申请/专利权人：广东赤萌医疗科技有限公司

申请日：2017-11-03

公开（公告）日：2018-06-12

公开（公告）号：CN108148872A

主分类号：C12N15/90(2006.01)I

分类号：C12N15/90(2006.01)I;C12N9/22(2006.01)I;A61K31/7105(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P31/18(2006.01)I

优先权：["2016.12.13 CN 2016111444166"]

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.03.18#发明专利申请公布后的驳回;2018.07.06#实质审查的生效;2018.06.12#公开

摘要：本发明公开了一种dead SaCas9‑Fok1系统及其构建方法与应用，由于SaCas9分子量小，p‑dead SaCas9‑Fok1重组质粒利用dead SaCas9替代传统的dead SpCas9，降低SpCas9空间位阻对Fok1相互结合的影响，从而提高其打靶效率；dead SaCas9‑Fok1系统需要配合2个21nt的Sa‑sgRNA共同作用，Sa‑sgRNA长于Sp‑sgRNA20nt，且SaCas9识别的PAM序列为6nt，长于SpCas9的PAM3nt，所以当dead SaCas9‑Fok1配合两个Sa‑sgRNA使用，进一步降低了脱靶效率。

主权项：一种dead SaCas9‑ Fok1系统，其特征在于，包括dead SaCas9‑ Fok1和第一sgRNA和第二sgRNA；所述dead SaCas9‑ Fok1是在dead SaCas9的C端融合Fok1内切酶而得到，所述dead SaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得到的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述dead SaCas9‑ Fok1能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体和第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体结合到各自靶序列并相互识别时，所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1与所述第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1能够相互结合，使得Fok1内切酶活性被激活。

