申请/专利权人：广西医科大学第一附属医院

申请日：2018-06-20

公开（公告）日：2018-11-23

公开（公告）号：CN108865973A

主分类号：C12N5/071(2010.01)I

分类号：C12N5/071(2010.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.01.20#发明专利申请公布后的驳回;2018.12.18#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明提供了一种SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，通过选用4~5周龄的SD大鼠为原体，剥离胃窦组织后，在Ⅱ型胶原酶的作用下，经过离心操作分离出ICC细胞，在M199完全培养基中培养后，再经过消化操作和离心处理，得到分离好的ICC细胞。本发明所述的方法，选用4~5周龄（110±10g）的SD大鼠作为实验动物，避免了由于成年大鼠ICC细胞的高度分化，而造成细胞获得率低的弊端，同时本发明调整了Ⅱ型胶原酶的浓度，避免了低浓度长时间消化或者高浓度短时间消化对细胞造成的损伤；采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，避免了由于梯度离心对脆弱的细胞造成损伤。

主权项：1.SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、初步分离选用4~5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3‑5℃的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；S2、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2‑3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6‑10ml M199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入Ⅱ型胶原酶3‑5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36‑37℃中消化35~40min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，进行离心操作，加入M199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6~10min，用200‑300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；S3、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D‑hanks液洗2次，加入4ml M199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，进行消化操作后，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3ml M199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。

全文数据：SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法技术领域[0001]本发明属于细胞提取方法领域，具体是涉及到SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法。背景技术[0002]冑窦间质细胞ICC是作为胃肠运动的起搏细胞，可以产生自主节律性慢波电位，通过突出及缝隙连接作用于胃肠的平滑肌细胞，促进平滑肌的节律性舒缩。而多种胃肠病如慢性传输型便秘、功能性消化不良、糖尿病胃轻瘫等均与ICC的病理变化有关。现有的ICC原代细胞提取技术，多是采用成年SD大鼠，用n型胶原酶消化，梯度离心法进行纯化。但这种方式不能避免成年大鼠ICC细胞高度分化，不能避免梯度离心对细胞的损伤和丢失。发明内容[0003]本发明针对现有ICC细胞分离方法的缺陷，采用幼年4〜5周龄（110±10g的SD大鼠作为实验动物，采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，采用含有干细胞因子SCF的完全培养基进行培养，可以稳定、持续、高效获得高表达率的ICC细胞。[0004]本发明通过以下技术方案得以实现。[0005]SD大鼠冑窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：51、初步分离选用4〜5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死;用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3_5°C的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量pBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；52、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为lmm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6-10tnlMl"完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入n型胶原酶3-5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36-37°C中消化35〜40min，水平放置，每lOmin观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，进行离心操作，加入M199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6〜lOmin，用200-300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；53、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37°C、5%C02培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlM199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，进行消化操作后，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，l2〇〇rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。[0006]进一步的，所述步骤S1中，剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。[0007]进一步的，所述步骤S1中使用到的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。[0008]进一步的，所述步骤S2中，最后加入的M199完全培养基中，含有10%血清溶液及2%的青霉素-链霉素溶液。[0009]进一步的，所述步骤S2中的n型胶原酶的浓度为〇.4-0.6%。[0010]进一步的，所述步骤S2中的离心操作为，试样在1500rmin离心3min，去掉上清液，加入M199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500rmin离心3min，最后去掉上清液。[0011]进一步的，所述步骤S2中在水浴锅中的消化温度为36-37°C。[0012]进一步的，所述步骤S3中的消化操作为，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0•25%胰蛋白酶溶液2ml，于37°C消化lmim。[0013]进一步的，所述步骤S1-S3中使用的M199完全培养基中加入干细胞因子，加入的量为M199完全培养基体积的2_5%。[0014]本发明的有益效果为：1、本发明所述的方法，选用4〜5周龄（110±l〇g的SD大鼠作为实验动物，避免了由于成年大鼠ICC细胞的高度分化，而造成细胞获得率低的弊端，同时本发明调整了n型胶原酶的浓度，避免了低浓度长时间消化或者高浓度短时间消化对细胞造成的损伤;采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，避免了由于梯度离心对脆弱的细胞造成损伤；2、本发明所述的方法，采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，在含干细胞因子SCF的完全培养基培养，增加了ICC细胞的获得率，避免了提取过程中ICC细胞的丢失。具体实施方式[0015]下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。[0016]主要仪器和试剂:解剖显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、低温离心机、水浴锅、纯水机、台式高速低温离心机、高压消毒锅、超净台、低温冰箱、外科手术器械、胎牛血清、M199培养液、n型胶原酶、D-hanks液、PBS液、胰酶0.25%、青霉素-链霉素溶液、乙醚等。[0017]实验动物:SPF级SD大鼠，鼠龄月为4〜5周龄，体重11〇±i〇g，雌雄不限。实验前禁食不禁水12h。[0018]ICC细胞的鉴定方法：取分离好的ICC细胞，经PBS液清洗后，无水甲醛固定，5%脱脂奶粉封闭1〇min，加入c一kitantibody溶液，4°C孵育过夜，PBS液冲洗3遍，加入2%青霉素—链霉素溶液，37°C孵育lh，抗淬灭剂封片后与荧光显微镜先观察并拍照。[0019]实施例1SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：S1、初步分离选用4周龄的SD大鼠，禁食不禁水1¾后，米取乙醚吸入麻醉，颈椎脱白发处死;用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为:TC的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性;剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。[0020]S2、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为lmm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6!1111199完全培养基，于冰上静置5111111，去掉上清液，加入浓度为0.4%11型胶原酶3ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36°C中消化35min，水平放置，每lOmin观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500rmin离心3min，去掉上清液，加入M199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500rmin离心3min，最后去掉上清液;加入M199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6〜lOmin，用200目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；S3、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于36°C、5%C02培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlMl99完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每4Sh换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0.25%胰蛋白酶溶液2ml，于36°C消化lmim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。[0021]步骤S1-S3中使用的M199完全培养基中加入了1%的千细胞因子。[0022]实施例2SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：S1、初步分离选用5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死;用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为5°C的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性;剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。[0023]S2、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为lmm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入10mlMl"完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为〇•6%II型胶原酶3_5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅中37°C消化40min，水平放置，每lOmin观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在1500rmin离心3min，去掉上清液，加入M199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在I500rmin离心3min，最后去掉上清液，加入Ml"完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打lOmin，用300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；S3、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37°C、5%C02培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlMl99完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每4Sh换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0•25%胰蛋白酶溶液2ml，于37。：消化lmim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。[0024]步骤SI-S3中使用的Ml99完全培养基中加入了5%的干细胞因子。[0025]实施例3SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：S1、初步分离选用4.5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死;用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为4°C的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性;剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。上述所使用的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。[0026]S2、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入8mlMl99完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为〇•5%n型胶原酶4ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36•5°C中消化38min，水平放置，每l〇min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在15〇〇rmin离心3min，去掉上清液，加入M19Q完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在i500rmin离心3min，最后去掉上清液，加入M199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打Smin，用250目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；S3、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均勾的细胞悬液，置于36•5°C、5%C〇2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlM199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每4¾换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0•25%胰蛋白酶溶液2ml，于36.5C消化lmim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入Ml99完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，12〇〇rmin离心5tnin，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。[0027]步骤S1-S3中使用的Ml99完全培养基中加入了3%的干细胞因子。[0028]实施例4SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：S1、初步分离选用4•2周龄的SD大鼠，禁食不禁水1¾后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱白发处死;用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为4•5°C的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性;剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在1〇分钟内，在冰上操作。上述所使用的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。[0029]S2、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为lmm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入9•5mlMl99完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入浓度为〇.45%II型胶原酶3•5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅中36•7°C消化39min，水平放置，每lOmin观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，试样在15〇〇rmin离心3min，去掉上清液，加入M199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在i5〇〇rmin离心3min，最后去掉上清液，加入Ml"完全培养基f5ml，用粗口试管缓慢吹打9tnin，用300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；S3、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于36.8°C、5%C02培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlM199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D-hanks液，加入0•25%胰蛋白酶溶液2ml，于36.8°C消化lmim，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3miM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，i2〇〇rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。[0030]上述实施例中，步骤S1-S3中使用的M199完全培养基中分别加入了完全培养基体积的2%、5%、3%、4•5%的干细胞因子。[0031]对比例1实施例中在步骤S1选用成年大鼠来进行试验，其余条件和实施例3—致；对比例2实施例中在步骤S2中选用浓度为0.2%的n型胶原酶来进行消化，其余条件和实施例3一致；对比例3实施例中在步骤S2中选用浓度为0.9%的n型胶原酶来进行消化，其余条件和实施例3一致；将实施例1-4以及对比例1-3分离出的ICC细胞进行了鉴定，发现：将实施例1-实施例4分离出的ICC细胞，在荧光显微镜下可见细胞胞体呈红色荧光染色，红色局域分布均匀，没有别的杂色出现，说明分离出的ICC细胞较纯净，含量高；对比例1-3分离出的细胞胞体，在荧光显微镜下可见有部分细胞呈现红色荧光染色，红色局域分布混乱，有别的杂色出现，说明分离出的ICC细胞不纯净，可能还有部分平滑肌细胞，纯度较低。[0032]以上内容是结合具体的优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对这些己描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

