申请/专利权人：南方医科大学

申请日：2014-12-12

公开（公告）日：2017-10-10

公开（公告）号：CN104513801B

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;C02F3/34(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N;C02F101/10(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2017.10.10#授权;2015.05.13#实质审查的生效;2015.04.15#公开

摘要：本发明公开了抗辐射不动杆菌Acinetobacter radioresistensZX2在还原硫酸盐中的应用。本发明的抗辐射不动杆菌Acinetobacter radioresistensZX2是从广州南方医院废水中分离得到的，经实验发现，该Acinetobacter radioresistens ZX2能够高效、快速、安全降解硫酸盐。因此，本发明的Acinetobacter radioresistens ZX2能够用于还原降解硫酸盐。本发明从广州南方医院废水中分离得到抗辐射不动杆菌Acinetobacter radioresistensZX2，该菌具有耐酸和碳源利用广泛的优点，能够高效、快速、安全降解硫酸盐，并在重金属废水中有较强的功能，因此可以用于快速还原硫酸盐中应用。

主权项：抗辐射不动杆菌Acinetobacter radioresistensZX2在还原SO42‑中的应用， ZX2于2014年12月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GIM1.793。

全文数据：抗车虽射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2在还原硫酸盐中的应用技术领域：[0001]本发明属于微生物应用领域，具体涉及抗福射不动杆菌（AcinetobacterradioresistensZX2在还原硫酸盐中的应用。背景技术：[0002]硫酸盐还原细菌（sulfate-reducingbacterium，SRB是指一类具有能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等硫氧化物以及元素硫还原形成硫化氢这一生理特性的细菌的统称。硫酸盐还原菌能够沉淀废水中的重金属离子，因此被广泛的应用在废水的治理中。但是不同的菌株之间功能相差较大，只有能够广泛适应多种环境的菌株才能在废水治理中发挥作用。因此，分离、筛选高功能的菌株成为重金属污染废水微生物处理最关键的研发步骤。[0003]目前，硫酸盐还原菌在实际应用中存在2个主要的弊端:第一、菌株多为生长较慢的严格厌氧菌，在废水中需要较长的时间复苏、生长和定殖;第二、H2S的大量的产生会造成小环境中PH的下降，过低的pH会抑制SRB的生长，进而影响硫酸盐的还原和重金属离子的沉淀。[0004]目前报道的具有硫酸盐还原功能的菌株，包括脱硫弧菌Desulfovibrio、脱硫肠状菌Desulfotomaculum、脱硫球菌属Desulfococcus和脱硫单胞菌Desulfomonas等，但是他们的培养、活化需要较长的时间，并且降解速率低，功能不强。因此，发掘可以高效、安全降解硫酸盐的功能菌株具有重要的意义。[0005]到目前为止，没有报道Acinetobacter属的菌株有降解硫酸盐还原的能力。[0006]发明目的：[0007]本发明的目的是提供抗福射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2在还原降解硫酸盐中的应用。[0008]本发明的抗福射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2是从广州南方医院废水中分离得到的，经实验发现，该AcinetobacterradioresistensZX2能够高效、快速、安全降解硫酸盐。因此，本发明的AcinetobacterradioresistensZX2能够用于还原降解硫酸盐。[0009]本发明从广州南方医院废水中分离得到抗福射不动杆菌（AcinetobacterradioresistensZX2,该菌具有耐酸碱和碳源利用广泛的优点，能够高效、快速、安全降解硫酸盐，并在重金属废水中有较强的功能，因此可以用于快速还原硫酸盐中应用。具体实施方式：[0010]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。[0011]实施例I:AcinetobacterradioresistensZX2菌株的分离和鉴定[0012]AcinetobacterradioresistensZX2菌株的分离[0013]筛选培养基:无机盐溶液500mL，硫酸铵0.5g，微量元素溶液IOmL，胰蛋白胨2.Og，酵母粉2·Og，L-半胱氨酸盐酸盐O·5g，乳酸钠3·Og，维生素ClOgLIOmL，蒸馏水IOOOmL，高纯化氮气为气相，121°C、20min灭菌。质量分数10%硫酸亚铁按单独灭菌后每5mL培养基中加入O.lmL。[0014]无机盐溶液:氯化钾0.67g，硫酸镁6.9g，氯化镁5.5g，氯化铵0.5g，氯化钠0.28g，磷酸氢钾〇.25g，蒸馏水1000mL。