申请/专利权人：上海仁度生物科技有限公司

申请日：2012-07-02

公开（公告）日：2018-12-18

公开（公告）号：CN103525946B

主分类号：C12Q1/70(2006.01)I

分类号：C12Q1/70(2006.01)I;C12Q1/6844(2018.01)I;G01N21/64(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-专利权人的姓名或者名称、地址的变更

法律状态：2021.02.23#专利权人的姓名或者名称、地址的变更;2018.12.18#授权;2015.05.27#实质审查的生效;2014.01.22#公开

摘要：本发明公开了一种人季节性流感病毒H1N1HuH1N1的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、HuH1N1检测引物T7引物和nT7引物、HuH1N1检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测拭子中的HuH1N1 RNA，具有特异性高、灵敏度高可达100copies反应、污染低扩增产物RNA在自然环境下易于降解及快速检测常规50分钟完成检测的特点，将在人季节性流感早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

主权项：1.一种人季节性流感病毒H1N1HuH1N1的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的人季节性流感病毒H1N1即HuH1N1的靶标核酸的捕获探针，一对用于在M‑MLV反转录酶作用下产生HuH1N1靶标核酸的DNA拷贝的HuH1N1检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述HuH1N1靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuH1N1检测探针；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HuH1N1检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述HuH1N1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

全文数据：人季节性流感病毒H1N1HuH1N1的实时荧光核酸恒温扩増检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及病毒的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。背景技术[0002]流感病毒根据核蛋白（NP和基质蛋白不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，根据表面血凝素HA和神经氨酸酶NA的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。[0003]人季节性流感病毒HlNlHuHlNl属正粘液病毒科甲型流感病毒属，典型病毒呈球状。季节性流感病毒在每年换季时节都会流行蔓延，成为流行性感冒的重要种类，而甲型流感传染规律也带有季节性的特点。在冬季天气寒冷，人体抵抗力下降，室内活动增多情况下，季节性流感和甲型流感进入高发期，并有双重流行的风险。此外两种流感的典型病例症状相似，在临床上不易区分，只有通过实验室检测病毒核酸才能确定。[0004]目前常用的人季节性流感病毒的实验室检查方法包括：1免疫学检测方法，如快速流感抗原检测、免疫荧光法或装配的IFA，此法对操作者要求较高；2细胞生物学检测方法，常用有鸡胚接种法和细胞培养法。此法对病毒分离法较敏感，但需要2-3周时间，无法实现早起快速诊断。3分子生物学检测方法。目前有逆转录酶-聚合酶链式反应ReverseTranscriptase-PCR，简称RT-PCR和实时荧光定量聚合酶链式反应（RealTimeFluorescentQuantifiedPCR，简称FQPCR，RT-PCR采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象。实时荧光定量PCR虽在技术上解决了上述问题，其灵敏度和准确度较高，但操作复杂，检测成本相对昂贵，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。[0005]实时焚光核酸恒温扩增检测技术（SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT是一种直接快速检测RNA的方法，核酸扩增和检测使用M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行42°C，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。此SAT技术前期已由申请人申请专利并授权（ZL200810111479.0，结合利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法（ZL200810111478.6，发明人制备了人季节性流感病毒HlNlHuHlNl实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。发明内容[0006]本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及易于推广应用的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。[0007]本发明所提供的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HuHlNl靶标核酸HuHINIRNA的DNA拷贝的HuHlNl检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述HuHlNl靶标核酸HuHINIRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuHlNl检测探针。[0008]所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的靶标核酸HuHlNlRNA序列特异结合，在有HuHlNl内标HuHlNlICRNA时，其最好还可与该HuHlNl内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示;所述HuHlNl检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示;所述HuHlNl检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。