权利要求：1.SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:包括以下步骤：51、初步分离选用4〜5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3-5°C的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；52、分离出ICC细胞将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6-10mlM199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入II型胶原酶3-5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36-37°C中消化35〜40min，水平放置，每1Omin观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，进行离心操作，加入M199完全培养基anl，用粗口试管缓慢吹打6〜lOmin，用200-300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；53、提纯ICC细胞将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37°C、5%C〇2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4mlMl99完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次;第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，进行消化操作后，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200rmin离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。2.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S1中，剥离组织的要求为:应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。3.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S1中使用到的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。4.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S2中，最后加入的M199完全培养基中，含有10%血清溶液及2%的青霉素-链霉素溶液。5.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S2中的n型胶原酶的浓度为0.4-0.6%。6.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S2中的离心操作为，试样在1500rmin离心3min，去掉上清液，加入M199完全培养基重悬洗去消化液，吹打混匀后再在1500rmin离心3min，最后去掉上清液。7.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S2中在水浴锅中的消化温度为36-37°C。8.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S3中的消化操作为，细胞悬液使用D-hanks液洗2次后，分出D_hanks液，加入0•四%胰蛋白酶溶液2ml，于37°C消化lmim。9.根据权利要求1所述SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，其特征在于:所述步骤S1-S3中使用的M199完全培养基中加入干细胞因子，加入的量为M199完全培养基体积的2-5%〇

百度查询： 广西医科大学第一附属医院 SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法

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