申请/专利权人：长江大学

申请日：2018-06-26

公开（公告）日：2018-10-12

公开（公告）号：CN108633730A

主分类号：A01H1/02(2006.01)I

分类号：A01H1/02(2006.01)I;C12Q1/6806(2018.01)I;C12Q1/6858(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.05.06#发明专利申请公布后的驳回;2018.11.06#实质审查的生效;2018.10.12#公开

摘要：本发明属于植物或获得新植物的方法；通过组织培养技术的植物再生技术领域，公开了一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，利用禾本科高山箭竹全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种恩恢142产生变异，从450朵颖花产生的318棵苗中筛选表型与对照有明显差异的单株经过连续自交，获得表型稳定的变异株系13个；利用49对SSR分子标记对变异株系与对照进行分析，发现变异株与对照之间以及变异株系间的遗传背景都存在差异；将变异材料和对照分别与光温敏核不育系杂交配组。利用箭竹DNA结合花粉管通道法可以为水稻育种创制新种质，为水稻的种质资源创新提供一种新途径。

主权项：1.一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法利用禾本科高山箭竹全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种恩恢142产生变异，从450朵颖花产生的318棵苗中筛选表型与对照有明显差异的单株经过连续自交，获得表型稳定的变异株系13个；利用49对SSR分子标记对变异株系与对照分析；将变异材料和对照分别与光温敏核不育系杂交配组。

全文数据：利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法技术领域[0001]本发明属于植物或获得新植物的方法;通过组织培养技术的植物再生技术领域，尤其涉及一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法。背景技术[0002]目前，业内常用的现有技术是这样的：周光宇1983年建立起来的花粉管通道法可应用于任何开花植物，其基本原理是利用授粉后通过伸长的花粉管将外源DNA沿着珠心通道导入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。段晓岚等首次将紫色稻的全基因组DNA通过花粉管通道法导入绿色水稻，并在后代中获得了能稳定遗传具有紫色性状的植株。玉米和芦苇的总DNA通过花粉管通道法导入不同水稻受体品种，在转化后代中获得了包括提高光合效率、穗长、每穗粒数、千粒重和抗盐性等变异株。Luo等报道用花粉管通道法将含报告基因的质粒DNA转入水稻，并经过Southern杂交和酶学测定证明，得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株。花粉管通道法不仅在小麦Triticumaestivum、玉米Zeamays、大豆Glycinemax、花生Arachishypogaea和棉花^Gossypiumhirsutum等农作物上成功应用，而且在林木上也有用该方法转化基因组来创新种质资源的报道。花粉管通道法还在多种植物的转化中获得了成功，确定了其在直接转化法中的作用。该方法跟远缘杂交相比，克服了远缘杂交不亲现象，容易成功，耗时少，稳定快。钟章美等经过35年的反复杂交、回交和系统选育，最终成功培育出水稻和竹子杂交的竹稻新品系;与体细胞杂交、基因枪和农杆菌等转化方法相比，它不依赖组织培养技术，成本低、操作简单方便，不受试验条件限制，容易被育种工作者所应用；花粉管通道法不仅可以导入目的基因或特定的DNA片段外，还可以导入任何全基因组DNA;在转基因安全性方面，该方法可以避免载体和标记基因的使用，安全性好，容易推广应用。花粉管通道法在创新植物遗传育种材料方面具有巨大优势，但是很多试验尚缺乏明确的分子证据，无法证明变异的来源。竹子具有耐旱、耐寒、抗虫、抗倒伏、根系发达和再生力强等特性，如果能将竹子的部分特性快速导入水稻，对创新水稻种质资源将非常有利。水稻与竹子虽然都属于禾本科，但二者属于不同亚科，如果通过杂交的方式，将面临亲和性差，耗时长，难度大的风险。偶然发现神龙架某区域高山箭竹杆硬抗倒、根系发达、耐旱、耐寒、抗虫、生长整齐一致，都属于禾本科，所以尝试着做了，除本实验室外目前还没有见其他报道。目前尚无关于将水稻与竹子两者不同亚科的植物进行杂交的方法与研究;且花粉管通道法在创新植物遗传育种材料方面具有巨大优势，但是很多试验尚缺乏明确的分子证据，无法证明变异的来源。[0003]综上所述，现有技术存在的问题是：目前尚无关于将水稻与竹子两者不同亚科的植物进行杂交的方法与研究；且花粉管通道法在创新植物遗传育种材料方面具有巨大优势，但是很多试验尚缺乏明确的分子证据，无法证明变异的来源。[0004]解决上述技术问题的难度和意义:从育种的角度来讲只要能发现有变异的材料，并且有育种价值就行了。能在一个恢复系中创新材料，说明可能在其他的恢复系中也可能创新类似的材料，本研究为创新作物新种质资源提供了一种新的途径，并且创造的这些材料是通过其他途径很难获得到的。在遗传机理方面彻底弄清楚是非常困难的，其中可能有DNA片段之间的重组，也可能有片段之间的相互影响和干扰等。但创制材料的技术不存在什么问题，用本方法就可以较好地做到。发明内容[0005]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法。[0006]本发明是这样实现的，一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，所述利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法利用禾本科高山箭竹全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种恩恢142产生变异，从450朵颖花产生的318棵苗中筛选表型与对照有明显差异的单株经过连续自交，获得表型稳定的变异株系13个;利用49对SSR分子标记对变异株系与对照分析;将变异材料和对照分别与光温敏核不育系杂交配组。[0007]进一步，所述利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法包括以下步骤：[0008]步骤一，选取生长在湖北十堰神农架的高山箭竹，恩恢142的水稻品种和水稻光温敏核不育系6303S;[0009]步骤二，利用幼嫩的箭竹新鲜叶，加入4mL预热的提取液，经水浴、颠倒、加入氯仿、离心、洗涤、稀释后，制备总DNA，并保存在-20°C冰箱中；[0010]步骤三，将总DNA滴入至水稻当天开的颖花的IOyL在切□处，合上颖壳，套袋，收获成熟的种子；[0011]步骤四，将稳定的株系分别与水稻两系不育系6303S进行配组，成熟后取中间行10株进彳丁考种；[0012]步骤五，利用84对平均分布在12个连锁群上和24对用于构建DNA指纹图谱的标准SSR引物对14份材料通过用CTAB法提取水稻叶片总DNA进行PCR检测，进行遗传背景差异分析。[0013]进一步，所述步骤一具体包括：[0014]1取幼嫩的箭竹新鲜叶片IOmg剪短放于研钵中，在研钵中加入液氮磨成粉末，转入到IOmL离心管中；[0015]2加入4mL预热的提取液，65°C水浴约45min，期间颠倒数次，冷却至室温；[0016]3加入4ml氯仿：异戊醇=24:1，温和颠倒混勾lOmin，静置5min，4°C8000r.min_1离心IOmin;[0017]4取上清液转移到新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇再抽提一次，离心取上清液；[0018]5加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混勾，放入-20°c冰箱30min，6000r.min-1低温离心5min;[0019]⑹倒掉溶液，用70%乙醇洗涤2次，晾干，溶解于双蒸水；[0020]⑺将液体稀释到IOOyg·mL-1，保存在-20°C冰箱中备用。[0021]进一步，所述步骤二的具体包括：[0022]1选择水稻当天开的颖花，去除其它早开和未开颖花；[0023]2用镊子将水稻内外颖分开，用锋利的小刀片切掉柱头；[0024]3用移液枪滴入浓度为IOOyg·mL」的DNAIOyL在切口处；[0025]⑷合上颖壳，套袋，收获成熟的种子。[0026]进一步，所述步骤二的DNA的转化都在1个单株不同穗上完成。[0027]进一步，所述步骤四的PCR反应扩增程序为:95°C预变性5min;然后32个循环包括94°C变性45s，56°C退火30s，72°C延伸45s;72°C延伸5min;4°C保存待测，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离，银染观察并拍照。[0028]进一步，所述提取液为2%CTAB，0.IMTris-HClpH8·0,0·02ΜNa2EDTA，1.4MNaCI，0.2%体积比的巯基乙醇。[0029]综上所述，本发明的优点及积极效果为:[0030]1、可以极大地拓宽水稻遗传育种的种质资源，可以创造多类型丰富的材料。[0031]2、传统的方法是通过远缘杂交实现，但通过远缘杂交一是难以成功，二是即使能够杂交成功，将耗费很长的时间。[0032]3、跟转基因相比创新的材料更加安全，可以直接应用于生产，便与推广应用。[0033]4、操作简便，对实验条件要求不高，成本低。附图说明[0034]图1是本发明实施例提供的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法流程图。[0035]图2是本发明实施例提供的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法的利用49对SSR引物对恩恢142和13个稳定的变异株系进行分子水平上的差异分析图a。[0036]图3是本发明实施例提供的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法的利用49对SSR引物对恩恢142和13个稳定的变异株系进行分子水平上的差异分析图b。[0037]图4是本发明实施例提供的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法的利用49对SSR引物对恩恢142和13个稳定的变异株系进行分子水平上的差异分析图c。具体实施方式[0038]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0039]为创新水稻新种质，利用禾本科高山箭竹FargesiaspathaceaFranch全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种恩恢142产生变异，从450朵颖花产生的318棵苗中筛选表型与对照有明显差异的单株经过连续自交，获得表型稳定的变异株系13个，获得稳定变异株的频率为4.09%，变异株系与对照间在7个农艺性状方面存在明显差异。利用49对SSR分子标记（其中包括24对用于构建水稻DNA指纹图谱的SSR对变异株系与对照进行分析，发现变异株与对照之间以及变异株系间的遗传背景都存在差异。将变异材料和对照分别与光温敏核不育系杂交配组，结果表明各组合Fl在农艺性状和产量方面有显著差异。说明利用箭竹DNA结合花粉管通道的方法可以创制可供育种利用的水稻新种质。[0040]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。[0041]如图1所示，本发明实施例提供的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法包括以下步骤：[0042]SlOl:选取生长在湖北十堰神农架的高山箭竹，恩恢142的水稻品种和水稻光温敏核不育系6303S;[0043]S102:利用幼嫩的箭竹新鲜叶，加入4mL预热的提取液，经水浴、颠倒、加入氯仿、离心、洗涤、稀释后，制备总DNA，并保存在-20°C冰箱中；[0044]S103:将总DNA滴入至水稻当天开的颖花的IOyL在切□处，合上颖壳，套袋，收获成熟的种子；[0045]S104:将稳定的株系分别与水稻两系不育系6303S进行配组，成熟后取中间行10株不包括边株进行考种；[0046]S105:利用84对平均分布在12个连锁群上和24对用于构建DNA指纹图谱的标准SSR引物对14份材料通过用CTAB法提取水稻叶片总DNA进行PCR检测，进而进行遗传背景差异分析。[0047]下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。[0048]1、试验材料[0049]本试验所用供体材料高山箭竹FargesiaSpathaceaFranch，生长在湖北十堰神农架。水稻品种是恩恢142,由恩施农科院选育，该品种配合力好，稻瘟病抗性强;水稻光温敏核不育系6303S来源于湖北荃银高科种业有限公司。[0050]2、总DNA的制备[0051]取幼嫩的箭竹新鲜叶片IOmg剪短放于研钵中，在研钵中加入液氮磨成粉末，转入到IOmL离心管中，加入4mL预热的提取液（2%CTAB，0.1MTris-HClpH8·0,0·02ΜNa2EDTA，1.4ΜNaCI，0.2%体积比的巯基乙醇），65°C水浴约45miη，期间颠倒数次，冷却至室温，加入4ml氯仿：异戊醇（24:1，温和颠倒混勾lOmin，静置5min，4°C8000r.min_1离心lOmin，取上清液转移到新离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇再抽提一次，离心取上清液方法同前），加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，放入-20°C冰箱30min，6000r.HiirT1低温离心5min，倒掉溶液，用70%乙醇洗涤2次，晾干，溶解于双蒸水，最终稀释到IOOyg·πιΓ1，保存在-20°C冰箱中备用。[0052]3、箭竹DNA的导入[0053]外源DNA导入的方法同张德建所用方法，水稻在开花后的1.5—3小时之间进行转化。选择当天开的颖花，去除其它早开和未开颖花，用镊子将水稻内外颖分开，用锋利的小刀片切掉柱头注意不能伤及子房），用移液枪滴入浓度为IOOyg·mL-1的DNAIOyL在切口处，合上颖壳，套袋，收获成熟的种子，双蒸水转化的种子作为对照，所有转化都在1个单株不同穗上完成。[0054]4、水稻性状观察及杂交配组[0055]种植收获的转化和对照种子，在湖北5月2日播种，6月3日移栽，从苗期开始进行田间观察，筛选与对照有差异的植株进行套袋自交，分单株收获，下一代种成株系，每个株系50株，株行距分别为13.3cm和16.6cm，以未转化的恩恢142为照，所有材料均单本插。观察农艺性状的变化直到稳定。稳定的株系分别与水稻两系不育系6303S进行配组，Fl的株行距分别为16.6cm和26.6cm，成熟后取中间行10株不包括边株进行考种。[0056]5、遗传背景分析[0057]利用84对平均分布在12个连锁群上和24对用于构建DNA指纹图谱的标准SSR引物对14份材料进行遗传背景差异分析，从中筛选出具有多态性的引物49对其中包括构建水稻指纹图谱的24对SSR引物）：RM3，RM7，RM17，RM18，RM19，RM26，RM30，RM35，RM72，RM297，RM71，RM208，RM232，RM55，RM448，RM185，RM273，RM267，RM274，RM528，RM190，RM420，RM336，RM481，RM515，RM337，RM553，RM105，RM107，RM219，RM278，RM304，RM258，RM311，RM467，RMl20，RM286，RM224，RM209，RM309，RM463，RM235，RM247，RM548，RM522，RM570，RM592，RMl195，RM5414引物序列见中国水稻信息网http:www.ricedata.cn。用CTAB法提取水稻叶片总DNA方法同上进行PCR检测。PCR反应扩增程序为:95°C预变性5min;然后32个循环包括94°C变性45s，56°C退火30s，72°C延伸45s;72°C延伸SminjcC保存待测。扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶PAGE上分离，银染观察并拍照。[0058]二、结果与分析[0059]1、变异频率[0060]在1株恩恢142的不同穗上分批共做450朵颖花，收获339粒种子，结实率75.5%，播种后成苗318株，从苗期开始进行田间观察，筛选与对照有明显差异的植株16株，平均变异率为5.03%。对产生变异的植株套袋收获后种成16个株系，每个株系选2-3株与上代表型一致的植株套袋混收种成下一代，连续进行4代自交，16个变异株系性状能稳定下来的有13个，对13个稳定变异株系分别用Tl一T13表示，最终产生稳定的变异株系频率为4.09%。[0061]2、农艺性状分析[0062]对13个变异株系和对照的农艺性状进行比较分析发现，变异株系与对照在播始历期播种至始穗天数）、分蘖数、穗长、每穗总粒数、结实率、谷粒长宽比和千粒重等7个性状方面差异显著表1。由表1可以看出，13个变异株系的7个性状:播始历期、分蘖数、穗长、穗总粒数、结实率、谷粒长宽比和千粒重的变幅分别为96—116天、4.2—7.0个、21.36—29.06cm、175.5—312.5粒、68.36—94.29%、3.15—4.03和24.67—32.178，对照相应的性状分别为97天、6·2个、25·54cm、175·5粒、93·49%、3·32和26·6283Τ5的千粒重为32·17g，比对照26.62g增加20.8%，差异显著;对比同期开花的T2花丝明显长于对照恩恢142;T4的生育期比照长13天。在调查的7个性状中，千粒重和播始历期是两个遗传率比较高的性状，在变异株系与对照中差异都到达显著水平，说明通过花粉管通道法将高山箭竹基因组DNA片段导入水稻产生了变异。[0063]3、遗传背景分析[0064]利用49对SSR引物其中包括构建水稻指纹图谱的24对标准SSR引物对恩恢142和13个稳定的变异株系进行分子水平上的差异分析（图2-图4，每对引物扩增出2-4条多态性条带，在49对引物中存在差异的对数范围为3—16,在24对标准引物中存在差异的对数范围为2—9表2。从图2-图4可以看出不仅恩恢142与变异株系的遗传背景存在差异，而且变异株系间的遗传背景也存在差异，其中变异株系T8与变异株系T2在49对引物中有9对扩增出差异性条带。以上结果进一步表明利用箭竹基因组DNA结合花粉管通道可以对水稻产生变异，而且这种变异是多样性的。[0065]4、变异株系的杂交配组[0066]13个变异株系和对照恩恢142分别与6303S进行配组，除了T9和T13所配组外，其余组合在本地都能正常抽穗。12个组合在株高、效穗数、穗长、总粒数、结实率、千粒重、播始历期和理论产量方面都表现出来一定的差异，部分差异达到了显著水平表3。变异株系Tl、T2和T4配制的组合都比恩恢142配制的组合理论产量低，其中Tl和T4所配组合的理论产量显著低于对照，除T5和T7所配组合的理论产量与对照差异不显著外，其余变异株系所配组合的理论产量都显著高于对照，其中T3、T8和Tll配制的组合理论产量比恩恢142配制的高20%以上，有可能选育出新的品种用于生产实践。[0067]三、结果[0068]高山箭竹全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种，获得的稳定变异株系与对照在多个个农艺性状方面成在显著差异；SSR分子标记检测发现变异株与对照之间以及变异株系间之间的遗传背景都存在差异;变异株系材料和对照分别与光温敏核不育系杂交的Fl在农艺性状和产量方面有显著差异。说明利用箭竹DNA结合花粉管通道法可以为水稻育种创制新种质。该方法产生的变异具有一定的随机性，其遗传机理有待进一步研究。[0069]表1变异株系与恩恢142农艺性状的比较[0072]注：同一列中不同字母表示在5%水平差异显著[0073]表213个变异植株与对照存在多态性的引物对[0075]表3恩恢142及其变异株系与6303S所配组合的表现[0076][0077]注：同一列中不同字母表示在5%水平差异显著。[0078]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法利用禾本科高山箭竹全基因组DNA结合花粉管通道法处理水稻品种恩恢142产生变异，从450朵颖花产生的318棵苗中筛选表型与对照有明显差异的单株经过连续自交，获得表型稳定的变异株系13个;利用49对SSR分子标记对变异株系与对照分析;将变异材料和对照分别与光温敏核不育系杂交配组。2.如权利要求1所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法包括以下步骤：步骤一，选取生长在湖北十堰神农架的高山箭竹，恩恢142的水稻品种和水稻光温敏核不育系6303S;步骤二，利用幼嫩的箭竹新鲜叶，加入4mL预热的提取液，经水浴、颠倒、加入氯仿、离心、洗涤、稀释后，制备总DNA，并保存在-20°C冰箱中；步骤三，将总DNA滴入至水稻当天开的颖花的IOyL在切□处，合上颖壳，套袋，收获成熟的种子；步骤四，将稳定的株系分别与水稻两系不育系6303S进行配组，成熟后取中间行10株进行考种；步骤五，利用84对平均分布在12个连锁群上和24对用于构建DNA指纹图谱的标准SSR引物对14份材料通过用CTAB法提取水稻叶片总DNA进行PCR检测，进行遗传背景差异分析。3.如权利要求2所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：⑴取幼嫩的箭竹新鲜叶片IOmg剪短放于研钵中，在研钵中加入液氮磨成粉末，转入到IOmL离心管中；⑵加入4mL预热的提取液，65°C水浴约45min，期间颠倒数次，冷却至室温；3加入4ml氯仿：异戊醇=24:1，温和颠倒混勾1〇111；[11，静置5111；[11，4€800〇1'.111；[]1_1离心IOmin;4取上清液转移到新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇再抽提一次，离心取上清液；5加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混勾，放入-20°C冰箱30min，6000r.min_1低温离心5min；⑹倒掉溶液，用70%乙醇洗涤2次，晾干，溶解于双蒸水；⑺将液体稀释到IOOyg·mIT1，保存在-20°C冰箱中备用。4.如权利要求2所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述步骤二的具体包括：1选择水稻当天开的颖花，去除其它早开和未开颖花；⑵用镊子将水稻内外颖分开，用锋利的小刀片切掉柱头；⑶用移液枪滴入浓度为IOOyg·mL-1的DNAIOyL在切口处；⑷合上颖壳，套袋，收获成熟的种子。5.如权利要求2所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述步骤二的DNA的转化都在1个单株不同穗上完成。6.如权利要求2所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述步骤四的PCR反应扩增程序为:95°C预变性5min;然后32个循环包括94°C变性45s，56°C退火30s，72°C延伸45s;72°C延伸5min;4°C保存待测，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离，银染观察并拍照。7.如权利要求2所述的利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法，其特征在于，所述提取液为2%CTAB，0.1MTris-HClpH8·0,0·02ΜNa2EDTA，1.4MNaCl，0.2%体积比的疏基乙醇。

百度查询： 长江大学 利用箭竹DNA结合花粉管通道水稻新种质的获取方法

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