[0009]进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl检测探针存在于一HuHlNl检测液中。[0010]再进一步所述试剂盒还包含有HuHlNl内标和内标检测探针;所述HuHlNl内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与HuHlNl靶标核苷酸HuHlNlRNA使用同一对引物Τ7和nT7,HuHlNl内标由序列表中序列7所示的HuHlNlICRNA;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于HuHlNl检测液中。[0011]更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、HuHlNl反应液、HuHlNl检测液、SAI1酶液、HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照和HuHlNl内标，其中：[0012]裂解液:含硫酸铵（順42S〇4和HEPES;[0013]核酸提取液:含捕获探针和磁珠；[0014]洗涤液:含NaCMPSDS;[0015]HuHlNI反应液：含dNTP和NTP;[0016]HuHlNl检测液:含T7引物、nT7引物、HuHlNl检测探针和内标检测探针；[0017]SAI1酶液:含M-MLV反转录酶、Τ7RNA聚合酶；[0018]HuHlNl阳性对照；含人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；[0019]HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸HuHINIRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；[0020]HuHlNI内标:含HuHlNI内标RNA序列如序列表中序列7所示稀释物。[0021]具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：[0022]1裂解液:HEPES25-250mM，（NH42S〇45-50mM;[0023]⑵核酸提取液:HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ优选为5-25μΜ，磁珠50-500mgL优选为50-250mgL;[0024]⑶洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，l%SDS，EDTA1-lOmM;[0025]4HuHlNl反应液：Tris10-50mM，MgCl210_40mM，dNTP0.1-10mM优选为0.5_5mM，NTPl-20mM优选为l-10mM，PVP401-10%，KC15-40mM;[0026]5HuHINI检测液：将HuHINI检测引物和HuHINI检测探针溶解在TE溶液（IOmMTris和ImMEDTA的混合液）中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol反应均可;其中T7引物浓度优选为IOpmol反应，nT7引物浓度优选为IOpmol反应，HuHlNl检测探针浓度优选为8pmol反应，内标检测探针浓度优选为8pmol反应；[0027]6SAT酶液:M-MLV反转录酶400-4000U反应优选为500-1500U反应）、T7RNA聚合酶200-2000U反应（优选为500-1000UKS、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L_cysteine、0·04-0·4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.U-0.5mMEDTA、0.卜I%vvTritonX-100和20-50%vvglycerol；[0028]⑺HuHlNl阳性对照;含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；[0029]8HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸（HuHlNlRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液；[0030]⑼HuHlNl内标:含IO2-IO5拷贝mLHuHlNlICRNA序列如序列表中序列7所示）体外转录RNA稀释物。[0031]另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述HuHlNl反应液、HuHlNl检测液、SAI1酶液、HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照及HuHlNl内标。[0032]所述HuHlNl阳性对照中的体外转录的HuHlNlRNA以下述方法制备：[0033]1用化学合成法合成HuHlNlHA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域其核苷酸序列如序列表中序列8所示）；[0034]2将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HuHlNl阳性对照质粒；[0035]3HuHlNl阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM®-T-HuHlNl菌株，贮存于_70°C;[0036]4从pGEM®-T-HuHlNl菌株中提取pGEM®-T-HuHlNl质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。[0037]所述HuHlNl内标中的体外转录的HuHlNlICRNA以下述方法制备：[0038]1用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HuHlNl靶标序列区域其核苷酸序列如序列表中序列9所示）；[0039]2将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HuHlNl内标质粒；[0040]3HuHlNl内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM®-T-HuHlNlIC菌株，贮存于_70°C;[0041]4从pGEM®-T-HuHlNlIC菌株中提取pGEM®-T-HuHlNlIC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。