全文数据：一种deadSaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及一种基因编辑系统，尤其是一种deadSaCas9-Fokl系统及其构建方法与应用。背景技术[0002]CRISPR基因编辑技术已经广泛的应用于研究和生产中，是目前公认的第三代基因编辑技术（第一代，ZFN;第二代，TALEN;第三代，CRISPR。相对于ZFN、TALEN等技术，CRISPR具有明显的优势，例如构建简单、效率高使用成本低。根据细菌来源不同，目前已经研发出不同类型的CRISPR酶系统，例如3?〇389、33〇389、_〇389以及5^389系统等，但所有的CRISPR系统均包含以下几个部分，如图1所示：IPAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt例如，SpCas9NGG;SaCas9NNGRRT，根据此位点来选取靶序列;2SgRNA，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3TracrRNA，连接于SgRNA之后的一段回文RNA序列；4Cas9内切酶，含有2个独特的活性位点，分别为在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。CRISPR-Cas9基因编辑系统的工作原理见图1所示，sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识另IJ并结合于sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-Ioop，使SgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切SgRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂DSB。[0003]CRISPR基因编辑具有以下特点：UPAM序列一般只有几个nt，统计发现其在基因组中出现的频率很高，例如SpCas9NGG在基因组中每35nt左右就会出现一次。2、sgRNA序列只有20nt左右，虽然使得我们在基因组中很容易选取靶向位点（针对相同长度的DNA序列，相对于ZFN、TALEN技术而言，CRISPR更容易选取到靶向位点），但20nt左右的识别序列比较短，基因组中很容易出现相似的序列。综上原因，CRISPR在科研上更具有广泛的适用性。但站在应用的角度，CRISPR的缺点在于不仅可以切割靶向序列，同时也可能切割同源性较高的非靶向序列，即出现脱靶现象。此外还有研究发现，CRISPR能够在一定程度上忍受sgRNA与靶位点的错配，即靶向位点不需要完全与sgRNA序列配对，也可以被识别和切割，导致CRISPR可能出现更严重的脱靶现象。脱靶现象直接关系着CRISPR技术在临床使用上的安全风险，严重阻碍了该技术往临床应用方向的发展。[0004]现有技术中，为了降低CRISPR的脱靶效率，目前主要有以下几种途径：（1选用PAM和sgRNA序列较长的CRISPR系统，例如SaCas9和NmCas9系统。（2选用Nickase系统SpNickase、SaNickase。以SpNickase为例，该系统主要是将Cas9内切酶两个活性位点RuvC、HNH当中的一个失活，保留另外一个活性位点，然后选用两个sgRNA—个结合正相序列，另外一个结合反相序列）配套使用，Nickase在每个sgRNA的识别位点都只切割一条DNA链，只要两个sgRNA的切割位点距离在一定范围内都能形成DSBJickase系统2个sgRNA的配合使用将原来20nt的识别序列增加到40nt，显著降低了其脱靶的可能性，具体工作原理如图2所示。（3采用deadCas9融合Fokl系统。该系统同时失活Cas9内切酶的两个活性位点（RuvC、HNH，从而形成了无内切酶活性的deadCas9蛋白，但deadCas9蛋白保留了与SgRNA结合的能力，从而仍然具有革El向结合DNA链的能力。在此基础上，deadCas9蛋白的C末端融合一个Fokl蛋白，只有当两个Fokl蛋白单体相互结合才能激活其核酸酶活力。这样的复合系统不仅延长了靶向序列，而且限制了两个sgRNA结合位点之间的距离，如果两个位点距离太远，Fokl就难以相互结合，从而不能发挥核酸酶活性。deadCas9-Fokl系统相比Nickase系统，进一步降低了脱靶的可能性，更具有临床应用的前景。[0005]然而上述现有技术仍然存在以下缺点：（ISaCas9、NmCas9系统虽然PAM和SgRNA序列较长而脱靶频率较低，但改善的程度不大，达不到临床应用的要求，而且由于PAM序列增长，靶序列在基因组中出现的概率下降，从而导致靶位点选取困难。（2Nickase系统目前常见的有SpNickase和SaNickase两种，虽然脱革El效率有明显下降，但是由于Nickase酶具有独立的单链切割活性，可以对靶向位点进行独立切割，仍可能存在非预期的脱靶突变，且Nickase系统对两个gRNA靶向序列之间的距离容忍性较大，研究发现两靶向序列之间间隔200bp左右仍能产生DSB，加之Cas9对sgRNA与靶序列错配的容忍性，使得Nickase系统的脱靶效率仍不能满足临床的需求。此外，由于Nickase系统对正义链和反义链切割所形成的缺口一般是错开的（即形成带粘性末端的DBS，此缺口容易被细胞分别修复，从而导致产生DBS的几率下降，即切割效率降低。（3deadCas9融合Fokl系统是目前普遍认为脱靶效率最低的一种CRISPR系统，主要通过两个sgRNA识别位点以及限制两个识别位点的距离来降低脱靶效率，但是目前只构建了deadSpCas9_Fokl系统，该系统是由SpCas9改造而来的，具体工作原理如图3所示。但是，SpCas9分子量很大，在空间结构上可能会阻碍两个Fokl单体的结合，从而降低切割效率，此外对于病毒运输载体而言，如此大的分子很难被包装和运输，从而限制了该技术的应用，尤其限制其在体内基因编辑的应用。发明内容[0006]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种脱靶率低、切割率高、便于病毒载体运输的基因编辑系统，所述基因编辑系统在deadSaCas9的C末端融合一个Fokl蛋白，由于deadSaCas9分子量比较小，空间结构上对两个Fokl单体相互结合的影响比较小，从而不会影响Fokl的核酸酶活性，在保证低脱靶效率的同时，也能保证较高的切割效率。