[0015]微量元素溶液（gL—3:CoCl2·6H2O0.1,MnCl2·4H200.425，ZnCl20.05，NiCl2·6H2O0.01,CuSO4·5H200.015,Na2MoO4·2H200.01,Na2SeO4·2H200.01〇[0016]本发明的AcinetobacterradioresistensZX2菌株是从广州南方医院的河涌水中分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：[0017]取IOml河涌水放在IOOml的筛选培养基中密闭富集培养。富集过程中通过查看瓶壁上黑色菌落的大小和多少指示富集效果。富集培养是先30°C，静置培养7天，观察到有明显的菌落形成后，吸取形成的菌落转接到新配置好的IOOml筛选培养基中继续培养7天，如此反复3次。然后从上步富集培养的培养液里取混合菌群涂布到含有琼脂的固体筛选培养基中30°C厌氧环境中进行培养，从中挑取快速生长的菌落进行纯化，和硫酸盐还原筛选，最后获得菌株AcinetobacterradioresistensZX2。[0018]AcinetobacterradioresistensZX2的理化参数如下：[0019]1、菌株特性[0020]a.米用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，种AcinetobacterradioresistensZX2菌株为革兰氏阴性，杆状，氧化酶阴性，不能运动。[0021]b.在硫酸盐培养基平板上培养28h后，菌落表面呈黑色，圆形，有小的凸起。[0022]2、AcinetobacterradioresistensZX2的主要理化特性：[0023]AcinetobacterradioresistensZX2的16SrRNA测序，其16SrRNA的序列如SEQIDNO.1所不，BLAST比对发现，本发明的AcinetobacterradioresistensZX216SrRNA基因序列与Acinetobacterradioresistens已有模式菌株具有较高的相似性。其中与AcinetobacterradioresistensLMG10613T的序列相似性为97%。[0024]综合上述的生理生化特性、16SrRNA基因序列结果，本发明AcinetobacterradioresistensZX2应归属Acinetobacterradioresistens，命名为抗福射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2。[0025]本发明的抗福射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2于2014年12月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心GM，地址:广州广东省微生物研究所，其保藏号为GIMl.793。该广东省微生物菌种保藏中心是对外销售菌种的机构，保藏在该保藏中心的菌株是向外销售的，因此本领域技术人员可以在申请日之前向广东省微生物菌种保藏中心请求购买到该菌株。[0026]实施例2:AcinetobacterradioresistensZX2对硫酸盐还原试验：[0027]培养基：Κ2ΗΡ〇4〇·5g、NH4Cll.Og、酵母膏I.OgXaCl2·6H200.1g、Na2S〇4l.Og、FeS〇42·7H200.002g、70%乳酸钠0.5g，蒸馏水lOOOmL。溶解后用INNaOH调节pH值为7.4〜7.6，倒入三角瓶封口，121°C蒸汽灭菌20min。另配质量分数0.6%盐酸半胱氨酸溶液，临用前按体积分数10%的比例加入培养基中。[0028]铬酸钡悬浊液:称取19.44g铬酸钾K2CrO4与24.44g氯化钡BaCl2·2H20，分别溶于IL去离子水中，加热至沸腾。将两溶液倾入同一个3L烧杯内，此时生成黄色铬酸钡沉淀。待沉淀下降后，倾出上层清液，然后每次用约IL去离子水洗涤沉淀，共需洗涤5次左右。最后加去离子水至IL，使成悬池液，每次使用前混勾。每5ml络酸钡悬池液可以沉淀约48mg硫酸根SO42一）。[0029]硫酸盐标准溶液:称取1.4786g无水硫酸钠Na2S〇4,优级纯或1.8141g无水硫酸钾K2S〇4,优级纯），溶于少量水，置IOOOml容量瓶中，稀释至标线。此溶液IOOml含IOOmg硫酸根S〇42—。[0030]标准曲线的制作[0031]取150ml锥形瓶八个，分别加入0、0.25、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00及10.001111硫酸盐标准溶液，分别加去离子水至50m1。向上述水样及稀释的硫酸盐标准溶液中各加lml2.5molL盐酸溶液，加热煮沸5min左右。取下后再各加25ml铬酸钡悬浊液，再煮沸5min左右。取下锥形瓶，稍冷后，向各瓶逐滴加入1+1氨水至呈柠檬黄色，再多加2滴。待溶液冷却后，用慢速定性滤纸过滤，滤液收集于50ml比色管内（如滤液浑浊，应重复过滤至透明）。用去离子水洗涤锥形瓶及滤纸三次，滤液收集于比色管中，用去离子水稀释至标线。在420nm波长，用IOmm比色皿测量吸光度，绘制校准曲线。具体数据如表1:[0032]表1[0033][0034]由此得出标准曲线方程y=0.110x+0.016，x为硫酸根SOf浓度，y为吸光度。[0035]AcinetobacterradioresistensZX2对硫酸盐还原速率的测定方法[0036]将本发明的AcinetobacterradioresistensZX2纯菌经实施例1的筛选培养基加琼脂使其形成固体平板上培养，然后从固体平板上挑取单菌落接种到50ml培养基中初始硫酸根离子浓度为50mgL，在30°C条件下静止厌氧培养，三个试验重复。