[0042]所述人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：[0043]1可与序列表中序列1所示的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的靶标核酸HuHlNlRNA序列特异结合的捕获探针TC0，TargetCaptureOligo，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；[0044]2用于在M-MLV反转录酶作用下产生HuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA的DNA拷贝的HuHlNl检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；[0045]3用于与在Τ7RNA聚合酶作用下根据所述HuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuHlNl检测探针，所述HuHlNl检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；[0046]⑷内标和内标检测探针，内标为HuHlNl核苷酸序列HuHlNlRNA的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物Τ7和ηΤ7引物），内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示HuHlNlICRNA，内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。[0047]所述试剂盒的使用方法，用于人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：[0048]1用裂解液裂解待测样品中的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl，得到含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl核酸的裂解液；[0049]2向步骤1的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在HuHlNl内标时，同时加入HuHlNlICRNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的核酸RNA和HuHlNlICRNA；[0050]3将步骤2提取的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的核酸RNA和HuHlNlICRNA加入由HuHlNl反应液和HuHlNl检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化;所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1;[0051]4根据荧光信号产生的时间和强度参照HuHIN1阳性对照、HuHIN1阴性对照和HuHlNl内标检测结果对待测样品进行定性检测。[0052]本发明提供了一种人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的HuHlNl检测相比，具有以下优点：[0053]1高特异性、高纯度、低污染:针对HuHlNl靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获HuHlNl的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。[0054]2快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。[0055]⑶污染易控:与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。[0056]4设备简单，成本低:与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。[0057]综上所述，本发明试剂盒能够检测拭子中的HuHlNlRNA，具有特异性高、灵敏度高可达lOOcopies反应）、污染低扩增产物RNA在自然环境下易于降解及快速检测（50分钟完成扩增检测）的特点，将在人季节性流感早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。[0058]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明[0059]图1为灵敏度的荧光检测结果[0060]图2特异性荧光检测结果[0061]图3为临床样本鼻拭子的靶标荧光检测结果[0062]图4为临床样本鼻拭子的内标焚光检测结果[0063]图5为采用凝胶电泳检测鼻拭子样本的检测结果具体实施方式[0064]本发明人季节性流感病毒HlNlHuHlNl检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增SAT技术结合而形成。[0065]本发明选取季节性流感HlNlHA基因保守区段，通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获HuHlNl的RNA;核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。[0066]本发明中的专用引物和探针包括：[0067]⑴捕获探针:一条可与序列表中序列1所示的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的靶标核酸（HuHlNlRNA序列特异结合的捕获探针（T⑶，TargetCaptureOligo，在有HuHlNl内标HuHlNlICRNA时，其还可与该HuHlNl内标序列特异结合;所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示。[0068]2HuHIN1检测引物：一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HuHIN1靶标核酸HuHlNlRNA的DNA拷贝的HuHlNl检测引物，所述HuHlNl检测引物由T7引物和nT7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；[0069]3HuHlNl检测探针：一条用于与在Τ7RNA聚合酶作用下根据所述HuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuHlNl检测探针，所述HuHlNl检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。