBS液重悬，细胞计数，注射于雄性4周BALBc裸鼠左侧腋下，每只裸鼠注射5*106个细胞，每组7只裸鼠，裸鼠成瘤7周左右，解剖瘤体，整理数据，分析结果。[0056]结果（图5显示:实验组STIMl-shRAN-l、STIMl-shRAN-2的肿瘤生长明显慢于未处理组及对照组Scr-shRNA，肿瘤体积明显小于未处理组及对照组Scr-shRNA。[0057]以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种研究sumi基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法，其包括如下步骤：培养非小细胞肺癌细胞系A549细胞和SK-MES-1细胞；通过慢病毒载体构建与包装，获得敲减人源STBO基因的病毒，其特征在于:STIMI基因所使用的慢病毒序列如下：ST頂丨^沾隐―丨序列（5,—cctggatgatgtagatcata^3’）、STIMl-shRNA-2序列（5’-AGAAGGAGCUAGAAUCUCAC-3,），无关对照Scr—shRNA序列（5,—TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’）；利用慢病毒感染非小细胞肺癌A549和SK-MES-1细胞，研宄STIM1在非小细胞肺癌中发挥的作用。2.如权利要求1所述的研究STM1基因在非小细胞肺癌中发挥作用的方法，其特征在于:所述的研宄STIM1在非小细胞肺癌中发挥的作用的方法包括如下方法中的至少一个：1用Westren检测慢病毒敲减STIM1的敲减效率；⑵通过MTS检测敲减STM1后细胞增殖能力⑶利用平板克隆检测敲减STM1后细胞克隆形成能力；⑷利用流式细胞仪检测敲减STIM1后对细胞周期的影响。⑸运用裸鼠皮下成瘤技术，在体内层面研宄STIM1基因对肿瘤生长的影响。3.敲减人源STIMI基因，敲减人源STIMI基因所使用的慢病毒，以及敲减人源STIMI基因所使用的慢病毒感染的非小细胞肺癌A549和SK-MES-1细胞。4.敲减人源STIM1基因在抑制非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞增殖中的应用。5.敲减人源STIM1基因在阻滞非小细胞肺癌细胞系A549和SK-MES-1细胞周期中的应用。6.敲减人源SHM1基因在裸鼠体内促进非小细胞肺癌肿瘤生长中的应用。

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