从三个平行样品中分别取2ml经过28h上述培养的培养液，按照标准曲线制定方法测试溶液中的硫酸根离子浓度，按照上述标准曲线方程计算，可得28h培养后Acinet〇bacterradioresistensZX2培养液中硫酸根离子浓度分别为28.2mgL、29·lmgL、30.3mgL，平均值为29.2mgL。（硫酸根减少量为50-29.2=20.8mgL，减小率为20.850*100%=41.6%〇[0037]实施例3:[0038]本实施例的培养基与实施例2中的培养基相同[0039]将本发明的AcinetobacterradioresistensZX2纯菌经实施例1的筛选培养基加琼脂使其形成固体平板上培养，然后从固体平板上挑取单菌落接种到50ml实施例2中的培养基中（初始硫酸根离子浓度为50mgL，在30°C条件下静止厌氧培养，三个试验重复。从三个平行样品中分别取2ml经过36h上述培养的培养液，按照标准曲线制定方法测试溶液中的硫酸根离子浓度，按照上述标准曲线方程计算，可得36h培养后AcinetobacterradioresistensZX2培养液中硫酸根离子浓度分别为4.6mgL、5.3mgL、5.lmgL，平均值为5.011^1。（硫酸根减少量为50-5=4511^1;减小率为4550*100%=90%。[0040]实施例4:[0041]本实施例的培养基与实施例2中的培养基相同[0042]将本发明的AcinetobacterradioresistensZX2纯菌经实施例1的筛选培养基加琼脂使其形成固体平板上培养，然后从固体平板上挑取单菌落接种到50ml实施例2中的培养基中（初始硫酸根离子浓度为50mgL，在30°C条件下静止厌氧培养，三个试验重复。从三个平行样品中分别取2ml经过48h上述培养的培养液，按照标准曲线制定方法测试溶液中的硫酸根离子浓度，按照上述标准曲线方程计算，可得48h培养后AcinetobacterradioresistensZX2培养液中硫酸根离子浓度分别为3.80mgL、4.OmgL、4.lmgL，平均值为3·97mgL。（硫酸根减少量为50-3·97=46·03mgL;减小率为46·0350*100%=92.06%〇[0043]实施例5:碳源测定：[0044]培养基：K2HP〇4〇.5g、NH4Cll.Og、酵母膏I.OgXaCl2·6H200.1g、MgS〇4·7H202.0g、Na2S〇4l.Og、FeS〇42·7H200.002g，蒸馏水1000mL。溶解后用INNaOH调节pH值为7.4〜7.6，倒入三角瓶封口，121°C蒸汽灭菌20min。另配质量分数0.6%盐酸半胱氨酸溶液，临用前按体积分数10%的比例加入培养基中。[0045]在上述培养基中分别添加甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠\葡萄糖和鹿糖〇·5g，来培养AcinetobacterradioresistensZX2，在培养36h时，用PbAc试纸检测H2S的产生。3次试验重复。结果如表2所示：[0046]表2:AcinetobacterradioresistensZX2对不同碳源的利用情况[0047][0048]由此可见，本发明的AcinetobacterradioresistensZX2能够利用甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠\葡萄糖和蔗糖作为碳源，因此该菌的碳源利用广泛。[0049]实施例6:pH对AcinetobacterradioresistensZX2生长的影响：[0050]培养基：K2HP〇4〇.5g、NH4Cll.Og、酵母膏I.OgXaCl2·6H200.1g、MgS〇4·7H202.0g、Na2S〇4l.Og、FeS〇42·7H200.002g，70%的乳酸钠0.5g，蒸馏水1000mL。溶解后用INNaOH或者HCl调节pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，倒入三角瓶封口，121°：蒸汽灭菌20min。另配质量分数0.6%盐酸半胱氨酸溶液，临用前按体积分数10%的比例加入培养基中。三个重复，在培养36h时，用分光光度计来检测培养液在625nm处的光密度值0D625。结果如表3所示：[0051]表3:pH对AcinetobacterradioresistensZX2生长的影响[0052][0053]由此可见，AcinetobacterradioresistensZX2比较难酸。[0054]综上所述，AcinetobacterradioresistensZX2对硫酸盐具有快速、高效的降解能力，能把硫酸盐转变成硫化氢气体。重金属污染废水经过该菌生物处理后，能够快速降低废水中的硫酸盐和重金属离子含量，不发生二次污染。是废水处理中功能强大的菌株。

权利要求：I.抗福射不动杆菌AcinetobacterradioresistensZX2在还原S〇42—中的应用，ZX2于2014年12月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDll.793。

百度查询： 南方医科大学 抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）ZX2在还原硫酸盐中的应用

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