[0070]为便于进行结果分析，还包括：（4一条内标检测探针和HuHlNl内标，内标检测探针为在使用HuHlNl内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；HuHlNl内标为HuHlNl核苷酸序列HuHlNlRNA的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物T7和nT7引物）AuHlNl内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为HuHlNlICRNAIC含义为内标。[0071]基于以上设计，本发明进一步提供一种人季节性流感病毒HlNlHuHlNl实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。[0072]该试剂盒，至少包含所述捕获探针（序列2，一对所述T7引物序列3和nT7引物序列4，以及一条所述HuHlNl检测探针序列5。[0073]进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl检测探针存在于HuHlNl检测液中。[0074]再进一步，所述试剂盒还可包含竞争性HuHlNl内标序列7和内标检测探针序列6，所述的内标检测探针存在于HuHlNl检测液中。[0075]更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、HuHlNl反应液、HuHlNl检测液、SAI1酶液、HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照和HuHlNl内标，各组分说明如下：[0076]1裂解液:用于裂解和保存待测样品中的甲型流感病毒HuHlNl，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵（ΝΗ42S〇4,优选为5-50mM;[0077]2核酸提取液:用于提取和纯化HuHlNl病毒RNA，为含捕获探针1-50μΜ优选为5-25μΜ和磁珠50-500mgL优选为50-250mgL的水溶液；[0078]3洗涤液:用于磁珠清洗，为含Iwt%SDS的水溶液。[0079]⑷HuHlNl反应液:SAT扩增所需组分，含dNTP0.l-10mM优选为0.5-5mM和NTPl-20mM优选为I-1OmM的水溶液；[0080]5HuHlNl检测液:含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-15pmol反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol反应，nT7引物浓度优选为IOpmol反应，HuHlNl检测探针浓度优选为8pmol反应，内标检测探针浓度优选为8pmol反应；[0081]6SAI1酶液:SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U反应优选为500-1500U反应）、T7RNA聚合酶200-2000U反应优选为500-1000U反应）；[0082]⑺HuHlNl阳性对照;含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；[0083]8HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸（HuHlNlRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；[0084]⑼HuHlNl内标:含IO2-IO5拷贝mLHuHlNl内标RNA序列7，是HuHlNl核苷酸序列HuHlNlRNA的竞争性内标，为体外转录RNAHuHlNlICRNA稀释物。[0085]以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下：[0086]裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的病毒靶标核酸RNA。病毒RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。[0087]HuHlNl检测液中HuHlNl检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。[0088]由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照和HuHlNl内标。其中，HuHlNl阳性对照和HuHlNl内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。[0089]通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照（以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照），可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检假阴性）的情况。HuHlNl内标作为HuHlNlRNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。[0090]利用以上试剂盒对人季节性流感病毒HlNlHuHlNl进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：[0091]1用裂解液裂解待测样品中的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl，得到含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl核酸的裂解液；[0092]2向步骤1的裂解液中加入核酸提取液，试剂盒内存在HuHlNl内标时，同时加入HuHlNlICRNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的核酸RNA和HuHlNlICRNA；[0093]3将步骤2提取的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的核酸RNA和HuHlNlICRNA加入由HuHlNl反应液和HuHlNl检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化;所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1;[0094]4根据荧光信号产生的时间和强度参照HuHIN1阳性对照、HuHIN1阴性对照和HuHlNl内标检测结果对待测样品进行定性检测。[0095]在上述检测操作中，所述步骤1中的待测样品为咽拭子或鼻拭子。