[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种deadSaCas9-Fokl系统，包括deadSaCas9_Fokl和第一sgRNA和第二sgRNA;所述deadSaCas9_Fokl是在deadSaCas9的C端融合Fokl核酸酶后而得的，所述deadSaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的祀序列位于目的基因的另一条链上;所述deadSaCas9_Fokl能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体和第二sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体分别识别并结合到各自祀序列时，所述第一sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体中的Fokl与所述第二sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体中的Fokl能够相互结合，使得Fokl核酸酶活性被激活。[0008]本发明首先将SaCas9中的两个活性位点RuvC、HNH失活，从而形成deadSaCas9。deadSaCas9主要负责靶向序列的识别，但其不具备内切酶活性，不能对靶序列进行切割。然后将Fokl蛋白单体融合表达于在deadSaCas9的C末端，从而形成deadSaCas9_Fokl融合蛋白。只有当两个Fokl蛋白单体相互结合才能激活其核酸酶活力。本系统需要一对gRNA分别识别并结合在革E序列的正义链和反义链上面，引导deadSaCas9_Fokl中的deadSaCas9绑定于革G序列的正义链和反义链，从而使正反义链上deadSaCas9_Fokl中的Fokl蛋白单体能够相互靠近并结合，进而使Fokl的核酸酶活性被激活，并且针对靶序列进行双链切割其工作原理如图4所示）。上述deadSaCas9_Fokl系统一方面降低了CRISPR基因编辑系统的脱靶效率，另一方面保证了双链切割的效率，同时增加了以病毒作为转运载体的可行性。[0009]作为对上述技术方案的进一步改进，所述deadSaCas9的脱氧核糖核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。[00Ί0]作为对上述技术方案的进一步改进，所述deadSaCas9_Fokl的脱氧核糖核苷酸序列为SEQIDNO:3所示，氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。[0011]作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一SgRNA的靶序列如SEQIDNO:18所示，所述第一sgRNA的靶序列如SEQIDN0:19、SEQIDN0:20或SEQIDN0:21所示。作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一sgRNA的靶序列如SEQIDNO:22所示，所述第一sgRNA的靶序列如SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示。[0012]另一方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体的表达产物包括上述所述的deadSaCas9_Fokl氛基酸序列。[0013]上述所述的deadSaCas9_Fokl表达载体，是将SaCas9基因的两个活性位点RuvC、HNH突变失活得到deadSaCas9基因，将deadSaCas9基因、Fokl基因克隆到任意表达载体中，得到deadSaCas9_Fokl表达载体。[0014]作为对上述技术方案的进一步改进，所述表达载体的构建方法是将deadSaCas9基因、Fokl基因，和或带有启动子的第一sgRNA表达框和或带有启动子的第二sgRNA表达框插入到任意表达载体中而得的。[00Ί5]作为对上述技术方案的进一步改进，所述任意表达载体为pSaCas9_GFP。[0016]作为对上述技术方案的进一步改进，所述deadSaCas9基因的序列为SEQIDNO:1所示，所述Fokl基因的序列为SEQIDN0:5所示。[0017]上述所述的deadSaCas9_Fokl表达质粒的构建方法具体包括以下步骤：deadSaCas9基因的获得及deadSaCas9表达载体的构建;Fokl基因的获得及deadSaCas9_Fokl表达载体的构建;U6-sgRNA表达框的获得及U6-sgRNA表达载体的构建。以上步骤的顺序不分先后。[0018]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤deadSaCas9基因的获得及deadSaCas9表达载体的构建，其具体方法为:将SaCas9蛋白第10位的天冬酰胺ASN，N突变为丙氨酸（Ala，A，将第580位的天冬酰胺（ASN，N突变为丙氨酸（Ala，A，如图5所示，即将SaCas9CDS序列的第29位核苷酸的由腺嘌呤㈧突变为胞嘧啶C，将第1738位核苷酸的由腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G，第1739位核苷酸的由腺嘌呤㈧突变为胞嘧啶C。上述操作使Cas9失去核酸内切酶活性，从而得到deadSaCas9基因。此后再将其插入到任意表达载体的启动子之后，从而获得deadSaCas9表达载体。[0019]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤Fokl基因的获得及deadSaCas9-Fokl表达载体的构建，其具体方法为:采用克隆、酶切或者合成的方法，获得Linker-Fokl片段，其中Fokl为具有完整阅读框的Fokl基因。Linker为一段短的DNA片段，核苷酸数量为3的倍数。该片段的一个作用为保证deadSaCas9基因和Fokl基因共用同一个阅读框，使deadSaCas9基因和Fokl基因可以融合表达；该片段的另一个作用为间隔Fokl基因和deadSaCas9基因，保证Fokl蛋白单体和deadSaCas9蛋白折叠所需的空间，使得deadSaCas9蛋白和Fokl蛋白融合表达后不影响各自的功能。[0020]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤U6-sgRNA表达框的获得及U6-sgRNA表达载体的构建，其具体方法为:采用克隆、酶切或者合成的方法，获得U6-sgRNA片段，而后将其插入任意表达载体而获得。上述任意表达载体包括但不限于deadSaCas9_Fokl表达载体。[0021]另一方面，本发明提供一种上述所述的deadSaCas9_Fokl系统在制备基因编辑系统中的用途。[0022]作为对上述技术方案的进一步改进，上述所述的deadSaCas9_Fokl系统用于编辑人类CCR5、CXCR4、BCLlIA、HBB、ZBTB7A基因。[0023]另一方面，本发明提供一种上述所述的deadSaCas9_Fokl系统在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。[0024]另一方面，本发明提供一种上述所述的表达载体在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。[0025]本发明的有益效果在于：1利用deadSaCas9取代现有的deadSpCas9，降低3?〇89空间位阻对?〇1^1相互结合的影响，从而提高其打靶效率;21613089-?〇1^1系统需要2个sgRNASaCas9配合使用，由于SaCas9系统PAM序列有6nt，SgRNA序列为21nt，相对于SpCas9系统要长分别为3nt和20nt，所以当两个sgRNASaCas9配合使用，进一步降低了脱革E效率;3、deadSaCas9_Fokl系统相对于deadSpCas9_Fokl系统分子量要小，进一步增加了该系统利用病毒作为转运载体的机率。附图说明[0026]图1为CRISPR系统的构成示意图；[0027]图2为Nickase系统工作原理示意图；[0028]图3为deadSpCas9_Fokl系统工作原理示意图；[0029]图4为deadSaCas9_Fokl系统工作原理示意图；[0030]图5为deadSaCas9基因突变位点示意图；[0031]图6为商品化载体pSaCas9_GFP质粒图谱；[0032]图7为U6_sgRNA表达载体pSaCas9_gRNA质粒图谱；[0033]图8为SaCas9nD10A突变载体pSaCas9nD10A质粒图谱；[0034]图9为deadSaCas9表达载体p-deadSaCas9质粒图谱；[0035]图10为deadSaCas9_Fokl表达载体p-deadSaCas9_Fokl质粒图谱；[0036]图11为pX601质粒图谱；[0037]图12为本发明设计的gRNA的酶切效果电泳图；[0038]图13为本发明设计的gRNA组合的酶切效果电泳图。具体实施方式[0039]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。[0040]以下实施例中使用到的实验材料包含:商品化的pSaCaS9-GFP载体;大肠杆菌感受态细胞T0P10;限制性内切酶。[0041]实施例lU6-sgRNA表达框的获得及U6-sgRNA表达载体的构建[0042]1、目的片段合成[0043]1合成U6-sgRNA片段，该片段插入至ljpUC19载体的SmaI位点，其中U6-sgRNA片段如SEQIDN0:6所示，以pUC19-U6-sgRNA为模板，使用引物SaCas9-U6-LSaCas9-gRNA-R，PCR扩增目的片段U6-sgRNA;[0044]SaCas9-U6-L：57-GTACGGGCCAGATATACGCGT-37SEQIDNO：7[0045]SaCas9-gRNA-R：57-CAATAATCAATGTCAACGCGT-37SEQIDNO：8[0046]2用DNA纯化试剂盒纯化上述PCR产物。[0047]2、表达载体准备[0048]1将含商品化载体PSaCas9-GFP质粒图谱如图6所示）的大肠杆菌扩大培养，提取质粒pSaCas9-GFP;[0049]2采用限制性内切酶MluI-HF单酶切pSaCas9-GFP质粒，37°C酶切lh，65°C酶失活20min;[0050]3上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性化的pSaCas9_GFP载体，并测定浓度，_20°C保存备用。[0051]3、重组反应[0052]1将U6-sgRNA片段和线性化的pSaCas9-GFP载体进行同源重组反应，37°C反应30min后，马上置于冰浴上5min;[0053]2上述重组产物热激法转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏；[0054]3将复苏后的T0P10细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0055]⑷从上述平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养；[0056]⑶对上述菌液分别进行测序鉴定；[0057]6将测序正确的菌液提取质粒，命名为PSaCas9-gRNA质粒图谱如图7所示），并测定质粒浓度后至_20°C保存备用。[0058]实施例2deadSaCas9基因的获得及deadSaCas9表达载体的构建[0059]一）PSaCas9nD10A改造[0060]1、目的片段合成[0061]1委外合成SaCas9nD10A突变片段，该片段插入到pUC19载体的SmaI位点；[0062]SaCas9nD10A突变片段序列如SEQIDN0:9所示；[0063]2以PUC19-SaCas9nD10A为模板，使用引物SaD10A-LSaD10A-R，PCR扩增目的片段SaCas9nD10A;[0064]SaDlOA-LiS7-CATCATTTTGGCAAAGAATTC-S7SEQIDNO：10[0065]SaDioA-RiS7-GAcAGCTTCTGACTCAGGCCT-S7SEQIDNO：11[0066]3用DNA纯化试剂盒纯化上述PCR产物。[0067]2、表达载体准备[0068]1将实施例1中获得的PSaCas9-gRNA质粒，用限制性内切酶EcoRI和StuI进行双酶切，37°C酶切lh，65°C酶失活20min;[0069]2上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性化的PSaCas9-gRNA载体，并测定浓度，_20°C保存备用。[0070]3、重组反应[0071]1将SaCas9nD10A突变片段和线性化的PSaCas9-gRNA载体进行同源重组反应，37°C反应30min后，马上置于冰浴上5min;[0072]2上述重组产物热激法转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏；[0073]3将复苏后的T0P10细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0074]⑷从上述平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养；[0075]⑶对上述菌液分别进行测序鉴定；[0076]6将测序正确的菌液提取质粒，命名为PSaCas9nD10A质粒图谱如图8所示），并测定质粒浓度后至-20°C保存备用。图8中箭头所指位点分别为DlOA突变位点，突变后成为SaCas9nD10A蛋白。[0077]二）p-deadSaCas9改造[0078]1、目的片段合成[0079]1委外合成SaCas9nN580A突变片段，该片段插入到pUC19载体的SmaI位点；[0080]SaCas9nN580A突变片段序列如SEQIDN0:12所示；[0081]2以PUC19-SaCas9nN580A为模板，使用引物N580-EcoRV-LN580-EcoRV-R，PCR扩增目的片段SaCas9nN580A;[0082]N580-EcoRV-L:5'-TACGGCCTGCCCAATGATATC-3'SEQIDNO:13[0083]NSSO-BstBI-R^^TTCGGCCTGCTTCTCTTCGAA-S7SEQIDN0：14[0084]3用DNA纯化试剂盒纯化上述PCR产物。[0085]2、表达载体准备[0086]1将实施例2—）中获得的PSaCas9nD10A质粒，用限制性内切酶EcoRV-HF，在37°C酶切Ih后，再加入BstBI在65°C酶切Ih;[0087]2上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性化的PSaCas9nD10A载体，并测定浓度，_20°C保存备用。[0088]3、重组反应[0089]1将SaCas9nD580A突变片段和线性化的PSaCas9nD10A载体进行同源重组反应，37°C反应30min后，马上置于冰浴上5min;[0090]2上述重组产物热激法转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏；[0091]⑶将复苏后的T0P10细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0092]⑷从上述平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养；[0093]⑶对上述菌液分别进行测序鉴定；[0094]6将测序正确的菌液提取质粒，命名为p-deadSaCas9质粒图谱如图9所示），并测定质粒浓度后至-20°C保存备用。图9中箭头所指位点分别为DlOA和N580A两个突变位点，突变后成为deadSaCas9蛋白。[0095]实施例3Fokl基因的获得及deadSaCas9_Fokl表达载体的构建[0096]1、目的片段合成[0097]1委外合成Linker-Fokl片段，该片段插入到pUC19载体的SmaI位点；[0098]Linker-Fokl片段序列如SEQIDNO:15所示；[0099]⑵以pUC19-Linker-Fokl为模板，使用引物FokI-EcoNI-LFokI-PstI-R，PCR扩增目的片段Linker-Fokl;[0100]Fokl-EcoNI-L:cgacattctgggaaacctgtatgaggtgaagagcaaaaagcacSEQIDNO:16[0101]FokI-PstI-R:catgagatccccgcgctgcagttaaaagtttatctcaccSEQIDNO:17;[0102]3用DNA纯化试剂盒纯化上述PCR产物。[0103]2、表达载体准备[0104]1将实施例2二）中获得的p-deadSaCas9质粒，用限制性内切酶EcoNI和PstI进行双酶切，在37°C酶切Ih后，65°C酶失活20min;[0105]2上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性化的p-deadSaCas9载体，并测定浓度，-20°C保存备用。[0106]3、重组反应[0107]1将Linker-Fokl片段和线性化的p-deadSaCas9载体进行同源重组反应，37°C反应30min后，马上置于冰浴上5min;[0108]2上述重组产物热激法转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏；[0109]3将复苏后的TOPlO细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0110]⑷从上述平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养；[0111]5对上述菌液分别进行测序鉴定；[0112]6将测序正确的菌液提取质粒，命名为p-deadSaCas9-Fokl质粒图谱如图10所示），并测定质粒浓度后至-20°C保存备用。如图10的载体结构所示，deadSaCas9蛋白通过一段Linker序列与Fokl编码序列相连，Linker序列的核苷酸数量为3的倍数，以保证Fokl蛋白的正常翻译，并与deadSaCas9蛋白融合表达，该载体最终的表达产物为deadSaCas9-Fokl蛋白。此外可根据实验需要，将目的基因的gRNA所对应的靶序列插入到U6启动子与SagRNAscaffoId之间，以表达目的基因的gRNA。[0113]实施例4目的基因gRNA筛选[0114]以下实验步骤是以VEGFA基因为例，进行gRNA筛选，随后将高效用于后续deadSaCas9_Fokl系统突变效率的验证。[0115]UgRNA准备[0116]1根据VEGFA基因的序列设计gRNA序列，所述gRNA的靶序列如SEQIDNO:18-SEQIDNO:22中的一种所示；[0117]2分别合成gRNA的靶序列正义链和反义链正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG;在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C;[0118]针对CCR5基因所设计的gRNA的靶序列正义链如表1所示：[0119]表1针对CCR5基因所设计的gRNA的正义链或靶序列）[0120][0121]3将上述gRNA正义链和反义链混合，90°C处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。[0122]2、载体准备[0123]⑴pX601质粒图11扩增和提取，并测定质粒浓度；[0124]2采用限制性内切酶BsaI对pX601进行酶切，37°C酶切Ih后加loadingbuffer终止反应。[0125]3琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX601，并测定回收产物浓度，-20°C保存备用。[0126]3、连接转化[0127]1将切胶回收的线性化pX601载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；[0128]2连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基（不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏。[0129]3将复苏后的T0P10细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0130]⑷从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养。[0131]5使用引物SeqF5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’）（SEQIDN0:23，对上述菌液分别测序；[0132]⑶将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至_20°C保存备用。[0133]4、细胞转染[0134]1HEK293T细胞铺板；[0135]2采用Lipofectamine3000试剂盒将1.3⑶中提取的质粒转染HEK293T细胞；[0136]⑶转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。[0137]5、T7E1酶切分析突变效率[0138]1将上述1.43收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；[0139]⑵分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，如表2所示；[0140]表2T7E1酶切分析引物列表[0141][0142]⑶分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；[0143]⑷纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；[0144]5将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95°C，保温lOmin，然后以每30s下降2〜3°C的速度降温至室温；[0145]6上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶IT7E1，设置mock组未转化的细胞和空白对照CK组不加T7E1，用CldH2O代替），37°C酶切lh。[0146]72%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，Marker为购于北京康为世纪生物科技有限公司的CW0636S，各条带大小从上至下分别为：1500bp、1000bp、800bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp。[0147]结果如图12所示，电泳图中各泳道编号分别对应各gRNA的靶序列编号，即泳道18-22对应SEQIDNO:18-SEQIDN0:22,所有泳道都检测到了较高的酶切效率，且mock和CK组没有切割条带，根据T7E1的检测原理，本结果表明本实验所设计的gRNA对VEGFA基因均具有较高的突变效率。[0148]利用上述筛选出来gRNA两两搭配组合，进一步验证deadSaCas9-Fokl系统的突变效率。[0149]实施例5p_deadSaCas9_Fokl的突变效率验证[0150]1、将实施例4中筛选出来的gRNA进行配对组合。如下表所示：[0151]表3VEGFA基因的gRNA配对组合[0152][0153]2、按照实施例4中13的方法，将上述gRNA对应靶序列的正义链和反义链进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。[0154]3、载体准备[0155]Ip-deadSaCas9_Fokl质粒（图10扩增和提取，并测定质粒浓度；[0156]2采用限制性内切酶BbsI对p-deadSaCas9_Fokl进行酶切，37°C酶切Ih后加loadingbuffer终止反应。[0157]3琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒p-deadSaCas9-Fokl，并测定回收产物浓度，-20°C保存备用。[0158]4、连接转化[0159]1将切胶回收的线性化p-deadSaCas9-Fokl载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；[0160]2连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基（不含抗生素），混勾后置于恒温摇床37°C200rpm振荡培养45min使菌体复苏。[0161]3将复苏后的T0P10细胞涂布LB固体平板Amp+，倒置于恒温培养箱37°C静置培养12-16h。[0162]⑷从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基Amp+中扩大培养。[0163]5使用引物SaF5’-CTgCTCTgATgCCgCATAg-3’）（SEQIDN0:26，对上述菌液分别测序；[0164]⑶将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20°C保存备用。[0165]5、细胞转染[0166]1HEK293T细胞铺板；[0167]2采用Lipofectamine3000试剂盒，按照表3的组合，将配对的gRNA所对应的质粒共同转染HEK293T细胞；[0168]⑶转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。[0169]6、根据实施例4中5的方法，进行T7E1酶切分析突变效率，结果如图13所示：电泳图中各泳道编号分别对应各组gRNA组合的编号，带“X”的泳道表示该样品添加了T7E1进行酶切反应。其中组合5SEQIDN0:22+SEQID如:20，两个靶序列间距13匕?检测到了明显的酶切效率，其次是组合ISEQIDNO:18+SEQIDNO:19,两个靶序列间距45bp，而mock和CK组没有切割条带，根据T7E1的检测原理，说明上述gRNA组合对VEGFA基因均具有明显的突变效率，即说明了根据本专利方案所构建的deadSaCas9-Fokl系统可以实现基因编辑的功能，同时也说明了当组合中两个革G序列的间距范围在13〜45bp左右时，deadSaCas9_Fokl系统均可实现目的基因的剪切。[0170]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质。

权利要求：1.一种deadSaCas9_Fokl系统，其特征在于，包括deadSaCas9_Fokl和第一SgRNA和第二sgRNA;所述deadSaCas9_Fokl是在deadSaCas9的C端融合Fokl内切酶而得到，所述deadSaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得到的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述deadSaCas9_Fokl能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体和第二sgRNA与deadSaCas9_Fokl组成的复合体结合到各自祀序列并相互识别时，所述第一sgRNA与deadSaCas9-Fokl复合体中的Fokl与所述第二sgRNA与deadSaCas9-Fokl复合体中的Fokl能够相互结合，使得Fokl内切酶活性被激活。2.如权利要求1所述的deadSaCas9-Fokl系统，其特征在于，所述deadSaCas9的脱氧核糖核苷酸序列为SEQIDN0:1所示，氨基酸序列为SEQIDN0:2所示。3.如权利要求1所述的deadSaCas9_Fokl系统，其特征在于，所述deadSaCas9_Fokl的脱氧核糖核苷酸序列为SEQIDN0:3所示，氨基酸序列为SEQIDN0:4所示。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达产物包括如权利要求1-3任一项所述的deadSaCas9_Fokl系统。5.如权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法是将deadSaCas9基因、Fokl基因，和或带有启动子的第一sgRNA表达框和或带有启动子的第二sgRNA表达框插入到表达载体中而得的。6.如权利要求5所述的表达载体的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pSaCas9_GFP07.如权利要求5所述的表达载体的构建方法，其特征在于，所述deadSaCas9基因的序列为SEQIDNO:1所示，所述Fokl基因的序列为SEQIDN0:5所示。8.如权利要求1-3任一所述的deadSaCas9-Fokl系统在制备基因编辑系统中的用途。9.如权利要求1-3任一所述的deadSaCas9-Fokl系统在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。10.如权利要求4所述的表达载体在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。

百度查询： 广东赤萌医疗科技有限公司 一种dead SaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用

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