[0096]所述步骤4中的HuHlNl阳性对照为含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物;HuHlNl阴性对照为不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液;HuHlNl内标为含IO2-IO5拷贝mLHuHlNl内标RNA序列7稀释物。[0097]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。[0098]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。[0099]实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的专用引物和探针的设计[0100]本发明选择HuHlNl病毒HA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域其核苷酸序列如序列表中序列1所示），根据引物探针设计原理，使用DNAATAR、DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：[0101]1一条可与如序列表中序列1所示的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的靶标核酸HuHlNlRNA序列特异结合的捕获探针TC0，TargetCaptureOligo，所述捕获探针的核苷酸序列为5,-UAG⑶UGACAGA⑶⑶⑶CA：UGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3,（序列表中序列2;[0102]2—对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA的DNA拷贝的HuHlNl检测引物，所述HuHlNl检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’-aatttaatacgactcactatagggagaCGCTATTAGATTTCCATTTGC-3’（序列表中序列3，ηΤ7引物序列为5’-GAAGGRAGAATYAACTACTAC-3’（Υ代表简并碱基，代表CT，R代表GA，序列表中序列4；[0103]3—条用于与在Τ7RNA聚合酶作用下根据所述HuHlNl靶标核酸HuHINIRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuHlNl检测探针，所述HuHlNl检测探针的核苷酸序列为5’-ccucucugcuggaacccgagg-3’（序列表中序列5，5’端用FAM焚光标记，3’端用DABCYL焚光记D[0104]4为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性HuHlNl内标序列7，设计了竞争性内标检测探针，HuHlNl内标与HuHlNl靶标核苷酸HuHlNlRNA拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述HuHlNl内标可通过HuHlNl靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与HuHlNl检测探针序列、荧光标记不同，但碱基数一致的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’-ccaggguaauucggcacguccugg-3’（序列表中序列6，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。[0105]实施例2、制备人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒[0106]利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针（TCO，TargetCaptureOligo、T7引物、nT7引物、HuHlNl检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶;试剂盒存在内标时，还包括内标检测探针。[0107]所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl检测探针、内标检测探针存在于HuHlNl检测液中，所述M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶存在于SAI1酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2_30°C储存的A盒标本处理单元和-15〜-35°C储存的B盒核酸扩增检测单元），A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括HuHlNl反应液、HuHIN1检测液、SAI1酶液、HuHIN1阳性对照、HuHIN1阴性对照，如果存在内标，B盒还包括HuHlNl内标，主要成分如下：[0108]A盒标本处理单元组成为：[0109]裂解液;含硫酸铵（順42S〇4和HEPES;[0110]核酸提取液:含捕获探针1-50μΜ优选为5-25μΜ和磁珠50-500mgL优选为50-250mgL；[0111]洗涤液：主要含Iwt%SDS。[0112]B盒核酸扩增检测单元组成为：[0113]HuHlNl反应液：含dNTP0·I-IOmM优选为0.5-5mM，NTPl-20mM优选为I-IOmM;[0114]HuHlNl检测液:含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-15pmol反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol反应，nT7引物浓度优选为IOpmol反应，HuHlNl检测探针浓度优选为8pmol反应，内标检测探针浓度优选为8pmol反应；[0115]SAI1酶液:含M-MLV反转录酶400-4000U反应优选为500-1500U反应），T7RNA聚合酶200-2000U反应优选为500-1000U反应）；[0116]HuHlNl阳性对照;含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；[0117]HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸HuHINIRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；[0118]HuHlNl内标:含IO2-IO5拷贝mLHuHlNlICRNA稀释物序列表中序列7。[0119]试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。[0120]具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：[0121]1裂解液:为裂解和保存人咽拭子和鼻拭子中的人季节性流感病毒HuHlNl，含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES25-250mM，（順42S〇45-50mM;[0122]2核酸提取液:为提取人季节性流感病毒HuHlNlRNA的含有oligodT包被的磁珠和特异结合靶标核酸HuHlNlRNA的一段RNA序列的溶液，具体包含HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ优选为5-25μΜ，磁珠50-500mgL优选为50-250mgL;[0123]3洗涤液：为含SDS、NaCl的溶液，具体包含HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，l%SDSl-10mM，EDTA1-lOmM;[0124]4仙!11~1反应液：为含1抑？8和抑？8扩增所需组份，具体包含1^81〇-5〇111]\1，MgCl210_40mM，dNTP0.1-10mM优选为0.5-5mM，NTPl-20mM优选为l-10mM，PVP40I-10%,KCl5-40mM；[0125]5HuHINI检测液:将恒温扩增时必需的HuHlNI检测引物和HuHlNI检测探针溶解在TE溶液（IOmMTris和ImMEDTA的混合液）中配制而成，引物和探针浓度在5-15pmol反应均可，其中T7引物浓度优选为IOpmol反应，nT7引物浓度优选为IOpmol反应，HuHlNl检测探针浓度优选为8pmol反应，内标检测探针浓度优选为8pmol反应；[0126]6SAT酶液:为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U反应优选为500-1500U反应）、T7RNA聚合酶200-2000U反应优选为500-1000U反应）、2_IOmMHEPESpH7.5、10_100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04_0.4mMzincacetate、l〇-IOOmMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKC1、0.01-0.5mMEDTA、0.卜1%vvTritonX-100和20-50%vvglycerol;[0127]⑺HuHlNl阳性对照;含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；[0128]8HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl靶标核酸HuHlNlRNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；[0129]⑼如果存在内标，HuHlNl内标:含IO2-IO5拷贝mLHuHlNl内标RNA序列表中序列7。[0130]HuHlNl阳性对照中的体外转录的HuHlNlRNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：[0131]1用化学合成法合成HuHlNlHA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域其核苷酸序列如序列表中序列8所示）；[0132]2将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HuHlNl阳性对照质粒；[0133]3HuHlNl阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM®-T_HuHlNl菌株，贮存于_70°C;[0134]4从pGEM®-T-HuHlNl菌株中提取pGEM®-T-HuHlNl质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。[0135]HuHlNl内标中的体外转录的HuHlNlICRNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：[0136]1用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HuHlNl靶标序列区域其核苷酸序列如序列表中序列9所示）；[0137]2将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HuHlNl内标质粒；[0138]3HuHlNl内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM®-T-HuHlNlIC菌株，贮存于_70°C;[0139]4从pGEM®-T-HuHlNlIC菌株中提取pGEM®-T-HuHlNlIC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。[0140]实施例3、人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测灵敏度[0141]用本发明试剂盒组成见实施例2,试剂盒内不存在HuHlNl内标，检测液中也不存在内标检测探针）测定浓度为IXIO4Copies反应、IXIO3COpies反应、IXIO2COpies反应、IOcopies反应的人季节性流感病毒阳性对照RNA，确定灵敏度下限。具体步骤如下：[0142]⑴稀释[0143]将IXIO4Copies反应的人季节性流感病毒阳性参考品RNA，10倍梯度稀释至IXIO3Copies反应、IXIO2Copies反应、IOcopies反应。[0144]⑵核酸提取[0145]2.1在每个样品处理管（I.5mL离心管）中加入200μ1裂解液含HEPES35mM，（冊42S〇420mM，200μ1流感病毒阳性参考品稀释液，用裂解液裂解人季节性流感病毒HlNlHuHlNl模拟样本处理），得到含有人季节性流感病毒HlNlHuHlNl核酸的裂解液。[0146]2.2在样品处理管（1.5mL离心管）中加入100μl核酸提取液含HEPES100mM，EDTA50mM，LiCl500mM，捕获探针20μΜ，磁珠200mgL混匀，60°C保温5分钟，室温放置10分钟。[0147]2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入ImL洗涤液含HEPES50mM，NaCl100mM，l%SDS，EDTA5mM振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。[0148]2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用此步应清晰可见磁珠）。[0149]3SAT核酸扩增检测[0150]3.1向样品处理管中加入40μ1反应检测液40μ1HuHlNl反应液+2.5μ1HuHlNl检测液）洗涤磁珠。HuHlNl反应液具体包含Tris30mM，MgCl220mM，dNTP5mM，NTP8mM，PVP405%，KC125mM;HuHlNl检测液中T7引物浓度为10pmol，nT7引物浓度为10pmol，HuHlNl检测探针浓度为8pmol，内标检测探针浓度为8pmol。[0151]3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μ1加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪美国ABI公司产品）60°C保温10分钟，42°C保温5分钟；向微量反应管中加入1Ομί已预热至42°C的SAI1酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAI1酶液中含M-MLV反转录酶1200U，T7RNA聚合酶800U反应，10mMHEPESpH7·5,20mMN-acetyl-L-cysteineN-乙酰-L-半胱氨酸），0·25mMzincacetate乙酸锌）、30mMtrehalose海藻糖）、100mMTris-HClpH8.0,200mMKC1，0·ImMEDTA，0.8%vvTritonX-100和40%vvglycerol丙三醇）；[0152]3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42°C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。[0153]⑷结果判定[0154]根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。[0155]阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）[0156]①阳性结果判定：[0157]FAX通道:dt45的样本为阳性;45dt50的样本建议重新检测，检测结果:dt50的样本为阳性。[0158]②阴性结果判定：[0159]阴性结果判定:FAX通道:dt无数值或为50,则为阴性。[0160]⑸结果[0161]图1显示灵敏度的检测图，为保证检测结果的可重复性，每个阳性参考品都重复检测2次，结果显示：当阳性参考品的浓度在lOcopies反应时，不可同时检出。而浓度在lOOcopies反应以上是，均可重复检出。人季节性流感病毒HlNlHuHlNl实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的灵敏度可达IOOcopies反应。[0162]实施例4、人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测特异性[0163]本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2,选取HuHlNl样本和3例阴性样本:柯萨奇16型病毒CA16、大肠杆菌01570157、淋病奈瑟菌NG，另设阴性对照、阳性对照各一个进行检测。检测方法及具体步骤同实施例3。[0164]检测结果如图2，阳性对照和HuHlNl样本分别在dt值12.5，19时，有扩增曲线，可判定为阳性;而3个阴性样本和阴性对照的扩增曲线平直且与基线无交叉，可明确判定为阴性;3个阴性样本为柯萨奇16型病毒CA16、大肠杆菌01570157、淋病奈瑟菌NG。[0165]实施例5、临床样本鼻拭子的实时焚光核酸恒温扩增检测[0166]本检测模式为本发明的另一个应用:试剂盒组成同实施例2试剂盒含有IXIO5拷贝mLHuHlNl内标，检测液内含有8pmol反应的内标探针），对编号1-4的人季节性流感病毒鼻拭子标本，以及各设一个阴性对照和阳性对照进行检测，具体包括以下检测步骤：[0167]⑴样本采集[0168]由临床医师根据实际情况进行标本采集，检测标本为鼻拭子，采集方法为:将带有聚丙烯纤维头的拭子分别插入鼻道内鼻腭处，将拭子侵入3_5mL生理盐水中，密封送检。样本采集后48小时内4°C保存送至流感监测网络实验室或者-70°C保存待测，一周内送达）。[0169]⑵核酸提取[0170]试剂盒内包含HuHlNl内标，故在核酸处理中，在每个样品处理管中加入ΙΟΟμΙ核酸提取液，需同时加入1〇μ1内标溶液，再混匀。其他具体操作步骤同实施例2。[0171]3SAT扩增检测[0172]同实施例3。[0173]⑷结果判定：[0174]根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。[0175]阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）[0176]①阳性结果判定：[0177]Fl通道FAX通道）：dt45的样本为阳性;45dt50的样本建议重新检测，[0178]检测结果Fl通道:dt50的样本为阳性。[0179]②阴性结果判定:Fl通道dt无数值或为50,同时F2通道VIC通道，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近）：dt彡45,则为阴性。[0180]质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照Fl通道:dt彡45;阴性对照Fl通道:dt无数值或为50,同时F2通道:dt彡45,否则此次检测结果视为无效。[0181]使用本发明试剂盒的检测结果如图3Fl焚光通道和图4F2荧光通道所示，焚光素通道Fl为FAM，F2为VIC。根据Fl通道和F2通道的dt值情况，判定样本1，2，4为阳性，样本3为阴性F2通道内，样本1-4及阴阳性对照的内标均可检出，反应体系没有受环境影响，排除假阴性），其结果与凝胶电泳检测完全结果一致（图5，+代表阳性对照，-代表阴性对照，M代表mark，表明本发明试剂盒用于检测临床样本咽拭子中的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl准确性高，且扩增检测时间仅需50分钟，具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。[0182]根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种人季节性流感病毒HlNlHuHlNl的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的人季节性流感病毒HlNl即HuHlNl的靶标核酸的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HuHlNl靶标核酸的DNA拷贝的HuHlNl检测引物T7和nT7，和一条用于与在Τ7RNA聚合酶作用下根据所述HuHlNl靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HuHlNl检测探针；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HuHlNl检测引物由Τ7引物和ηΤ7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示;所述HuHlNl检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7RNA聚合酶存在于一SAI1酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和HuHlNl检测探针存在于一HuHlNl检测液中。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含有HuHlNl内标和内标检测探针;所述HuHlNl内标为HuHlNl核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物即Τ7和ηΤ7引物，由序列表中序列7所示的HuHlNlICRNA;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于HuHlNl检测液中。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、HuHlNl反应液、HuHlNl检测液、SAI1酶液、HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照和HuHlNl内标，其中：裂解液:含硫酸铵順42S〇4和HEPES;核酸提取液:含捕获探针和磁珠；洗涤液:含NaCl和SDS;HuHlNl反应液:含dNTP和NTP;HuHlNl检测液:含T7引物、nT7引物、HuHlNl检测探针和内标检测探针；SAT酶液:含M-MLV反转录酶、Τ7RNA聚合酶；HuHlNl阳性对照;含人季节性流感病毒HlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；HuHlNl阴性对照：不含有人季节性流感病毒HlNl靶标核酸序列或不含有甲型流感病毒的溶液；HuHlNl内标：HuHlNlICRNA。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：⑴裂解液:HEPES25_25〇mM，（NH42S〇45_5〇mM;⑵核酸提取液:HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ，磁珠50_500mgL;⑶洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，l%SDS，EDTA1-lOmM;⑷HuHlNl反应液：Tris10-50mM，MgCl2l0-40mM，dNTP0·卜10mM，NTP卜20mM，PVP401-10%,KCl5-40mM；5HuHlNl检测液:将HuHlNl检测引物和HuHlNl检测探针溶解在TE溶液即IOmMTris和ImMEDTA的混合液中配制而成，各引物和探针浓度在5-15pmol反应；6SArT酶液:M-MLV反转录酶400-4000U反应、T7RNA聚合酶200-2000U反应、2-10mMHEPESpH7.5、10_100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04_0.4mMzincacetate、10_100mMtrehalose,40-200mMTris-HClpH8.0,40-200mMKCl,0.01-0.5mMEDTA.0.1-1%vvTritonX-100和20-50%vvglycerol;7HuHlNl阳性对照;含IO2-IO5拷贝mL人季节性流感病毒HlNlHA基因的体外转录RNA稀释物；⑻HuHlNl阴性对照:不含有人季节性流感病毒HlNl靶标核酸RNA序列或不含有甲型流感病毒的溶液；⑼HuHlNl内标:含IO2-IO5拷贝mLHuHlNlHA基因的体外转录RNA稀释物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:核酸提取液中，捕获探针的浓度为5-25μΜ，磁珠用量为50-250mgL;HuHlNl反应液中，dNTP浓度为0.5-5mM，NTP浓度为I-IOmM;HuHlNl检测液中，T7引物浓度为IOpmol反应，nT7引物浓度为IOpmol反应，HuHlNl检测探针浓度为8pmol反应，内标检测探针浓度为8pmol反应；SAI1酶液中，M-MLV反转录酶500-1500U反应，T7RNA聚合酶500-1000U反应。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述HuHlNl反应液、HuHlNl检测液、SAI1酶液、HuHlNl阳性对照、HuHlNl阴性对照及HuHlNl内标。8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于:所述HuHlNl阳性对照中的体外转录的HuHlNlRNA以下述方法制备：1用化学合成法合成HuHlNlHA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；⑵将片段克隆到pGEM-Τ载体中，构建HuHlNl阳性对照质粒；⑶HuHlNl阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM-T-HuHlNl菌株，贮存于-70°C；⑷纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA;或存在HuHlNl内标时，体外转录的HuHlNlICRNA以下述方法制备：1用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列同HuHlNl靶标序列区域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；⑵将片段克隆到pGEM-Τ载体中，构建HuHlNl内标质粒；3HuHlNl内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM-T-HuHINlIC菌株，贮存于-70°C；⑷纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

百度查询： 上海仁度生物科技有限公司 人季节性流感病毒H1N1(HuH1N1)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD