申请/专利权人：美利坚合众国，由健康及人类服务部部长代表

申请日：2016-01-20

公开（公告）日：2017-11-28

公开（公告）号：CN107406835A

主分类号：C12N7/01(2006.01)I

分类号：C12N7/01(2006.01)I;C12N15/45(2006.01)I;C07K14/135(2006.01)I;A61K39/295(2006.01)I;A61K39/155(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I

优先权：["2015.01.20 US 62/105,667"]

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2018.02.23#实质审查的生效;2017.11.28#公开

摘要：提供了包括编码异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒。在数个实施方案中，该重组副粘病毒是重组副流感病毒，诸如包括编码与来自PIV3的F蛋白的跨膜域和胞质尾连接的异源呼吸道合胞病毒F外域的病毒基因组的重组PIV3。还提供了包括重组副粘病毒的基因组的核酸分子。该重组病毒可以在疫苗配制剂，诸如针对副流感病毒和呼吸道合胞病毒的疫苗中有利地使用。

主权项：一种重组副粘病毒，其包含：包含编码I型膜蛋白的异源基因的病毒基因组，该I型膜蛋白包含与副粘病毒的F蛋白的胞质尾CT，或跨膜域TM和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSV F外域；且其中该重组副粘病毒是重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒1HPIV1，重组人副流感病毒2HPIV2，重组人副流感病毒3HPIV3，或重组牛副流感病毒3BPIV3。

全文数据：表达嵌合RSVBPIV3F蛋白的重组人牛副流感病毒3BHPIV3及其用途[0001]相关申请[0002]本申请要求2015年1月20日提交的美国临时申请No.62105，667的优先权，通过援引将其完整收录。[0003]领域[0004]本公开文本涉及包括如下病毒基因组的重组副粘病毒，该病毒基因组包括编码异源病毒的抗原的异源基因。例如，该重组副粘病毒可以是包括如下基因组的重组副流感病毒PIV，该基因组包括编码呼吸道合胞病毒RSV融合F蛋白的异源基因。[0005]背景[0006]副粘病毒是一个负义单链RNA病毒科，引起每年全世界许多动物和人死亡。副粘病毒包括副粘病毒亚科和肺病毒亚科。呼吸道合胞病毒RSV是副粘病毒科，肺病毒属中的一种有包膜的不分段负链RNA病毒。它是儿童在他们生命第一年中细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV还引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，可发生于任何年龄，尤其是在年老的或那些具有受损的心，肺，或免疫系统的中。当前使用被动免疫接种来预防由RSV感染引起的重病，尤其是在具有早产，支气管肺发育异常，或先天性心脏病的婴儿中。尽管某些群体中RSV感染的重担，有效RSV疫苗的开发仍然是难以捉摸的。[0007]像RSV—样，副流感病毒PIV是副粘病毒科中的另一种有包膜的不分段负链RNA病毒。然而，PIV在副粘病毒亚科中。PIV包括呼吸道病毒属包括PIVl，PIV3,仙台病毒和德国麻瘆病毒属包括PIV2，PIV4，PIV5的成员。另外，禽腮腺病毒属包括新城疫病毒NDV的成员在历史上称作PIV，而且在操作上可以相同考虑。人副流感病毒HPIV，血清型1，2,和3在全世界婴儿和儿童中引起严重呼吸道感染方面仅次于RSV，其中HPIV3是HPIV中就疾病冲击而言最重要的。HPIV基因组是大约15.5kb，包括3’-N-P-M-F-HN-L的基因次序。每种基因编码分开的mRNA，编码主要蛋白：N，核蛋白；P，憐蛋白；M，基质蛋白；F，融合糖蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白；L，大型聚合酶蛋白。P基因含有一个或多个另外的编码辅助蛋白的可读框ORF。与RSV类似，有效HPIV疫苗的开发仍然是难以捉摸的。[0008]概述[0009]提供了包括编码异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒。在数个实施方案中，该重组副粘病毒可以是包含如下病毒基因组的重组副流感病毒，该病毒基因组包含编码包含与副粘病毒的F蛋白的胞质尾CT，或跨膜域TM和CT连接的重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因。该副粘病毒可以是例如重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒IHPIVl，重组人副流感病毒2HPIV2，重组人副流感病毒3HPIV3，或重组牛副流感病毒3BPIV3〇[0010]令人惊讶地，当将该重组副粘病毒施用于受试者时，用异源RSVF蛋白的TM和CT交换副粘病毒F蛋白的相应TM和CT提供重组副粘病毒的包膜中RSVF外域并入的多倍升高，且剧烈提高针对外域的免疫应答的引发。进一步地，病毒中和性血清抗体的诱导在数量和质量方面均剧烈升高。因而，在数个实施方案中，所公开的重组副粘病毒可以包括在用于引发针对副粘病毒和异源RSVF蛋白的二价免疫应答的免疫原性组合物中。[0011]该由异源基因编码的RSVF外域可以来自人RSVF蛋白。在数个实施方案中，该RSVF外域可以包括一处或多处氨基酸替代（诸如“DS-Cavl”替代，S155C，S290C，S190FJPV207L以将该外域稳定化于RSVF融合前构象。在另外的实施方案中，该RSVF外域可以包括一处或多处氨基酸替代以提高外域表达或病毒包膜中的并入诸如“HEK”替代，K66E和Q101P。[0012]在一个非限制性实施方案中，该重组副粘病毒可以是重组BHPIV3且该RSVF外域是与来自BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。在一些此类实施方案中，与来自BPIV3F蛋白的TM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:21所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:21至少90%同一的氨基酸序列。[0013]在数个实施方案中，该重组副粘病毒是包含如下病毒基因组的重组PIV，该病毒基因组从上游到下游包含:PIV基因组启动子，接着是N，P，M，F，HN，和L基因。在一些此类实施方案中，该病毒基因组中包括的异源基因可以位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，或编码N和P蛋白的基因之间。[0014]在另外的实施方案中，该重组副粘病毒的病毒基因组中包括的异源基因可以是为了人细胞中的表达而密码子优化的。在更多实施方案中，该重组副粘病毒可以是减毒病毒。在其它实施方案中，所添加的基因及其编码的蛋白可以提供疫苗候选所需要的减毒。[0015]还提供了包括该重组副粘病毒的免疫原性组合物。该组合物可以进一步包括佐剂。还公开了在受试者中产生免疫应答的方法，其通过对该受试者施用有效量的所公开的重组副粘病毒进行。进一步提供的是包括本文中公开的任何重组副粘病毒的病毒基因组的分尚的核酸分子。[0016]本公开文本的前述和其它特征和优点会由于下述数个实施方案的详细描述变得更加明白，这提及附图进行。[0017]附图简述[0018]图1。表达多种型式的含有非HEK或HEK氨基酸指派的RSVF蛋白的rBHPIV3载体的构建。使用GeneArtGA算法为了人表达而密码子优化F0RF。构建物称作non-HEKGA-opt和HEKGA-opt。服66E，101P和non-HEK66K，101Q氨基酸指派以星号标示。其它注释：S，信号序列;p27，通过切割-活化释放的27k蛋白片段;FP，融合肽;TM，跨膜;CT，胞质尾。将RSVFORF放置在BPIV3基因起点和基因终点转录信号控制下并插入BHPIV3载体的N和P基因之间的第2基因组位置。rBHPIV3载体包括来自BPIV3的N，P，M，和L基因，和来自HPIV3的F和NH基因。相同载体基因组位置和载体转录信号用于图1-35中描述的所有表达RSVF蛋白的其它rBHPIV3载体。[0019]图2A和2BDRSVF蛋白中HEK指派的存在导致与非HEKF蛋白相比蛋白质表达升高和蛋白质三聚体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迀移率降低。于32°C以IOTCID5q的MOI用表达HEK或非HEKRSVF的载体来自GA优化的0RF，显示于图1感染Vero细胞。在感染后48小时制备细胞裂解物。在煮沸并还原后A或在没有煮沸和还原的情况下⑻通过电泳分析等量的细胞裂解物。用商品化RSVF特异性小鼠单克隆抗体检测变性且还原的RSVF单体A。用通过重复免疫接种蔗糖纯化的RSV颗粒在家兔中生成的多克隆抗体检测天然RSVF三聚体⑻。[0020]图3A和3B。感染有表达非HEK或HEKRSVF蛋白的rBHPIV3载体的Vero细胞单层中合胞体的形成。于32°C以IOTCID5q的MOI用表达具有A非HEK或⑻HEK指派的GA密码子优化的RSVF的rBHPIV3见图1感染细胞。在感染后48小时获取感染细胞的图像。以短划线轮廓标示代表性合胞体。[0021]图4。表达为了人表达通过不同算法密码子优化且含有HEK指派的RSVFORF的rBHPIV3载体的构建。使用GA算法HEKGA-opt，显示于图I，DNA2.0算法HEKD2-〇pt，或GenScriptGS算法HEKGS-opt为了人密码子选择而优化编码具有HEK指派的RSVF蛋白的0RF。将这些密码子优化的ORF与非HEK，非优化型式的RSVF0RFnon-HEKnon_opt比较。在与图1中完全相同的位置且与图1中相同的载体信号一起，将这些RSVFORF插入rBHPIV3载体。[0022]图5A和5BASVF蛋白来自rBHPIV3载体的体外表达由于HEK指派和密码子优化而升高。通过Western印迹分析评估RSVF在AVero和BLLC-MK2细胞中的表达。于32°C以IOTCID5q的MOI用标示的rBHPIV3载体感染细胞，并在感染后48小时收获细胞裂解物。将裂解物提交还原和变性条件下的凝胶电泳并通过Western印迹进行分析。蛋白质通过与荧光抗体的反应来显现并通过红外线成像来检测。用总共三个孔每种病毒实施实验。一种对RSVF特异性的单克隆抗体检测未切割的Fo前体和已切割的?:亚基。对RSVF1条带强度定量并针对以“1”标示的non-HEKnon-opt样品的条带强度标准化。还测定HPIV3HN蛋白的表达作为载体蛋白表达的内部对照及确保MOI和复制的等价性;使用β-肌动蛋白作为加载对照。[0023]图ORF的HEK和密码子优化对载体感染的Vero细胞单层中合胞体形成的影响。模拟感染（模拟）细胞或用空rBHPIV3载体（空ΒΗ3或用表达不含HEK且非优化的（non-HEKnon-opt或含HEK且GA优化的（HEKGA-opt或含HEK且DNA2.0优化的（HEKD2-〇pt或含HEK且GS优化的（HEKGS-optRSVFORF的rBHPIV3载体感染细胞。于32°C以IOTCID50的MOI实施感染并在感染后48小时获取图像。在一些小图中用短划线轮廓标示代表性合胞体。[0024]图7A和7B。自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEKRSVF蛋白的rBHPIV3载体的多周期体外复制。于32°C以0.01TCID5Q的MOI用空rBHPIV3载体（空BH3或表达不含HEK且非优化的（non-HEKnon-opt或不含HEK且GA优化的（non-HEKGA-opt或含HEK且GA优化的（HEKGA-opt或含HEK且GS优化的（HEKGS-optRSVFORF的载体一式三份感染㈧LLC-MK2和⑻Vero细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样达6天，于32°C通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID5Qml报告。显示了来自三项独立实验的均值滴度土SEM。[0025]图8A和8B。自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEKRSVF蛋白的rBHPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.1ml接种体中用IO5TCID5q标示的rBHPIV3载体或IO6PFUwtRSVA2株鼻内（IN感染金黄色叙利亚仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死η=6每种病毒每天），取出（A鼻甲和⑻肺，匀浆，并于32°C通过LLC-MK2rBHPIV3载体或VeroRSV细胞上的有限稀释测定病毒滴度:空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚和实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。检测限度LOD为1.5l〇g1QTCID5Qg组织，以短划线标示。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rBHPIV3载体并作为TCID5Qg报告;通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFUg报告。[0026]图9。来自感染有自非优化的或密码子优化的ORF表达HEK或非HEKRSVF蛋白的rBHPIV3载体的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.Iml接种体中给仓鼠（η=6只动物每种病毒）IN接种IO5TCID5q标示的rBHPIV3载体或IO6PFUwtRSV。在免疫接种后28天收集血清样品，并通过使用于32°C在豚鼠补体存在下在Vero细胞上实施的60%噬斑减少中和测试PRNT6q测定RSV中和性抗体滴度。每一个符号代表一只个别动物。每个柱的高度代表每个组的均值滴度。均值滴度的值显示于柱的上方。通过水平线显示均值的标准误差。中和测定法的检测限度为5.3倒数l〇g2PRNT6Q，以点线标示。[0027]图IOA和10B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用IO6PFUwtRSVIN攻击如图9中所示用标示的rBHPIV3载体或用wtRSV免疫接种的仓鼠（n=6只动物每种病毒）。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集A鼻甲和B肺。通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为Iog1Q2.7PFUg组织，以短划线标示。[0028]图11。表达分泌型Ecto，融合后，和稳定化融合前形式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体的构建。这些已修饰蛋白质均含有HEK指派且自（为了人表达GA优化的ORF表达。注释：S，信号序列；p27,通过切割-活化释放的27k蛋白片段;FP，融合肽;TM，跨膜;CT，胞质尾。HEKGA-opt构建物表达全长RSVF。外域或“ecto”形式由RSVF蛋白的氨基酸1-513组成；它缺少CT和TM锚且会是分泌可得的。“融合后”形式通过自融合肽的N末端进一步删除头10个氨基酸（FP;137-146aa而衍生自外域（l-513aaMcLellanetal，2011,JVirol85:7788-96。“DS”和“DS-Cavl”是两种型式的全长RSVF蛋白，通过S155CS290C突变DS或通过DS和S190FV207LCavl突变而稳定化于融合前形式McLellanetal,2013,Science342:931。在图1和4中描述的相同位置中且与图1和4中描述的相同载体信号一起将编码这些各种各样形式的RSVF的ORF插入rBHPIV3载体。[0029]图12A和12B。表达分泌型，融合后，和稳定化融合前形式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体的多周期体外复制。以0.OITCID5q的MOI用空rBHPIV3载体空BH3或用标示的构建物感染ALLC-MK2和⑻Vero细胞:HEKGA-opt;Ecto;融合后;和DS描述见图11。如下测定于32°C6天时间段期间的病毒复制，即以24小时间隔收集培养基上清液样品并通过LLC-MK2细胞上的有限稀释实施病毒滴定。突变蛋白的图见图11。星号*指示所有这些RSVF构建物是含HEK且GA优化的。[0030]图13A和13B。分泌型（Ecto，融合后，和稳定化融合前形式的RSVF蛋白来自rBHPIV3载体的体外表达。以IOTCID5Q的MOI用标示的rBHPIV3载体或以IOPFU的MOI用wtRSV感染Vero细胞。将感染细胞于A32°C或⑻37°C温育48小时。收获用表达融合后，Ecto，或HEKGA-opt的rBHPIV3载体，或用wtRSV感染的细胞的A培养基上清液和裂解物，和用具有11〇11-冊111〇11-^扒邢164-^105，或05-03¥1形式的1«¥?的沾冊1¥3载体感染的细胞的⑻裂解物，并通过Western印迹分析RSVF表达。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是GA优化的。[0031]图14A和14B。表达分泌型Ecto，融合后，和稳定化融合前形式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.1ml接种体中用IO5TCID5q标示的rBHPIV3载体或IO6PFUwtRSVIN感染仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死n=6每种病毒每天），取出A鼻甲和⑻肺，匀浆，并于32°C通过LLC-MK2细胞rBHPIV3载体s或VeroRSV细胞上的有限稀释测定病毒滴度:空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚或实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。第5天滴度的均值显示于顶部。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rBHPIV3载体并作为TCID5Qg报告;通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFUg报告。检测限度LOD为1.51ogioTCID5〇g组织，以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定峰滴度之间差异的统计学显著性并以星号标示;*，？0.05。[0033]图16A和16B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用IO6PFUwtRSVIN攻击如图15中所示免疫接种的仓鼠（n=6只动物每种病毒）。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集㈧鼻甲和⑻肺。于32°C通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为l〇g1Q2.7PFUg组织，以点线标示。[0034]图17A和17B。表达试图提高掺入载体颗粒而改造的型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体的构建。AF蛋白的结构。⑻RSVF蛋白（氨基酸指派为黑体和BPIV3F蛋白（粗体的外域的胞质尾CT，跨膜TM域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。这些已修饰蛋白均含有HEK指派且自GA优化的ORF表达。HEKGA-opt构建物表达全长RSVF蛋白。“B3CT”中RSVF蛋白的CT氨基酸序列位置551-574用BPIV3F蛋白的CT位置515-540,粗体替换。“B3TMCT”中RSVF蛋白的TM和CT二者（位置530-574用BPIV3F蛋白的TM和CT位置494-540,粗体替换。“DSB3CT”，“DSB3TMCT”，“DS-CavlB3CT”，和“DS-CavlB3TMCT”是含有设计成稳定化融合前构象的DS或DS-Cavl突变的型式的B3CT和B3TMCT。在图1，4,和11中描述的相同位置中且与图1，4,和11中描述的相同载体信号一起将编码这些各种各样形式的RSVF蛋白的ORF插入rBHPIV3载体。[0035]图18A和ISB13BSCT和B3TMCT型式的RSVF蛋白掺入rBHPIV3载体颗粒。于32°C以0.01TCID5Q的MOI用标示rBHPIV3载体感染LLC-MK2细胞。感染后6-7天收获培养基上清液，通过低速离心澄清，并提交10%-30%蔗糖梯度上的离心以获得部分纯化的载体颗粒。以0.OlPFU的MOI用wtRSV感染另外的Vero细胞并以相同方式加工。通过标准商业性试剂盒测定蔗糖纯化的制备物的蛋白质浓度。（ARSVF蛋白包装入rBHPIV3颗粒的效率的Western印迹评估。为了比较颗粒中RSVF的相对量，裂解0.5yg蔗糖纯化的颗粒，变性，还原并提交Western印迹分析。对载体颗粒的HPIV3HN和BPIV3N蛋白定量用于比较。⑻通过将其条带强度针对BPIV3N蛋白标准化来计算每一种形式的RSVF包装入其各自载体颗粒的效率。道的次序与A部分相同。相对于设为“Γ的天然F蛋白显示各种形式的RSVF的包装效率。B3CT和B3TMCT形式的RSVF包装入载体颗粒的效率判断为与RSVF包装入RSV颗粒的效率相似，因为已修饰RSVF蛋白每0.5yg载体颗粒的量3,4，6,7道与天然RSVF蛋白每0.5ygRSV颗粒的量5道相似。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。[0036]图lgA-BFASCT和B3TMCT型式的RSVF蛋白掺入rBHPIV3颗粒通过透射电子显微术TEM的显现。用RSVF特异性鼠单克隆抗体和用6nm金颗粒标记的小鼠IgG特异性二抗标记蔗糖纯化的病毒。用TEM显现病毒粒体和金颗粒。显示了（ARSV，（B空rBHPIV3载体空BH3，⑹表达HEKGA-opt的载体，⑼表达B3CT的载体，⑹表达B3TMCT的载体，和F表达DSB3TMCT的载体的代表性图像。箭指向HEKGA-opt病毒粒体中的零星金颗粒⑹。实质性更大量的与载体颗粒相关的金颗粒在D，E，和F中是明显的。[0037]图20A和20B。表达B3CT和B3TMCT型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体的多周期体外复制。于32°C以0·0ITCID50的MOI用空rBHPIV3载体（空BH3或表达HEKGA-opt，或B3CT上部小图），或B3TMCT上部小图），或DSB3CT下部小图）或DSB3TMCT下部小图）的载体感染㈧LLC-MK2和⑻Vero细胞。以24小时间隔收集培养基上清液的小样，于32°C通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法测定病毒滴度，并作为TCID5Qml报告。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化。测定法中的感染复数为0.01。[0038]图21A和21B。有或无稳定化融合前形式的RSVF蛋白的DS或DS-Cavl突变的B3CT和B3TMCT型式的RSVF蛋白的体外表达。⑷B3CT和B3TMCT;和⑻DS和DS-Cavl与B3CT和B3TMCT的组合的表达。以IOTCID5q的MOI用标示的rBHPIV3载体，或以10PFU的MOI用RSV感染Vero细胞。将感染细胞于㈧32°C或⑻37°C温育48小时。通过Western印迹对细胞裂解物分析RSVF表达。使用HPIV3HN蛋白作为对照来显示载体复制的等价性;使用GAPDH作为加载对照。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。[0039]图22。表达有或无稳定化融合前形式的RSVF蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体感染的Vero细胞单层中合胞体的形成。以IOTCID5q的MOI用表达标示型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体感染Vero细胞并于32°C温育。在感染后48小时获取图像。以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。[0040]图23A和23B。表达有或无稳定化融合前形式的RSVF蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体在仓鼠中的复制。在0.Iml接种体中用105TCID5QrBHPIV3载体或IO6PFUwtRSVIN感染仓鼠。在感染后第3和5天对仓鼠处以安乐死6只每种病毒每天），取出㈧鼻甲和⑻肺，勾浆，并于32°C通过LLC-MK2rBHPIV3载体）或VeroRSV细胞上的有限稀释测定病毒滴度:空心和实心圆形分别标示在第3和5天处死的动物的滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且分别以虚或实水平线标示在第3和5天每个组的均值滴度。第5天滴度的均值显示于顶部。通过LLC-MK2细胞上的有限稀释测定法滴定rBHPIV3载体并作为TCID5Qg报告;通过Vero细胞上的噬斑测定法滴定RSV并作为PFUg报告。检测限度LOD为1.51ogi〇TCID5〇g组织，以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定峰滴度之间差异的统计学显著性并以星号标示（*，P彡0.05;**，P彡0.01;或***，P彡0.001。沿着X轴以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。没有检查含有DS-Cavl修饰的构建物，因为它们在这项实验时不可得。[0041]图24A和24B。来自表达有或无稳定化融合前形式的RSVF蛋白的DS突变的B3CT或B3TMCT型式的RSVF蛋白的rBHPIV3载体感染的仓鼠的血清RSV中和性抗体滴度。在0.1ml接种体中给仓鼠（n=6只动物每种病毒）IN接种IO5TCID5q标示rBHPIV3载体或IO6PFUwtRSV。在免疫接种后28天收集血清样品，并在有㈧或无B添加豚鼠补体的情况下通过60%噬斑减少中和测试PRNT6q测定抗体滴度。每个柱的高度代表均值滴度，连同SEM显示。均值滴度的值显示于柱的上方。中和测定法的检测限度以点线标示。通过Tukey-Kramer检验确定均值滴度的差异的统计学显著性并以星号标示*，？彡0.05;**，？彡0.01;118，？彡0.05。ND，中和滴度在检测限度以下。沿着X轴以星号*标示的构建物含有HEK指派且是为了人表达而GA密码子优化的。[0042]图25A和25B。免疫接种仓鼠针对RSV攻击的保护。在免疫接种后第31天在0.1ml接种体中用IO6PFUwtRSVIN攻击如图24中所示免疫接种的仓鼠（n=6只动物每种病毒）。在攻击后第3天，对仓鼠处以安乐死并收集㈧鼻甲和⑻肺。于32°C通过Vero细胞中的噬斑测定法测定组织匀浆物中的RSV滴度。每一个符号代表一只个别动物，而且以水平线显示各组的均值病毒滴度。测定法的检测限度为l〇g1Q2.7PFUg组织，以点线标示。[0043]图26。在仓鼠中复制期间RSVF通过rBHPIV3载体表达的稳定性。通过直接自组织匀浆物回收的载体的双重染色噬斑测定法测定在免疫接种后第3和5天鼻甲和肺中回收的表达RSVF的载体的百分比。表述个别动物的结果。标示了所测试的标本中表达RSVF蛋白的rBHPIV3的百分比。100%表达RSVF蛋白的标本着黄色;90-99%表达RSVF的标本着绿色；80-89%表达RSVF的标本着橙色；少于79%表达RSVF的标本着红色。由于低滴度而不生成噬斑的标本标注“NA”。如果样品生成的噬斑的总数少于10,那么噬斑的数目在括号中记录为“P=X”（X等于噬斑的数目）。[0044]图27AHPIV3载体的温度敏感性表型。对标示的载体评估于标示的温度在LLC-MK2细胞上形成噬斑的能力。噬斑形成降低多100倍指示温度敏感性。以粗体，下划线标示每一种病毒的最低的此类限制性温度，称作关闭温度。[0045]图28。在非人灵长动物恒河猴）中对rBHPIV3构建物评估减毒和免疫原性。恒河猴通过组合的IN和气管内路径感染IO6TCID5q每个部位下述构建物:non-HEKnon-opt;HEKGA-optDS;和HEKGA-〇ptDSB3TMCT，分别以5，5和4只动物的组。[0046]图29A和29Β0.05。图57A:在添加的补体缺失下通过PRNT6q测定免疫接种后第28天时的RSV中和性抗体滴度。中和测定法的检测限度以点线标示。通过成对Studentt检验确定每个时间点时均值滴度的差异的统计学显著性ns，P0.05。[0072]图58A和58B。自N前位置表达HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT的rBHPIV3载体的构建，及HPIV3HN蛋白的氨基酸序列的修饰以实现载体的表型稳定性升高。图58A:HEKGS-optDS-CavlB3TMCT插入物插入rBHPIV3的第一基因位置。图58A:赋予表型稳定性升高的HPIV3HN基因修正。通过反求遗传学生成的原始重组HPIV3DurbinetalVirology235:323-332,1997中的HN基因具有HN基因中的两处工程化核苷酸替代，在反基因组位置7913和7915，导致氨基酸替代P370T，和一处偶然突变，在反基因组位置7593，导致氨基酸替代T263I。在这里，将这些突变变回“野生型”指派，即在生物学衍生HPIV3株JS中找到的GenbankZ11575.1;StokesetalVirusRes25:91_103，1992〇[0073]图59A和59BJSVF和载体蛋白通过表达第一基因位置N前）或第二基因位置N-P中各种型式的RSVF蛋白的载体的细胞内表达。rBHPIV3-wtHN-HEKGS-optDS-CavlB3TMCTpre-N，图58A中示意的构建物的分析。用空rBHPIV3载体（空BH3，1道），或wtHNHEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCTpre-N构建物集合CL20a，CL24a，3和4道），或相同型式的RSVF插入第二N-P位置的载体HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCTN-P，5道），或non-HEKnon-opt型式的RSVF插入N前位置的载体6道），或wtRSV2道），或模拟7道感染Vero图59A和LLC-MK2图59B细胞。以IOTCID5q细胞的MOI感染载体，并以3PFU细胞的MOI感染wtRSV。感染单层于32°C温育。在感染后48小时收集细胞裂解物并提交Western印迹分析。检测已切割FjP或未切割Fo形式的RSVF。使用BPIV3N和P蛋白来评估对载体蛋白表达的影响。使用GAPDH作为加载对照。[0074]图60APIV1载体:RSVF蛋白（A2株，氨基酸指派和HPIVlF蛋白（粗体的外域的胞质尾CT，跨膜TM域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。RSV-F-TMCT是一种嵌合蛋白，由RSVF蛋白的外域附着至HPIVlF蛋白的TM和CT域组成。[0075]图61和62。表达设计成稳定化于融合前构象DS-Cavl及提高掺入HPIVl载体颗粒的型式的RSVF蛋白的HPIVI-Cmtq载体的构建。这些已修饰RSVF插入物均含有HEK指派HEK且是为了人表达通过GS密码子优化的（GS-opt。通过DS和Cavl突变DS-Cavl本身图61和62中的上部构建物或伴有它的TMCT域用来自HPIVlF的TMCT域替换的进一步修饰TMCT，图61和62中的下部构建物），RSVF插入物改造成稳定化于融合前构象。所得HEKGS-optDS-Cavl和HEKGS-optDS-CavlTMCT型式的RSVF通过侧翼序列及在（图61第一基因位置MluI位点）或（图62第二基因位置AscI位点）插入HPIV1-CA17载体HPIV1载体和CΛ17突变的解释见实施例2来修饰。在每一种情况中，RSVF在HPIVl转录信号控制下，作为分开的mRNA表达。核苷酸编号方式相对于最终构建物的完整反基因组RNA序列。SEQIDNO:146和147的序列显示在FlHEKGS-〇ptDS-Cavl，FlHEKGS-〇ptDS-CavlTMCT，F2HEKGS-optDS-Cavl，和F2HEKGS-〇ptDS-CavlTMCT的示意图下在RSVF插入物侧翼。[0076]图63。表达无或有来自HPIVlF蛋白的TMCT，稳定化于融合前构象DS-Cavl的RSVF的rHPIVl-CA17Q载体在Vero细胞中的多周期生长的动力学。以0.01的MOI用构建物一式三份感染Vero细胞并于32C温育7天。在7天里以24小时间隔收集总共3mL培养物上清液中的0.5mL。收集样品后，对每一份培养物添加0.5mL新鲜培养基以恢复原始体积。通过血细胞吸附测定法在LLC-MK2细胞上实施所收集的样品的病毒滴定并以均值±SEM将数值绘图。[0077]图64。无或有来自HPIVlF蛋白的TMCT的稳定化于融合前构象DS-Cavl的RSVF蛋白掺入HPIVI-Caito病毒粒体颗粒。使标示的病毒构建物（为了简要，省略名称HEKGS-opt在LLC-MK2细胞中生长并通过蔗糖梯度离心来纯化病毒粒体。通过BCA测定法测定纯化的病毒的蛋白质浓度。将Iyg来自每一种纯化的病毒的总蛋白质在RIPA裂解缓冲液中裂解，还原，变性，并提交SDS-PAGE和Western印迹分析。分别用小鼠单克隆和家兔多克隆HPIVl肽特异性N，F，和HN抗体检测RSVF顶部小图）和HPIVl蛋白（第二，第三，和第四小图）。使用红外线标记的二抗来检测结合的一抗。2和4道中的嵌合RSV-F-DS-CavITMCT蛋白（第四小图）是可见的，因为对HPIVlF蛋白特异性的抗肽血清是使用含有CT域C端18个氨基酸的合成肽生成的，且因而与携带HPIVlF蛋白TMCT域的RSVF蛋白反应。[0078]图65。无和有来自HPIVlF蛋白的TMCT的稳定化于融合前构象DS-Cavl的RSVF蛋白在感染Vero细胞中的表达。以5的MOI给6孔板中的Vero细胞单层接种标示的病毒为了简要，省略名称HEKGS-opt，包括wtHPIVl和rHPIVl-CA17Q空载体对照并于32°C温育48小时。通过在200yLLDS样品缓冲液中裂解单层来制备细胞裂解物。将蛋白质样品还原并变性，并取45yL每一份样品进行电泳，接着将蛋白质转移至PVDF膜。使用与图64中描述相同的一抗和二抗检测RSVF和HPIVl蛋白。[0079]图66DRSVF蛋白（氨基酸指派和HPIV3F蛋白（粗体）的外域的胞质尾CT，跨膜TM域，和毗邻区的序列，标示了氨基酸序列位置。RSV-F-H3TMCT是一种嵌合蛋白，由RSVF蛋白的外域附着至HPIV3F蛋白的TM和CT域组成。[0080]图67A和67B。表达设计成稳定化于融合前构象DS-Cavl及提高掺入rHPIV3载体颗粒的型式的RSVF蛋白的rHPIV3载体的构建。载体是野生型rHPIV3JS株，其经修饰含有HN蛋白中的263T和370P氨基酸指派见图58B，发现它们赋予载体以表型稳定性。另外，通过创建位置103-109处的BlpI位点A，顶部构建物），用于在基因位置1中插入RSVF或可能任何其它插入物），或创建位置1675-1682处的AscI位点B，顶部构建物），用于在基因位置2中插入RSVF来修饰rHPIV3载体。已修饰的RSVF插入物均含有HEK指派HEK且是为了人表达而通过GS密码子优化的GS-opt。另外，通过DS和Cavl突变DSCavl本身A和B，第二构建物或伴有它的TMCT域用来自rHPIV3F的TMCT域替换的进一步修饰H3TMCT，A和B，第三构建物），RSVF插入物改造成稳定化于融合前构象。所得HEKGS-optDS-Cavl和HEKGS-optDS-CavlH3TMCT型式的RSVF通过侧翼序列及插入wtrHPIV3JS的A第一基因位置BlpI位点或⑻第二基因位置AscI位点）来修饰。在每一种情况下，RSVF在HPIV3转录信号控制下，作为分开的mRNA表达。核苷酸编号方式相对于最终构建物的完整反基因组RNA序列。SEQIDNO:148的序列显示于rHPIV3wt-JS的示意图下。SEQIDNO:149和150的序列显示在FlHEKGS-〇ptDS-Cavl，FlHEKGS-〇ptDS-CavlH3TMCT，F2HEKGS-〇ptDS-Cavl，和F2HEKGS-〇ptDS-CavIH3TMCT的示意图下在RSVF插入物侧翼。[0081]序列表[0082]如37C.F.R.1.822中限定的，所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示的。只显示了每种核酸序列的一条链，但是理解的是通过对所显示的链的任何提交而包括互补链。序列表是作为ASCII文本文件以2016年1月19创建的名为“序列.txt”的文件（〜344kb的形式的提交，通过援引将其收入本文。在所附序列表中：[0083]详述[0084]一项在先研究ZimmeretalJVirol200579:10467-77评估了仙台病毒中来自异源基因的RSVF蛋白的表达，仙台病毒是HPIVl的鼠亲戚，而且还与HPIV3紧密相关。该研究显示很少的RSVF蛋白掺入仙台病毒载体颗粒。调查人员将RSVF蛋白的CT或CT加TM用来自仙台F蛋白的对应序列替换，前提是这会改善外来RSVF蛋白与载体颗粒的相互作用的效率。这些修饰确实提高工程化RSVF掺入仙台颗粒，但仅在仙台F蛋白基因也删除的情况中。删除载体F蛋白的要求与生成感染性，减毒病毒供疫苗接种用不相容，而且还会去除认为是生成二价疫苗所需要的载体保护性抗原之一。[0085]如本文中公开的，当由rBHPIV3，HPIV3，或HPIVl表达时，包括RSVFTM和CT的RSVF蛋白仅以痕量掺入载体颗粒。然而，用异源RSVF蛋白的TM和CT交换副粘病毒F蛋白的对应TM和CT提供了RSVF外域掺入重组副粘病毒包膜的多倍升高，使得RSVF包装入载体与RSV自身相比同样有效例如BHPIV3或更加有效例如HPIV1每yg纯化的病毒粒体。这在TM和CT一起交换时或在CT单独交换时是有效的。然而，对单独的CT特异性的嵌合RSVF的融合原性Cfusogenicity升高的出乎意料的效果提供优选TMCT的指导。[0086]RSVF有效包装入载体颗粒剧烈提高当对受试者施用重组副粘病毒时针对外域携带所有中和表位）的免疫应答的引发。出乎意料地，病毒中和性血清抗体应答在质量上剧烈升高，这是通过比较在补体缺失下（测量强中和性抗体或在其存在下（提升弱或非中和性抗体的中和的RSV体外中和活性而评估的。抗体质量中的这种不曾预料到的升高对于RSV是特别重要的，它因诱导不完全免疫保护而被注意到。携带载体糖蛋白的TMCT域的外来糖蛋白的表达和有效包装具有破坏载体复制和形态发生的明显潜力:然而，提供了具有最小限度这种效应的构建物。[0087]为了进一步提高免疫原性，评估了将RSVF蛋白稳定化于融合前构象。融合前稳定化自身还导致强中和性抗体的滴度升高，提示中和表位的稳定化。在仓鼠模型中，融合前稳定化对免疫原性和保护升高的作用看来对TMCT赋予的有效包装的作用是叠加的。然而，当在非人灵长动物中评估时，包装的作用看来比融合前稳定化的作用要更大。[0088]面对实现针对RSV的保护的挑战，想要最大限度的免疫原性。广泛实验揭示了提供升高的RSVF表达和降低的由高融合原性RSVF蛋白介导的合胞体形成的细胞病变效应的载体和插入物构建例如利用各种插入位点，利用密码子优化，和利用早期传代RSVF蛋白序列）的其它方面。[0089]值得注意的是，通过本公开文本的方法确认了一种基于表达在临床试验中具有令人失望的RSV免疫原性的未修饰RSVF蛋白（Bernstein，etal.2012.PediatricInfectiousDiseaseJournal31:109-114的rBHPIV3的原型疫苗病毒诱导具有较差质量，仅在添加补体存在下拥有体外中和活性的RSV中和性血清抗体。相反，所公开的构建物在非洲绿猴中诱导高滴度的能够在体外在补体缺失下有效中和RSV的血清抗体。[0090]I.术语的汇总[0091]除非另有注释，依照常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以在BenjaminLewin1GenesX,publishedbyJonesBartlettPublishers,2009;和Meyersetal.eds.,TheEncyclopediaofCellBiologyandMolecularMedicine,publishedbyWiley-VCHin16volumes,2008;和其它类似参考文献中找到。[0092]如本文中使用的，单数形式“一个”，“一种”，和“该”指单数以及复数二者，除非上下文另有清楚指示。例如，术语“一种抗原”包括单数的或复数的抗原，而且可以考虑为等同于短语“至少一种抗原”。如本文中使用的，术语“包含”意味着“包括”。进一步要理解的是，为核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似的，而且是为了描述目的而提供的，除非另有指示。虽然可以使用与本文中描述的那些相似或等同的许多方法和材料，但是本文中描述了特别合适的方法和材料。在抵触的情况中，以本说明书包括术语的解释为准。另外，材料，方法，和例子仅仅是例示性的，并非意图是限制性的。为了便于查看各个实施方案，提供了下面的术语的解释：[0093]佐剂：用于增强抗原性的媒介。佐剂包括吸附抗原的矿物（明矾，氢氧化铝，或磷酸盐的悬浮液;或油包水乳状液，例如抗原溶液在矿物油（弗氏不完全佐剂）中乳化，有时包括杀死的分枝杆菌（弗氏完全佐剂）以进一步增强抗原性抑制抗原降解和或引起巨噬细胞流入）。也可以使用免疫刺激性寡核苷酸储如那些包括CpG基序的）作为佐剂。佐剂包括生物学分子（“生物学佐剂”），诸如共刺激性分子。例示性佐剂包括IL-2，RANTES，GM-CSF，TNF-α，IFN-γ，G-CSF，LFA-3，CD72，B7-1，B7-2，0X-40L，4-1BBL，免疫刺激性复合物（ISCOM基质，和toll样受体TLR激动剂，诸如TLR-9激动剂，PolyI:C，或PolyICLC。本领域普通技术人员熟悉佐剂（参见例如Singhed.VaccineAdjuvantsandDeliverySystems.Wiley-Interscience,2007。佐剂可以与所公开的重组体组合使用。[0094]施用：通过所选择的路径将组合物导入受试者。施用可以是局部的或系统的。例如，如果所选择的路径是鼻内，那么通过将组合物导入受试者的鼻通道来施用组合物诸如包括所公开的重组副粘病毒的组合物）。例示性施用路径包括但不限于口服，注射诸如皮下，肌肉内，皮内，腹膜内，和静脉内），舌下，直肠，经皮例如表面），鼻内，阴道，和吸入路径。[0095]氨基酸替代：多肽中的一个氨基酸用不同氨基酸或无氨基酸（即删除）替换。在一些例子中，多肽中的氨基酸用来自同源多肽的氨基酸替代，例如，重组A群RSVF多肽中的氨基酸可以用来自B群RSVF多肽的对应氨基酸替代。提及RSVF蛋白中的“66E”氨基酸指在位置66处包含谷氨酸残基的RSVF蛋白。该氨基酸可以是由于来自参照序列的替代而存在的。提及RSVF蛋白中的“K66E”替代指在位置66处包含谷氨酸残基来替代参照例如天然序列中的赖氨酸残基的RSVF蛋白。[0096]减毒：“减毒的”或具有“减毒表型”的副粘病毒指在相似感染条件下具有与参照野生型副粘病毒相比降低的毒力的副粘病毒。减毒通常与在相似感染条件下与参照野生型副粘病毒的复制相比降低的病毒复制有关，因而“减毒”和“受限复制”常常同义使用。在一些宿主典型的是非天然宿主，包括实验动物）中，疾病在所讨论参照副粘病毒感染期间不明显，而且可以使用病毒复制限制作为减毒的代替标志物。在一些实施方案中，减毒的重组副粘病毒例如RSV，PIV3展现哺乳动物的上或下呼吸道中的病毒滴度分别与在相同感染条件下相同物种的哺乳动物的上或下呼吸道中的非减毒，野生型病毒滴度相比降低至少约10倍或更多，诸如至少约100倍或更多。哺乳动物的例子包括但不限于人，小鼠，家兔，大鼠，仓鼠，诸如例如金黄仓鼠（Mesocricetusauratus，和非人灵长动物，诸如例如南非小猴Ceroptihecusaethiops。减毒副粘病毒可以展示不同表型，包括但不限于改变的生长，稳定敏感性生长，宿主范围受限生长，或噬斑大小改变。[0097]胞质尾CT:跨膜蛋白中包括该蛋白的终端N或C端任一并自细胞膜或病毒包膜的胞质表面延伸入细胞或包膜病毒的胞质的连续区。在I型跨膜蛋白的情况中，CT包括该蛋白的C端。在II型跨膜蛋白的情况中，CT包括该蛋白的N端。[0098]简并变体:在本公开文本的上下文中，“简并变体”指编码包括如下序列的多肽的多核苷酸，该序列因遗传代码而是简并的。有20种天然氨基酸，大多数由超过一种密码子来规定。因此，包括编码一种肽的所有简并核苷酸序列，只要由核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列没有变化。[0099]基因：包含RNA转录无论是mRNA或或者是其它所必需的控制和编码序列的核酸序列，典型的是DNA序列。例如，基因可以包含启动子，一个或多个增强子或沉默子，编码RNA和或多肽的核酸序列，下游调节序列和可能的牵涉调节mRNA表达的其它核酸序列。[0100]异源:源自不同遗传来源。重组病毒基因组中包括的异源基因是并非源自该病毒基因组的基因。在一个具体的，非限制性的例子中，编码RSVF蛋白的外域的异源基因包括在重组PIV载体的基因组中。用于导入病毒载体中的异源基因的方法是本领域公知的，而且在本文中也有描述。[0101]宿主细胞:在其中载体能繁殖且其核酸能表达的细胞。细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括主题宿主细胞的任何后代。理解的是，既然可能有复制期间发生的突变，那么所有后代可以不是与亲本细胞同一的。然而，在使用术语“宿主细胞”时包括此类后代。[0102]免疫应答:免疫系统的细胞诸如B细胞，T细胞，或单核细胞对刺激的响应。在一个实施方案中，应答是对特定抗原特异性的（“抗原特异性应答”）。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应答。在另一个实施方案中，应答是B细胞应答，而且导致特异性抗体生成。[0103]免疫原:能在动物中刺激抗体或T细胞应答生成的化合物，组合物，或物质，包括注射或吸收入动物的组合物。免疫原与特异性体液或细胞免疫包括那些由异源抗原诸如所公开的重组副粘病毒诱导的）的产物反应。对受试者施用免疫原能导致针对感兴趣病原体的保护性免疫。[0104]免疫原性组合物:包含诱导可测量的针对抗原的T细胞应答或诱导可测量的针对抗原的B细胞应答诸如抗体生成）的免疫原的组合物，该抗原包括在免疫原上或或由包括在免疫原中的核酸分子编码。在一个例子中，免疫原性组合物是包括当施用于受试者时诱导可测量的针对RSV和或PIV的CTL应答，或诱导可测量的针对RSV和或PIV的B细胞应答诸如抗体生成）的所公开的重组副粘病毒的组合物。免疫原性组合物可以包括分离的本文中公开的重组副粘病毒。对于体内使用，免疫原性组合物会典型地在药学可接受载剂中包括重组副粘病毒，而且还可以包括其它药剂，诸如佐剂。[0105]分离的：“分离的”生物学成分已经自其它生物学成分诸如该成分在其中天然发生的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体外DNA，RNA，和蛋白）实质性分开或纯化。已经“分离的”蛋白质，肽，核酸，和病毒包括那些通过标准纯化方法纯化的。分离的不要求绝对纯，而且可以包括至少50%分离的，诸如至少75%，80%，90%，95%，98%，99%，或甚至99.9%分尚的蛋白质，肽，核酸，或病毒分子。[0106]连接的：术语“连接的”和“连接”指使两个分子成为一个连续分子;例如，通过重组手段将两个多肽连接成一个连续多肽。提及编码包含与异源F蛋白的TM和CT“连接”的RSVF外域的I型膜蛋白的基因指通过重组手段实现的基因中编码RSVF外域的核酸序列和编码异源F蛋白的TM和CT的核酸序列之间的遗传连接，使得该基因的表达导致以N至C端方向包括RSVF外域，TM，和CT的蛋白质生成。在一些实施方案中，RSVF外域的C端残基可以直接连接通过肽键至TM的N端残基。在一些实施方案中，RSVF外域的C端残基可以经肽接头诸如甘氨酸-丝氨酸接头间接连接至TM的N端残基。[0107]接头:可用于将两个分子连接成一个连续分子的双功能分子。肽接头的非限制性例子包括甘氨酸-丝氨酸接头。[0108]天然蛋白，序列，或二硫键：尚未修饰例如通过选择性突变）的多肽，序列或二硫键。例如，将抗原的抗原性聚焦于靶表位，或在蛋白质中引入天然蛋白质中不存在的二硫键的选择性突变。天然蛋白质或天然序列还称作野生型蛋白质或野生型序列。非天然二硫键是天然蛋白质中不存在的二硫键，例如由于通过遗传工程引入蛋白质的一个或多个半胱氨酸残基而在蛋白质中形成的二硫键。[0109]核酸分子:聚合物形式的核苷酸，其可以包括RNA，CDNA，基因组DNA，和上述的合成形式和混合聚合物的有义和反义链二者。核苷酸指核糖核苷酸，脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型的核苷酸。如本文中使用的，术语“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。核酸分子通常长度是至少10个碱基，除非另有规定。该术语包括单和双链形式的DNA。多核苷酸可以包括通过天然发生的和或非天然发生的核苷酸连接连接到一起的天然发生的和经过修饰的核苷酸任一或二者。[0110]可操作连接：当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列是可操作连接的。一般地，可操作连接的核酸序列是连续的，而且在必须连接两个蛋白编码区的情况中，在同一读框中。[0111]副粘病毒:一个有包膜的，不分段负义单链RNA病毒科。副粘病毒的例子包括但不限于人副流感病毒HPIV，包括1，2,3,4A，和4B型（分别是HPIV1，HPIV2，HPIV3，HPIV4A，和HPIV4B，小鼠副流感病毒1型（仙台病毒，MPIV1，牛副流感病毒3型BPIV3，副流感病毒5PIV5，以前称作猿病毒5，SV5，猿病毒41SV41，和腮腺炎病毒。HPIVl，HPIV3，MPIV1，和BPIV3归类在呼吸道病毒Respirovirus属中。HPIV2，HPIV4，SV5，SV41，和腮腺炎病毒归类在德国麻瘆病毒Rubulavirus属中。MPIVl，PIV5，和BPIV3分别是HPIVl，HPIV2，和HPIV3的动物亲戚（Chancocketal.,ParainfluenzaViruses,Knipeetal.Eds.,pp.1341-1379,LippincottWilliamsWilkins,Philadelphia,2001C3HPIVl，HPIV2,和HPIV3代表独特的血清型，而且不引发显著的交叉免疫。HPIV是呼吸道感染诸如哮吼，肺炎，或支气管炎）的病因学因子。[0112]副流感病毒PIV:描述性地分组在一起的来自副粘病毒科的多种有包膜的不分段负义单链RNA病毒。这包括呼吸道病毒属的所有成员（例如，HPIVl，HPIV3和德国麻瘆病毒属的多个成员（例如HPIV2，HPIV4，PIV5。禽腮腺病毒avulavirus属的成员（例如NDV在历史上称作PIV，而且可以考虑为这个群的一部分。HPIV血清型1，2,和3在全世界婴儿和儿童中引起严重呼吸道感染方面仅次于RSV，其中HPIV3是HPIV中就疾病冲击而言最重要的。PIV由两个结构模块构成：（1含有病毒基因组的内部核蛋白核心或核壳，和2外部，粗糙球形脂蛋白包膜。PIV病毒基因组长度是大约15,000个核苷酸且编码至少八种多肽。这些蛋白包括核壳结构蛋白（NP，NC，或N，取决于属），磷蛋白（P，基质蛋白⑽，融合糖蛋白（F，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白（HN，大型聚合酶蛋白（L，和C和D蛋白。P基因含有一个或多个另外的编码辅助蛋白的可读框ORF。基因次序是3’-N-P-M-F-HN-L-5’，而且每种基因编码分开的蛋白编码mRNA。例示性PIV株序列是本领域普通技术人员知道的，诸如HPIVl，HPIV2，HPIV3，和BPIV3病毒的序列。[0113]药学可接受载剂：有用的药学可接受载剂是常规的。Remingtοη’sPharmaceuticalSciences,byE.ff.Martin1MackPublishingCo.,Easton,PA,19thEdition，1995记载了适用于所公开的免疫原的制药学投递的组合物和配制剂。[0114]—般而言，载剂的性质会取决于所采用的特定施用模式。例如，胃肠外配制剂通常包含可注射流体，包括药学和生理学可接受流体，诸如水，生理盐水，平衡盐溶液，水性右旋糖，甘油，等等作为媒介。对于固体组合物例如粉，丸，片，或胶囊形式），常规无毒固体载剂可以包括例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸镁。在生物学中性载剂之外，要施用的药物组合物可以含有微量的无毒辅助物质，诸如润湿或乳化剂，防腐剂，和pH缓冲剂，等等，例如乙酸钠或单月硅酸山梨聚糖酯。在特定实施方案中，适合于对受试者施用，载剂可以是无菌的，和或悬浮或以其它方式含有在单位剂量形式中，单位剂量形式含有一个或多个计量剂量的适合于诱导期望的免疫应答的组合物。它还可以伴有它用于治疗目的的药疗法。单位剂量形式可以例如在装有无菌内容的密封管形瓶或用于注射入受试者的注射器中，或冻干用于后续溶解和施用或在固体或受控释放剂量中。[0115]多肽:任何氨基酸链，不管长度或翻译后修饰例如糖基化或磷酸化）。“多肽”应用于氨基酸聚合物，包括天然发生氨基酸聚合物，以及非天然发生氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如对应的天然发生氨基酸的人工化学模拟物。“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入多肽的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端N端）和羧基端C端）。“多肽”与肽或蛋白质可互换使用，而且在本文中用于指氨基酸残基聚合物。[0116]初始-加强疫苗接种:包括对受试者施用第一免疫原性组合物初始疫苗），接着是施用第二免疫原性组合物加强疫苗）以诱导免疫应答的免疫疗法。在初始疫苗后对受试者施用加强疫苗;技术人员会了解初始疫苗和加强疫苗的施用之间的合适时间间隔，而且本文中公开了此类时帧的例子。初始-加强方案中可以包括另外的施用，例如第二加强。[0117]重组:重组核酸分子是具有不是天然发生的序列例如包括一处或多处核酸替代，删除或插入和或具有通过人工组合两个在其它情况中分开的序列区段而生成的序列的核酸分子。这种人工组合可以通过化学合成或更加常见地通过人工操作分离的核酸区段例如通过遗传工程技术来实现。[0118]重组病毒是包括如下基因组的病毒，该基因组包括重组核酸分子。[0119]重组蛋白是具有不是天然发生的序列或具有通过人工组合两个在其它情况中分开的序列区段而生成的序列的蛋白质。在数个实施方案中，重组蛋白是由已经导入宿主细胞，诸如细菌或真核细胞，或重组病毒的基因组的异源例如重组核酸编码的。[0120]呼吸道合胞病毒RSV:副粘病毒科的一种有包膜的不分段负义单链RNA病毒。RSV基因组长度是〜15,000个核苷酸且包括编码11种蛋白质的10种基因，包括糖蛋白SH，G和F。F蛋白介导融合，容许病毒进入细胞胞质且还促进合胞体形成。已经记载了人RSV株的两个抗原性亚群，A和B亚群，主要基于G糖蛋白的抗原性的差异。还知道其它物种的RSV株，包括牛RSV。例示性RSV株序列是本领域普通技术人员知道的。进一步地，有人RSV感染的数个模型可得，包括感染有hRSV的模式生物体，以及感染有物种特异性RSV的模式生物体，诸如在牛中使用bRSV感染（参见例如Bernetal.,AmJ,Physiol.LungCellMol.Physiol.,301:L148-L156,2011;和NamandKunEds..RespiratorySyncytialVirus:Prevention,DiagnosisandTreatment.NovaBiomedicalNovaSciencePublisher,2011;和CaneEd.RespiratorySyncytialVirus.ElsevierScience,2007〇[0121]RSV融合F蛋白：推动病毒和细胞膜融合的RSV包膜糖蛋白。在自然界中，RSVF蛋白首先作为长度为大约574个氨基酸的单一多肽前体合成，称作Fot3Fo包括N端信号肽，其指导定位至内质网，在那里信号肽Fo的大约头22个残基受到蛋白水解切割。剩余的Fo残基寡聚化以形成三聚体，其再次在两个保守弗林蛋白酶共有切割序列（大致Fo位置109110和136137;例如RARRio9SEQIDNO:1，残基106-109和RKRRi36SEQIDNO:1，残基133-136处受到细胞蛋白酶的蛋白水解加工，切除pep27多肽并生成两个二硫化物连接的片段，^和F2。这些片段中的较小者F2源自Fo前体的N端部分且包括Fo的大致残基26-109。这些片段中的较大者F1包括Fo前体的C端部分大致残基137-574，包括胞外腔区（〜残基137-529，TM〜残基530-550，和C端的CT〜残基551-574。[0122]三个F2-F1原聚体在成熟F蛋白中寡聚化，其采取亚稳的“融合前”构象，一旦与靶细胞膜接触就被触发而经历构象变化成为“融合后”构象）。这种构象变化暴露一段疏水性序列，称作融合肽，它位于?:多肽的N端，而且与宿主细胞膜联合并促进病毒的或受感染细胞的膜与靶细胞膜的融合。[0123]RSVF蛋白的胞外部分是RSVF外域，其包括F2蛋白和F1外域。RSVF外域三聚体包括三个RSVF外域的蛋白复合物。[0124]在触发导致RSVF转变成融合后构象的融合原性事件及之后在分泌系统中加工成成熟RSVF蛋白之前，RSVF蛋白采取“融合前”构象。处于融合前构象的一种例示性RSVF蛋白的三维结构显示及披露于例如W02014160463,通过援引将其收入本文。处于融合前状态时，RSVF蛋白在它的膜远端顶点处包括称作“抗原性位点0”的包括RSVF残基62-69和196-209的抗原性位点，而且还包括D25和AM22单克隆抗体的表位。因而，稳定化于融合前构象的重组RSVF蛋白能受到结合RSVF蛋白的融合前构象但不结合融合后构象的抗体诸如特异性结合抗原性位点0内的表位的抗体，例如D25或AM22抗体的特异性结合。另外的RSVF融合前特异性抗体包括5C4和MPE8抗体。[0125]序列同一性:氨基酸序列之间的相似性是在序列之间的相似性方面表述的，另外称作序列同一性。序列同一性常常在百分比同一性或相似性或同源性方面测量;该百分比越高，两种序列约相似。当使用标准方法比对时，多肽的同系物，直向同系物，或变体会拥有相对较高程度的序列同一性。[0126]为了比较而比对序列的方法是本领域公知的。多种程序和比对算法记载于：Smithffaterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needlemanffunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;PearsonLipman,Proc·Natl.Acad.Sci·USA85:2444,1988；HigginsSharp,Gene,73:237-44,1988；HigginsSharp,CABIOS5:151-3,1989；Corpetetal.,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huangetal·ComputerAppls·intheBiosciences8,155-65,1992;和Pearsonet1.，]^1:11.]\1〇1.13;[0.24:307-31，1994。八1七8。11111etal·,J.Mol.Biol.215:403-10,1990呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。[0127]—旦比对，通过对两种序列中存在同一核苷酸或氨基酸残基的位置的数目计数来确定匹配的数目。通过将匹配的数目除以所鉴定的序列所列序列的长度或特指长度诸如来自所鉴定的序列所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基任一，接着将所得值乘以100来确定百分比序列同一性。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的肽序列与测试序列是75.0%同一的（1166+1554*100=75.0。百分比序列同一性值四舍五入成最近的十分之一。例如，75.11，75.12,75.13,和75.14向下四舍五入成75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18,和75.19向上四舍五入成75.2。长度值总是会是整数。[0128]NCBI基本局部比对搜索工具（BLASTAltschuletal.,J.Mol.Biol.215:403，1990自数个来源包括美国）国家生物技术信息中心NCBI，BetheSda，MD和在因特网上可得，与序列分析程序13138丨口，131381：11，13138丨1，1：131381：11和1：13138丨1联合使用。如何使用这种程序来确定序列同一性的说明在因特网上的NCBI网站上可得。[0129]多肽诸如RSVF外域的同系物和变体典型地通过拥有与感兴趣氨基酸序列在全长比对上计数的至少约75%，例如至少约80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%序列同一性来表征。当通过这种方法评估时，与参照序列具有甚至更大相似性的蛋白质会显示渐增的百分比同一性，诸如至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%序列同一性。当为了序列同一性比较少于整个序列时，同系物和变体典型地会在10-20个氨基酸的短窗口上拥有至少80%序列同一性，而且可以拥有至少85%或至少90%或95%的序列同一性，取决于它们与参照序列的相似性。用于在如此短窗口上确定序列同一性的方法在因特网上的NCBI站点处得到。本领域技术人员会领会，这些序列同一性范围只是为了指导而提供的;完全有可能能得到落在所提供的范围之外的强显著同系物。[0130]对于核酸序列的序列比较，典型地，一种序列充当参照序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，在必要时指派子序列坐标，并指派序列算法程序参数。使用缺省程序参数。为了比较而比对序列的方法是本领域公知的。用于比较的最佳序列比对可以进行例如通过SmithWaterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，NeedlemanWunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，PearsonLipman，Proc.Nat’I.Acad.Sci.USA85:2444，1988的相似性搜索方法，这些算法的计算机执tlWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，或手工比对和肉眼检查（参见例如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed,ColdSpringHarbor,NewYork，2012和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork，throughsupplement104,2013。有用的算法的一个例子是PILEUPC3PILEUP使用FengDoolittle,J.Mol.Evol·35:351-360，1987的渐进式比对方法的一种简化。所使用的方法与HigginsSharp,CABIOS5:151-153，1989记载的方法相似。使用PILEUP，使用下述参数将参照序列与其它测试序列比较以确定百分比序列同一性关系:缺省缺口权重3.00，缺省缺口长度权重0.10，和加权末端缺口。PILEUP可以自GCG序列分析软件包获得，例如7.0版Devereauxetal.，Nuc.AcidsRes.12:387-395，1984〇[0131]适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个例子是BLAST和BLAST2.0算法，它们记载于Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1977。用于实施BLAST分析的软件是公众经由美国）国家生物技术信息中心ncbi.nlm.nih.gov可得的。BLASTN程序用于核苷酸序列）使用词长度W11，比对⑻50，预期⑻10，M=5，N=-4，和比较两条链作为缺省。BLASTP程序（用于氨基酸序列）使用词长度W3,预期（E10,和BL0SUM62评分矩阵作为缺省（参见HenikoffHenikoff,Proc·Natl·Acad·Sci·USA89:10915，1989。寡核苷酸是长度为多至约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。[0132]如本文中使用的，提及“至少90%同一性”指与规定参照序列的“至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%同一性”。[0133]受试者:活的多细胞脊椎动物生物体，一个包括人和非人哺乳动物的范畴。在一个例子中，受试者是人。在一个特定例子中，受试者是新生婴儿。在一个另外的例子中，受试者选择需要抑制RSV感染的。例如，受试者是未感染且处于RSV感染风险的或是需要治疗的已感染的任一。[0134]跨膜域TM:跨越脂双层，诸如细胞或病毒或病毒样颗粒的脂双层的氨基酸序列。跨膜域可以用于将抗原锚定至膜。在一些例子中，跨膜域是RSVF跨膜域。[0135]疫苗:为了预防，改善，或治疗感染性或其它类型疾病而施用的能够刺激免疫应答的免疫原性材料的制备物。免疫原性材料可以包括减毒的或杀死的微生物诸如细菌或病毒），或自它们衍生的抗原性蛋白，肽或DNA。减毒疫苗是已经修饰以生成毒力降低形式，但是无论如何保留引发抗体和细胞介导的针对有毒力形式的免疫的能力的有毒力的生物体。灭活杀死疫苗是先前有毒力，已经用化学制品，热，或其它处理灭活，但是引发针对该生物体的抗体的生物体。疫苗可以引发防范性预防性或保护性和治疗性应答二者。施用方法随疫苗而变化，但是可以包括接种，摄入，吸入或其它形式的施用。疫苗可以与佐剂一起施用以加强免疫应答。[0136]载体:携带与感兴趣抗原的编码序列可操作连接且能表达该编码序列的启动子的含有DNA或RNA分子的实体。非限制性例子包括裸的或包装的（脂质和或蛋白质DNA，裸的或包装的RNA，可以是复制不胜任的病毒或细菌或其它微生物的亚成分，或可以是复制胜任的病毒或细菌或其它微生物。载体有时称作构建物。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可以包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包括一种或多种本领域知道的选择标志基因和其它遗传元件。病毒载体是具有至少一些自一种或多种病毒衍生的核酸序列的重组核酸载体。[0137]II.重组病毒载体[0138]提供了包括来自多种病毒病原体的抗原且可以用于诱导针对那些病毒病原体的免疫应答的重组副粘病毒。重组副粘病毒包括编码异源基因的基因组。重组副粘病毒包含包含如下异源基因的基因组，该异源基因编码异源病毒病原体的跨膜蛋白（例如病毒糖蛋白）的外域。外域可以与来自副粘病毒的包膜蛋白的CT，或TM和CT连接以容许在副粘病毒包膜上表达来自异源病毒的跨膜蛋白的外域。例如，重组副粘病毒可以是包含包含如下异源基因的基因组的重组PIV，该异源基因编码与来自PIV的F蛋白的TM和CT连接的RSVF蛋白的外域。本文中提供了重组副粘病毒及其修饰的另外的描述。[0139]副粘病毒基因组包括编码N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因。基因组还包括基因组启动子和反启动子，次序为启动子_N，P，M，F，HN，L-反启动子。重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因可以位于副粘病毒基因组的基因之间，或启动子和N基因之间，或L基因和反启动子之间的任何位置。异源基因的侧翼可以是适宜的基因起点和基因终点序列以推动来自病毒基因组的表达。在一个优选实施方案中，异源基因可以位于启动子和N基因之间，或N基因和P基因之间。[0140]在一个实施方案中，重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的CT，或TM和CT连接的I型跨膜蛋白（例如I型病毒糖蛋白）的外域。在其它实施方案中，重组副粘病毒的基因组中包括的异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的CT，或TM和CT连接的Π型跨膜蛋白（例如II型病毒糖蛋白）的外域。[0141]重组副粘病毒可以是例如重组HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV3，PIV5,仙台病毒，或NDV，或其嵌合物。下文提供了此类重组副粘病毒的另外的描述。[0142]生成包括包括异源基因的基因组的重组副粘病毒的一般方法是本领域普通技术人员知道的，就像用于此类方法的病毒序列和试剂。生成包括异源基因的重组PIV载体诸如重组HPIVl，HPIV2，HPIV3，或HBPIV3载体）的方法，将载体减毒例如通过重组或化学手段）的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本20120045471;20100119547;20090263883;20090017517;8084037;6,410,023;8，367,074；7,951,383；7,820,182；7704509；7632508；7622123；7250171；7208161；7201907；7192593;Newmanetal.2002.Virusgenes24:77-92;和Tangetal.，2003.JVirol,7720:10819-10828;通过援引将其每一篇完整收入本文。生成包括异源基因的重组NDV载体的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本20120064112;和Basavarajappaetal.2014Vaccine,32:3555-3563;和McGinnesetal.J.Virol.，85:366-377,2011，通过援引将其每一篇完整收入本文。生成包括异源基因的重组仙台载体的方法，以及用于此类方法的病毒序列和试剂的非限制性例子提供于美国专利公开文本20140186397，和Jonesetal·,Vaccine，30:959-968，2012，通过援引将其每一篇完整收入本文。[0143]A.HPIVl载体[0144]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码HPIV1N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIVlAPIVl基因组及其中的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传兀件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和反基因组启动子。一种例示性HPIVl华盛顿1964株基因组序列作为GenBank登录号AF457102.1提供，通过援引将其完整收入本文。这种例示性HPIVl华盛顿1964株基因组序列编码下列1?，：，1^，顯，和1^蛋白：[0145]HPIV1N，SEQIDN0:24®enBank蛋白ID#AAL89400.1，通过援引收入本文）[0146]HPIV1P，SEQID从：25沿61^3吐蛋白10#六六1^89402.1，通过援引收入本文）[0147]HPIVlC，SEQIDN0:26P的01^，661^1^蛋白10減厶1^9403.1，通过援引收入本文）[0148]HPIV1M，SEQIDN0:27GenBank蛋白ID#AAL89406.1，通过援引收入本文）[0149]HPIV1F，SEQID从：28沿61^3吐蛋白10#厶厶1^89407.1，通过援引收入本文）[0150]HPIV1HN，SEQIDN0:29®enBank蛋白ID#AAL89408.1，通过援引收入本文）[0151]HPIVlL，SEQIDN0:3KGenBank蛋白ID#AAL89409.1，通过援引收入本文）[0152]下文提供了这些HPIVl基因的对应基因起点和基因终点序列：[0154]进一步地，GenBank登录号AF457102.1中所列HPIV2V94株的病毒前导基因组启动子和尾随反基因组启动子分别作为核苷酸1-96和15544-15600列出。[0155]重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIVlN，P，C，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列HPIVlN，P，C，M，F，HN，和L蛋白具有至少90%诸如至少95%序列同一性的册1¥謂，？，：，1^，順，和1^蛋白的病毒基因组的重组册1¥1。[0156]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIVl，该异源基因编码与下文所列HPIVlF蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIVlF蛋白TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIVlF蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIVl，该异源基因编码与下文所列HPIVlF蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIVlF蛋白CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIVlF蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）APIVlF蛋白TM和CT序列是知道的（参见例如GenBank登录号AF457102.1，通过援引收入本文）。例示性HPIVlF蛋白TM和CT序列如下所列：[0157]HPIVlFTM:QnMIIIVCILIIIICGILYYLY，SEQIDN0:3lSSl-23[0158]HPIVlFCT:RVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN，SEQIDNO:31残基24-59[0159]HPIVlFTM+CT：QIIMIIIVCILIIIICGILYYLYRVRRLLVMINSTHNSPVNAYTLESRMRNPYMGNNSN,SEQIDNO：31[0160]B.HPIV2载体[0161]在一些实施方案中，重组副粘病毒载体可以是包括编码HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV2。编码这些HPIV2蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传兀件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。一种例示性HPIV2V94株基因组序列作为GenBank登录号AF533010.1提供，通过援引将其完整收入本文。这个例示性HPIV2V94株基因组序列编码下列1?，¥，1^，顯，和1^蛋白：[0162]HPIV2N，SEQIDN0:32由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0163]HPIV2P，SEQIDN0:33由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0164]HPIV2V，SEQIDN0:34P的0RF，由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0165]HPIV2M，SEQIDN0:35由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0166]HPIV2F，SEQIDN0:36由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0167]HPIV2HN，SEQIDN0:37由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0168]HPIV2L，SEQIDN0:38由GenBankNO.AF533010.1编码，通过援引收入本文）[0169]下文提供了这些HPIV2基因的对应基因起点和基因终点序列：[0170][0171]进一步地，GenBank登录号AF533010.1中所列HPIV2V94株的病毒前导基因组启动子和traileranti基因组启动子分别作为核苷酸1-175和15565-15654列出。[0172]重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIV2N，P，V，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列冊1¥21?，¥，1^，圆，和1^蛋白具有至少90%〇#如至少95%序列同一性的册1¥21?，¥，]\^，順，和1^蛋白的病毒基因组的重组册1¥2。[0173]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV2,该异源基因编码与下文所列HPIV2F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIV2F蛋白TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV2F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV2,该异源基因编码与下文所列HPIV2F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIV2F蛋白CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV2F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）APIV2F蛋白TM和CT序列是知道的（参见例如GenBank登录号AF533010.1，通过援引收入本文）。来自HPIV3JS株的例示性HPIV2F蛋白TM和CT序列如下所列：[0174]HPIVSFTitll^TLYSLSAIALILSVITLVWGLLIAYIhSEgiDNOegSSUS[0175]HPIV2FCT:KLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS，SEQIDN0:39SS29-66[0176]HPIV2FTM+CT：TLYSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRALAATTMFHRENPAVFSKNNHGNIYGIS,SEQIDNO：39[0177]C.HPIV3载体[0178]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码HPIV3N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的病毒基因组的重组HPIV3。编码这些HPIV3蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传兀件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。作为GenBank登录号Z11575提供一种例示性HPIV3JS株基因组序列，通过援引将其完整收入本文。对于这种例示性HPIV3JS株基因组序列，编码N，P，C，M，F，HN，*L蛋白的核酸序列如下所列。[0179]HPIV3N，SEQIDN0:40由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸111-1658编码，通过援引收入本文）[0180]HPIV3P，SEQIDN0:41由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸1784-3595编码，通过援引收入本文）[0181]HPIV3C，SEQIDNO:114由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸1794-2393编码，通过援引收入本文）[0182]HPIV3M，SEQIDN0:42由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸3753-4814编码，通过援引收入本文），[0183]HPIV3F，SEQIDN0:43由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸5072-6691编码，通过援引收入本文），[0184]HPIV3HN，SEQIDN0:44由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸6806-8524编码，通过援引收入本文）[0185]HPIV3L，SEQIDN0:45由GenBankΝο·Ζ11575核苷酸8646-15347编码，通过援引收入本文）[0186]在一些实施方案中，HPIV3载体中的HN基因编码包含下列氨基酸序列的HPIV3HN蛋白[0188]如下提供一种例示性的编码SEQIDNO:101的DNA序列：[0189][0190]下文提供了这些HPIV3基因的对应基因起点和基因终点序列：LLLLLL产LL产[0192]进一步地，GenBank登录号Zl1575所列HPIV3JS株的病毒基因组和anti基因组启动子分别作为核苷酸1-96基因组启动子）和核苷酸15367-15462anti基因组启动子）提供。[0193]重组副粘病毒可以是包括编码上文所列HPIV3N，P，C，M，F，HN，和L蛋白，或编码个别地与上文所列HPIV3N，P，C，M，F，HN，和L蛋白具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV31?，：，1^，順，和1^蛋白的病毒基因组的重组册1¥3。[0194]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV3,该异源基因编码与下文所列HPIV3F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIV3F蛋白TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV3F蛋白TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括包括如下异源基因的基因组的重组HPIV3,该异源基因编码与下文所列HPIV3F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域），或编码与同下文所列HPIV3F蛋白CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV3F蛋白CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）。即1乂3F蛋白TM和CT序列是知道的（参见例如由GenBankNo.Z11575核苷酸5072-6691编码的蛋白）。来自HPIV3JS株的例示性HPIV3F蛋白TM和CT序列如下所列：[0195]HPIV3FT]\tl^:IIinJMIIILFIINmiTIAI，SEQIDN0:46SSl-23[0196]HPIV3FCT:KYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK，SEQIDN0:46SS24-46HPIV3FTM+CT：IIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNK,SEQIDNO：46[0197]D.牛PIV3和嵌合人牛PIV3载体[0198]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码来自BPIV3和HPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的组合的病毒基因组的牛PIV3BPIV3或嵌合副粘病毒。例如，嵌合病毒基因组可以编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白。编码这些HPIV3和BPIV3蛋白的基因的核酸序列是本领域知道的，就像控制基因表达的结构性和功能性遗传元件，诸如基因起点和基因终点序列和病毒基因组和anti基因组启动子。一种例示性BPIV3堪萨斯基因组序列作为GenBank登录号AF178654提供，通过援引将其完整收入本文。这种例示性BPIV3堪萨斯株基因组序列编码下文所列1?，：，¥，1^，!^，和1^蛋白：[0199]BPIV3N，SEQIDN0:47^enBank登录号：AAF28254,由GenBankNO.AF178654核苷酸111-1658编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0200]BPIV3P，SEQIDN0:48¢enBank登录号：AAF28255，由GenBankNo·AF178654核苷酸1784-3574编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0201]BPIV3C，SEQIDNO:115由GenBankNo.AF178654核苷酸1794-2399编码，通过援引收入本文）[0202]BPIV3V，SEQIDNO:116由GenBankNo.AF178654核苷酸1784-3018编码，位于核苷酸2500-2507的基因编辑位点处的核苷酸2505-2506之间插入核苷酸g[0203]BPIV3M，SEQIDNO:49^enBank登录号：AAF28256,由GenBankNo.AF178654核苷酸3735-4790编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0204]BPIV3F，SEQIDN0:50¢enBank登录号：AAF28257，由GenBankNo·AF178654核苷酸5066-6688编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0205]BPIV3HN，SEQIDN0:51GenBank登录号：AAF28258,由GenBankNO.AF178654核苷酸6800-8518编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0206]BPIV3L，SEQIDN0:52¢enBank登录号：AAF28259，由GenBankNo·AF178654核苷酸8640-15341编码，通过援引将其每一篇收入本文）[0207]在一些实施方案中，嵌合BHPIV3载体中包括的HPIV3HN基因编码包含SEQIDNO:101或SEQIDN0:44所列氨基酸序列或其变体的HPIV3HN蛋白。一种例示性的编码SEQIDNO:101的DNA序列提供于SEQIDNO:102。[0208]在一些实施方案中，嵌合BHPIV3载体可以包括HPIV3F基因替换BPIV3F基因，例如编码SEQIDNO:43所列HPIV3F氨基酸序列或其变体的基因。[0209]下文提供了这些BPIV3基因的对应基因起点和基因终点序列：[0211]进一步地，GenBank登录号AF178654所列BPIV3堪萨斯株的病毒基因组和anti基因组启动子分别作为核苷酸1-96基因组启动子和核苷酸15361-15456anti基因组启动子）提供。[0212]包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的1?，：，¥，1^，圆，和1^蛋白的病毒基因组的重组副粘病毒可以编码上文所列HPIV3和BPIV31?，：，¥，1^，圆，和1^蛋白的混合物，或者可以编码个别地与上文所列BPIV3或HPIV31?，：，¥，1^，圆，和1^蛋白具有至少90%诸如至少95%序列同一性的BPIV3和HPIV31?，^，]\^，圆，和1^蛋白的混合物。[0213]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以包括编码上文所列HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白，或编码个别地与上文所列对应HPIV3F和HN蛋白或BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白具有至少90%诸如至少95%序列同一性的HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白的病毒基因组。[0214]在一些实施方案中，包括编码来自BPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3F蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列BPIV3F蛋白的TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自BPIV3的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3F蛋白的CT连接的，或与同下文所列BPIV3F蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外±或的异源基因。[0215]在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白诸如HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白）的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3F蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列BPIV3F蛋白的TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列BPIV3F蛋白的CT连接的，或与同下文所列BPIV3F蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）的异源基因。来自BPIV3堪萨斯株的例示性BPIV3F蛋白TM和CT序列如下所列：[0216]BPIV3FT]\tl^:miIVMIIILVIINmiW，SEQIDN0:53SSl-21[0217]BPIV3FCT:IIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ，SEQIDN0:53SS22-57[0218]BPIV3FTM+CT：ITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQ,SEQIDNO：53[0219]在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白诸如HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白）的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与上文所列HPIV3F蛋白的TM和CT连接的，或与同上文所列HPIV3F蛋白的TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域的异源基因。在一些实施方案中，包括编码来自HPIV3和BPIV3病毒的N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的基因组的重组副粘病毒可以进一步包括编码与下文所列HPIV3F蛋白的CT连接的，或与同下文所列HPIV3F蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）的异源基因。[0220]E.仙台病毒[0221]在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码仙台病毒N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的，或与同仙台病毒F蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域的异源基因的重组仙台病毒。在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码仙台病毒N，P，C，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组的重组仙台病毒，包括编码与仙台病毒F蛋白的CT连接的，或与同仙台病毒F蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）的异源基因。仙台病毒F蛋白TM和CT序列是知道的（参见例如GenBank登录号BAN84670，通过援引收入本文）。例示性仙台病毒F蛋白TM和CT序列如下所列：[0222]仙台FTM域:VmIWMWILWIIVIIIVSEQIDN0:103残基l-21[0223]仙台FCT:LYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKRSEQIDN0:103残基22-65[0224]仙台FTM+CT:VITIIWMWILWIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR,SEQIDNO：103[0225]F.NDV[0226]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码NDVN，P，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与下文所列NDVF蛋白的TM和CT连接的，或与同下文所列NDVF蛋白的TM和CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的TM和CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域）的异源基因的重组NDV病毒。在一些实施方案中，重组副粘病毒可以是包括编码NDVN，P，V，M，F，HN，和L蛋白的重组病毒基因组，包括编码与下文所列NDVF蛋白的CT连接的，或与同下文所列NDVF蛋白的CT具有至少90%诸如至少95%序列同一性的CT连接的来自I型膜蛋白的重组病毒糖蛋白外域诸如RSVF外域的异源基因的重组NDV病毒。NDV病毒F蛋白TM和CT序列是知道的（参见例如GenBank登录号AAC28374，通过援引收入本文）。例示性NDV病毒F蛋白TM和CT序列如下所列：[0227]NDVFT]\t^:IVLTnSLVFGILSLILACYLSEQIDN0:104SSl-21[0228]NDVFCT:MYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKMSEQIDN0:104SS22-49[0229]NDVFTM+CT：IVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM,SEQIDNO:104[0230]G·异源基因[0231]重组副粘病毒载体包括包括如下一种或多种异源基因的重组基因组，该一种或多种异源基因编码异源病毒病原体的一种或多种异源包膜蛋白（或其抗原性片段的外域，其中该外域是与来自重组副粘病毒的包膜蛋白的TM和CT连接的。例如，可以由所公开的重组副粘病毒表达来自麻瘆病毒，A亚群或B亚群呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，人乳头状瘤病毒，1型或2型人免疫缺陷病毒，单纯疱瘆病毒，巨细胞病毒，狂犬病病毒，埃巴二氏病毒，纤丝病毒，布尼亚病毒，黄病毒，甲病毒，人偏肺病毒，埃博拉病毒诸如扎伊尔埃博拉病毒），流感病毒，或高度致病性冠状病毒SARS，MERS的一种或多种异源包膜蛋白（或其抗原性片段）。有用的包膜蛋白的例子包括但不限于麻瘆病毒HA和F蛋白，A亚群或B亚群呼吸道合胞病毒F，G，和SH蛋白，腮腺炎病毒HN和F蛋白，人乳头状瘤病毒Ll蛋白，1型或2型人免疫缺陷病毒gpl60蛋白，单纯疱瘆病毒和巨细胞病毒gB，gC，gD，gE，gG，gH，gl，gj，gK，gL，和gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，埃巴二氏病毒gp350蛋白，纤丝病毒G蛋白，布尼亚病毒G蛋白，黄病毒前E，和NSl蛋白，人偏肺病毒（HMPVG和F蛋白，埃博拉病毒GP蛋白，甲病毒E蛋白，和SARS和MERSS蛋白，和其抗原性域，片段和表位。将一个或多个异源基因或转录单元插入副粘病毒病毒基因组或反基因组的例示性方法记载于W004027037和US20130052718,通过援引将其每一篇收入本文。[0232]在数个实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码RSVF蛋白，诸如牛RSVF蛋白或人RSVF蛋白的外域。人RSV可以归类入两个群:A和B。主要基于附着〇；和融合F蛋白的序列变异性，A和B群包括Al，A2，Bl，和B2亚群。RSVF外域可以衍生自任何RSV群诸如A群或B群或RSV亚群，诸如Al，A2，Bl，或B2亚群。[0233]下文列出了来自A2亚群的例示性人RSVF蛋白序列和对应GenBank参照通过援引将其完整收入本文）：[0234]RSVFA2HEK蛋白序列：[0235]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQIDNO：I[0236]RSVFBlHEK蛋白序列，登录号AAB82436:[0237]MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSKSEQIDNO:2，GenBank登录号AAB82436，通过援引完整收入本文）[0238]RSVFBlHEK核酸序列：[0239]uggaaucaauaauauugcauucagcaaauagSEQIDNO:3，GenBank登录号：AF013254·I，核苷酸5666-7390，通过援引完整收入本文）[0240]如通过上文序列例示的，hRSVF蛋白展现值得注意的序列保守性，在hRSV亚群间有超过85%的序列同一性。鉴于RSVF序列的保守性和宽度知识，本领域普通技术人员能容易地鉴定不同RSVF株和亚群之间的对应RSVF氨基酸位置。本文中公开的氨基酸替代的编号方式是提及来自SEQIDN0:1所列A2株的例示性hRSVF蛋白序列做出的，除非上下文另有指示。[0241]为了例示目的，来自A2株的RSVF蛋白（SEQIDN0:1的信号肽，F2多肽，pepSTA，F1外域，跨膜域，和细胞溶胶域如下所列：[0242]信号肽（SEQIDΝ0:1，残基1-22:MELLILKANAITTILTAVTFCF[0243]F2多肽（SEQIDN0:1，残基23-109:ASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARR[0244]Pep27SEQIDN0:l，SSll0-136:ELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR[0245]FiSEQIDN0:1，残基137-574:FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN[0246]F1成熟蛋白外域（SEQIDN0:1，残基137-529:FLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTN頂ITT[0247]Fi跨膜域（SEQIDN0:1，残基530-550:IIIVIIVILLSLIAVGLLLYC[0248]FiCTSEQIDN0:l，SS551-574:KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN[0249]在一些实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码人RSFF蛋白的外域，其中该RSVF外域包含与SEQIDNO:IFTRSVFA，2FTRSVFB，12A2HEK，14八2冊1+05，或19仏2冊1+05-〇3¥1之一的1«¥外域至少85%诸如至少90%，或至少95%同一的氨基酸序列，或包含SEQIDN0:12，14,或19的RSV外域的氨基酸序列。[0250]在一些实施方案中，重组副粘病毒可以包括包括已经为了在人细胞中表达而密码子优化的编码重组hRSVF蛋白的异源基因的基因组。例如，编码重组hRSVF蛋白的基因可以使用GA，DNA2.0D2，或GenScriptGS优化算法见实施例1为了人表达而密码子优化。已经为了在人细胞中表达而密码子优化的编码RSVF蛋白的核酸序列的非限制性例子提供如下：[0251]GeneArt优化的RSVFA2HEKDNA序列：[0252][0253]GenScript优化的RSVFA2HEKDNA序列：[0254][0255]下文提供了密码子优化为了人表达序列的另外的例子。[0256]由异源基因编码的RSVF蛋白可以包括一处或多处改善RSVF蛋白表达，病毒粒体包膜上RSVF蛋白的可用性，或RSVF蛋白的稳定性例如处于融合前构象的）的氨基酸替代。在一些实施方案中，RSVF蛋白可以包括位置66处的谷氨酸替代，位置101处的脯氨酸替代，或二者。例如，RSVF蛋白可以包括K66E替代和QlOlP替代的“HEK”替代。下文列出了包括HEK氨基酸替代的来自A2亚群的RSVF蛋白的例示性DNA和蛋白质序列。[0257]具有HEK替代的RSVFA2蛋白（RSVF_A2_HEK:SEQIDN0:1[0258]GeneArt优化的RSVF_A2_HEKDNA序列：[0259][0260]GenScript优化的RSVF_A2_HEKDNA序列：[0261][0262]在另外的实施方案中，RSVF蛋白可以包括一处或多处将RSVF蛋白的外域稳定化于融合前构象的氨基酸替代。例如，RSVF蛋白可以包括位置155和290处形成非天然二硫键的一对半胱氨酸替代的“DS”替代以将RSVF蛋白稳定化于它的融合前构象。在一些实施方案中，RSVF蛋白可以包括位置190和或207处的一处或多处空腔填充氨基酸替代以将该蛋白稳定化于融合前构象。例如，RSVF蛋白可以包括190F替代和或207L替代。在一些实施方案中，RSVF蛋白可以包括S190F和F207L的“Cavl”替代。在一些实施方案中，RSVF蛋白可以包括3155：，3290：，319^，和¥2071^的03-03¥1替代以将蛋白稳定化于融合前构象。包括03-Cavl氨基酸替代的来自A2亚群的RSVF蛋白（具有嵌合TM和或CT±或的例示性DNA和蛋白质序列如SEQIDNO:10-11和21-23所列。[0263]可以用于将RSVF外域稳定化于融合前构象的另外的氨基酸替代和蛋白质修饰披露于例如W02014160463,通过援引将其完整收录。HEK替代可以与任何用于将RSVF蛋白稳定化于融合前构象的氨基酸替代组合。[0264]在数个实施方案中，重组副粘病毒基因组中包括的异源基因编码与重组副粘病毒的F蛋白的TM和CT连接的重组RSVF外域。[0265]在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括重组HPIVl基因组的重组HPIVl，该重组HPIVl基因组包括编码重组hRSVF外域的异源基因。RSVF外域可以是与来自HPIVlF蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQIDNO31TM残基1-23,SEQIDNO:31CT残基24-59,或SEQIDN0:31TM+CT所列。下文提供了例示性序列：[0266]包括HEK和DS-Cavl替代，和HPIVlFCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVFA2_HEK_DS-Cavl_HlCT：[0270]包括HEK和DS-Cavl替代，和HPIVlFTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVFA2_HEK_DS-Cavl_HlTMCT：[0272]GenScript优化的RSVFA2_HEK_DS-Cavl_HlTMCTDNA序列：[0273][0274]在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括重组HPIV2基因组的重组HPIV2,该重组HPIV2基因组包括编码重组hRSVF外域的异源基因。RSVF外域可以是与来自HPIV2F蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQIDN0:39残基1-28TM，SEQIDN0:39残基29-66CT，或SEQIDN0:39TM+CT所列。[0275]在一个实施方案中，重组副粘病毒可以是包括如下基因组的重组HPIV3,该基因组包括编码重组hRSVF外域的异源基因。重组RSVF外域可以是与来自HPIV3F蛋白的TM和CT连接的，例如如SEQIDN046残基1-23TM，SEQIDN0:46残基24-46CT，或SEQIDN0:46TM+CT所列。下文提供了例示性序列：[0276]包括HEK和DS-Cavl替代，和HPIV3FCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_HEK_DS-Cavl_H3CT蛋白质序列：[0277][0278]GenScript优化的RSVF_HEK_DS-Cavl_H3CTDNA序列：[0279][0280]包括HEK和DS-Cavl替代，和HPIV3FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_HEK_DS-Cavl_H3TMCT蛋白质序列：[0281]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIILIMIIILFIINITIITIAIKYYRIQKRNRVDQNDKPYVLTNKSEQIDNO：10[0282]GenScript优化的RSVF_HEK_DS-Cavl_H3TMCTDNA序列：[0283][0284]在一个实施方案中，重组副粘病毒是包括编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，C，V，M，和L蛋白的重组病毒基因组的嵌合PIV，其中该病毒基因组进一步包括编码与来自BPIV3F蛋白的TM和或CT例如如SEQIDN053残基l-21TM，SEQIDN0:53残基22-57CT或SEQIDNO:53TM+CT所列连接的重组hRSVF外域的异源基因。下文列出了可以在所公开的重组副粘病毒中使用的包括HEK，DS，和或Cavl替代，以及来自BPIV3F蛋白的异源TM和或CT域的A2亚群的重组RSVF蛋白的例示性DNA和蛋白质序列。[0285]包括HEK替代，和BPIV3FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_B3TMCT蛋白质序列：[0286]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQSEQIDNO：12[0287]GeneArt优化的RSVF_A2_HEK_B3TMCTDNA序列：[0288][0289]包括HEK和DS替代，hRSVFTM域和BPIV3FCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_DS_B3CT蛋白质序列：[0290]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQSEQIDNO：14[0291]GeneArt优化的RSVF_A2_HEK_DS_B3CTDNA序列：[0292]tgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagetgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtgaSEQIDNO:15[0293]包括HEK和DS-Cavl替代，hRSVFTM域和BPIV3FCT域的来自A2株的hRSVF蛋白RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3CT蛋白质序列：[0294]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQSEQIDNO：16[0295]GeneArt优化的RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3CTDNA序列：[0296]atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagetgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtgatcctgctgagcctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgtatcatcaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtgaSEQIDNO:17[0297]GenScript优化的RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3CTDNA序列：[0298]atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcatcatcgtgattatcgtcattctgctgtcactgatcgctgtggggctgctgctgtactgtatcattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacattctgaccaacagacagSEQIDNO:18[0299]包括HEK和DS替代，和BPIV3FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_DS_B3TMCT蛋白质序列：[0300]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQSEQIDNO：19[0301]GeneArt优化的RSVF_A2_HEK_DS_B3TMCTDNA序列：[0302]atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagetgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaecateatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtgaSEQIDNO:20[0303]Genescript优化的RSVF_A2_HEK_DS_B3TMCTDNA序列：[0304]atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgacctccaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcgtcaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaecateattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtgaSEQIDNO:137[0305]包括HEK和DS-Cavl替代，和BPIV3FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3TMCT蛋白质序列：[0306]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTITIIIVMIIILVIINITIIVVIIKFHRIQGKDQNDKNSEPYILTNRQSEQIDNO：21[0307]GeneArt优化的RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3TMCTDNA序列：[0308]atggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgccgtgaccttctgctttgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgagaaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaagtgaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaatgccgtgaccgaactgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggccagaagagaactgcccagattcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggctttctgctgggagtgggaagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtctctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaaacagctgctgcccatcttgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgctggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgtccctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccctctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgacagaggctggtactgcgataatgccggctccgtctcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaatctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacaagcctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtctgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgatgccagcatctcccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagtccgatgagetgctgcacaatgtgaacgccggcaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcaecateatcattgtgatgattatcatcctcgtgatcatcaacatcacaatcatcgtcgtgattattaagttccaccggatccagggcaaggaccagaacgacaagaactccgagccctacatcctgacaaaccggcagtgaSEQIDNO:22[0309]GenScript优化的RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3TMCTDNA序列：[0310]atggaactgctgatcctgaaagccaacgctattactactatcctgaccgccgtgacattttgcttcgcatctggacagaacattactgaggaattctaccagtcaacatgcagcgccgtgtccaaaggatacctgagcgccctgcggaccggctggtatacatcagtgattactatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaaatgtaatgggaccgacgcaaaggtgaaactgatcaagcaggagctggataagtacaaaaatgccgtgacagaactgcagctgctgatgcagtccacaccagcaactaacaatcgcgcccggagagagctgccccggttcatgaactataccctgaacaatgctaagaaaaccaatgtgacactgtccaagaaacgcaagaggcgcttcctgggatttctgctgggcgtggggtctgccatcgctagtggagtggccgtctgcaaagtcctgcacctggagggcgaagtgaacaagatcaaaagcgccctgctgtccactaacaaggcagtggtcagtctgtcaaatggcgtgtccgtcctgaccttcaaggtgctggacctgaaaaattatattgataagcagctgctgcctatcctgaacaaacagagctgctccatttctaatatcgagacagtgatcgaattccagcagaagaacaatagactgctggagattaccagagagttcagcgtgaacgccggcgtcaccacacccgtgtccacctacatgctgacaaatagtgagctgctgtcactgattaacgacatgcctatcaccaatgatcagaagaaactgatgtccaacaatgtgcagatcgtcagacagcagagttactcaatcatgtgcatcattaaggaggaagtcctggcctacgtggtccagctgccactgtatggcgtgatcgacaccccctgctggaaactgcatacatctcctctgtgcactaccaacacaaaggaaggaagtaatatctgcctgactcgaaccgaccggggatggtactgtgataacgcaggcagcgtgtccttctttccacaggccgagacctgcaaggtccagagcaacagggtgttctgtgacactatgaatagcctgaccctgccttccgaagtcaacctgtgcaatgtggacatctttaatccaaagtacgattgtaagatcatgactagcaagaccgatgtcagctcctctgtgattacttctctgggggccatcgtgagttgctacggaaagacaaaatgtactgccagcaacaaaaatcgcggcatcattaagaccttctccaacgggtgcgactatgtctctaacaagggcgtggatacagtgagtgtcgggaacactctgtactatgtcaataagcaggagggaaaaagcctgtacgtgaagggcgaacccatcattaacttctatgaccccctggtgttcccttccgacgagtttgatgcatctattagtcaggtgaacgaaaaaatcaatcagagtctggcctttattcggaagtcagatgagctgctgcacaacgtgaatgctggcaaatctacaactaacatcatgatcaccacaatcaecateattatcgtgatgattatcattctggtcatcattaacatcacaatcattgtggtcatcattaagttccaccggattcagggcaaggaccagaacgataaaaatagcgagccctacatcctgaccaatagacagtgaSEQIDNO:23[0311]在一个实施方案中，重组副粘病毒包括包括编码重组hRSVF外域的异源基因的重组仙台病毒基因组。在此类实施方案中，与RSVF外域连接的TM和CT可以来自仙台病毒F蛋白，例如如SEQIDN0:103残基1-21TM，SEQIDN0:103残基22-65CT，或SEQIDN0:103TM+CT所列。例如，在一些实施方案中，与仙台病毒TM和或CT连接的重组hRSVF外域可以包括SEQIDNO:105-108之一所列氨基酸序列：[0312]包括HEK替代，和仙台病毒FCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_SeVCT蛋白质序列。[0313]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKRSEQIDNO：105[0314]包括HEK替代，和仙台病毒FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_SeVTMCT蛋白质序列。[0315]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKRSEQIDNO：106[0316]包括HEK和DS-Cavl替代，和仙台病毒FCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_SeVCT蛋白质序列[0317]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR[0318]SEQIDN0：107[0319]包括HEK和DS-Cavl替代，和仙台病毒FTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_SeVTMCT蛋白质序列[0320]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR[0321]SEQIDNO：108[0322]在一个实施方案中，重组副粘病毒包括包括编码重组hRSVF外域的异源基因的重组NDV基因组。在此类实施方案中，与RSVF外域连接的TM和CT可以来自NDV病毒F蛋白，胞质尾，例如如SEQIDN0:104残基1-21TM，SEQIDN0:104残基22-49CT，或SEQIDN0:104TM+CT所列。例如，在一些实施方案中，与NDVTM和或CT连接的重组hRSVF外域可以包括SEQIDNO:109-113之一所列氨基酸序列：[0323]包括HEK替代，和NDVFCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_NDVCT蛋白质序列[0324]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLffLGNNTLDQMRATTKMSEQIDNO：109[0325]包括HEK替代，和MVFTM和CT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_NDVTMCT蛋白质序列[0326]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIVLTIISLVFGILSLILACYLMYKQKAQQKTLLffLGNNTLDQMRATTKMSEQIDNO：HO[0327]包括HEK和DS-CavI替代，和NDVFCT域的来自A2株的hRSVF蛋白（RSVF_A2_HEK_NDVCT蛋白质序列[0328]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCMYKQKAQQKTLLffLGNNTLDQMRATTKMSEQIDNO：112[0329]包括邢1和05-〇3¥1替代，和冊¥?了]\1和：1'域的来自厶2株的111«¥?蛋白（1«¥?_八2_HEK_NDVTMCT蛋白质序列[0330]MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTVITIIVVMVVILVVIIVIIIVLYRLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR[0331]SEQIDNO：113[0332]H.重组副粘病毒的另外的描述[0333]特定实施方案[0334]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒PIV，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIVF蛋白的TM和CT连接的。[0335]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的。[0336]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的。[0337]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0338]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0339]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0340]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0341]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0342]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0343]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0344]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0345]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0346]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0347]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。[0348]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。[0349]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDVF蛋白的TM和CT连接的。[0350]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDVF蛋白的TM和CT连接的。[0351]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，10IP，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。[0352]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207I^代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。[0353]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒PIV，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIVF蛋白的CT连接的。[0354]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIVlF蛋白的CT连接的。[0355]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与HPIVlF蛋白的CT连接的。[0356]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0357]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0358]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0359]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0360]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0361]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0362]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0363]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0364]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0365]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0366]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。[0367]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。[0368]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDVF蛋白的CT连接的。[0369]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与NDVF蛋白的CT连接的。[0370]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，10IP，155C，290C，190F，和207L替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。[0371]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207I^代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。[0372]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒PIV，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIVF蛋白的TM和CT连接的。[0373]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的。[0374]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的。[0375]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0376]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0377]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0378]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0379]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0380]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0381]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0382]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101?，155：，290：替代且是与8?1¥3?蛋白的了]\1和：1'连接的。[0383]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的。[0384]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101?，155：，290：替代且是与即1¥3?蛋白的了]\1和：1'连接的。[0385]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。[0386]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的TM和CT连接的。[0387]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDVF蛋白的TM和CT连接的。[0388]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDVF蛋白的TM和CT连接的。[0389]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。[0390]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的TM和CT连接的。[0391]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组副流感病毒PIV，该病毒基因组从上游到下游包含PIV基因组启动子，接着是PIVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIVF蛋白的CT连接的。[0392]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIVlF蛋白的CT连接的。[0393]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV1，该病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIVlF蛋白的CT连接的。[0394]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0395]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0396]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0397]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组HPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0398]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0399]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0400]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的。[0401]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101?，155：，290：替代且是与8?1¥3?蛋白的：1'连接的。[0402]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。[0403]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组BHPIV3,该病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101?，155：，290：替代且是与即1¥3?蛋白的：1'连接的。[0404]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子，接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。[0405]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组仙台病毒，该病毒基因组从上游到下游包含仙台病毒基因组启动子接着是仙台病毒N，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与仙台病毒F蛋白的CT连接的。[0406]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDVF蛋白的CT连接的。[0407]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组NDV，该病毒基因组从上游到下游包含NDV基因组启动子，接着是NDVN，P，M，F，HN，和L基因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与NDVF蛋白的CT连接的。[0408]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。[0409]在一些实施方案中，提供了重组副粘病毒，其包含包含如下病毒基因组的重组PIV5,该病毒基因组从上游到下游包含PIV5基因组启动子，接着是PIV5N，P，M，F，HNjPLS因，且进一步包含编码包含重组RSVF外域的I型膜蛋白的异源基因，其中该异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C替代且是与PIV5F蛋白的CT连接的。[0410]在本文中公开的包括包括编码RSVF外域的异源基因的病毒基因组的重组副粘病毒诸如上文讨论的任何重组副粘病毒）的任何实施方案中，编码重组RSVF外域的异源基因可以编码包含RSVF位置1-529的多肽序列。[0411]另外的描述[0412]所公开的重组副粘病毒是自我复制性的，即它们能够在感染适宜的宿主细胞后复制。在数个实施方案中，重组副粘病毒具有减毒表型，例如当施用于人受试者时。[0413]重组副粘病毒的减毒可以使用本领域知道的多种方法来实现，例如通过引入一处或多处引起重组副粘病毒的生物学功能改变，导致减毒表型的突变。插入异源基因也能导致减毒表型。优选地，包含编码异源基因的基因组的副粘病毒在细胞或哺乳动物中与野生型副粘病毒相比减毒约100至5000倍或更多。[0414]可以在公知的体外和体内模型中测试所公开的重组副粘病毒以确认适当的减毒，对表型反转的抗性，和免疫原性。在体外测定法，可以对经修饰的副粘病毒测试一种或多种期望表型，诸如例如温度敏感性复制。还可以在PIV和或重组病毒中包括的异源基因的病毒病原体例如RSV感染的动物模型中测试所公开的重组副粘病毒。多种动物模型是知道的。[0415]重组减毒副粘病毒优选在细胞或哺乳动物中与野生型副粘病毒相比减毒约100至5000倍。在一些实施方案中，优选的是，体外病毒复制水平足以提供供在广泛规模上使用的病毒疫苗生产。在一些实施方案中，优选的是，减毒副粘病毒体外病毒复制水平是至少1〇6，更优选至少1〇7,和最优选至少IO8每ml。减毒突变优选是稳定的。具有至少两处，三处，四处或甚至更多处减毒突变的重组副粘病毒很可能是更加稳定的。[0416]正在进行的临床前研究已经鉴定出对于HPIV1，HPIV2,和HPIV3是减毒性的，而且可以通过反求遗传学来引入以生成减毒株作为潜在疫苗和载体主链的一些突变或修饰。在HPIV主链中包括外来基因对它自身也是减毒性的。这可能是由于多种效应，包括基因组长度延长和基因数目增多以及外来蛋白的影响。无论原因如何，当试图实现适宜水平的减毒时，还不得不考虑插入物的减毒效果。[0417]HPIVl，2,和3的减毒株已经或当前处于血清阴性婴儿和儿童中的临床研究Karron,etal.2012.Vaccine30:3975-398I；Schmidt,etal.2011.ExpertRev.Respir.Med.5:515-526。这些减毒HPIV1，HPIV2,和HPIV3株，或其型式是用于表达异源RSVF蛋白的潜在载体。[0418]提供减毒表型的对副粘病毒基因组的修饰的例子是本领域知道的，而且已经记载于例如美国专利公开文本20120045471;20100119547;20090263883;20090017517;8084037；6,410,023；8,367,074；7,951,383；7,820,182；7704509；7632508；7622123；7250171；7208161；7201907；7192593；20120064112；20140186397；Newmanetal.2002.Virusgenes24:77-92；Tangetal.,2003.JVirol,7720:10819-10828；Basavarajappaetal.2014Vaccine,32:3555-3563；McGinnesetal.,J.Virol.,85:366-377,2011;和Jonesetal.,Vaccine,30:959-968,2012,通过援引将其每一篇完整收入本文。例如，PIV3的减毒可以通过存在BPIV3衍生基因来实现，其赋予灵长动物中的宿主范围限制，包括人，诸如除了来自HPIV3的F和HN之外含有BPIV3基因的BHPIV3病毒SkiadopoulosMHetalJVirol77:1141-8,2003。由于宿主范围限制，仙台病毒也限于灵长动物JonesBGetalVaccine30:959-968,2012。减毒的另一种手段以多种基因中可以发生的错义突变例示，诸如cp45HPIV3病毒中的（SkiadopoulosMHetalJVirol73:1374-81,1999。下文实施例2中为HPIVl提供了减毒性点突变的其它例子。删除一个或数个密码子也能赋予减毒表型，如实施例2中的HPIVl例示的。还如实施例1中例示的，存在与异源外域连接的载体TM加CT，或CT域能强烈减毒载体。HPIVl中的减毒突变的其它例子记载于BartlettEJetalVirolJ4:67,2007,而HPIV2的记载于NolanSMetal,Vaccine23:4765-4774,2005。删除一种或多种辅助基因的整个或部分也是减毒的手段DurbinAVirology261:319-330,1999。[0419]可以在动物模型诸如非人灵长动物，例如非洲绿猴）中评估重组减毒副粘病毒的免疫原性，这通过测定在一次免疫接种之后和在第二次免疫接种之后形成针对副粘病毒的抗体的动物的数目，和通过测量该响应的程度来进行。在一些实施方案中，如果约60至80%的动物在第一次免疫接种之后发生抗体且约80至100%的动物在第二次免疫接种之后发生抗体的话，重组副粘病毒具有足够的免疫原性。优选地，免疫应答针对发起副粘病毒和所衍生的重组副粘病毒中包括的异源基因来源的病毒病原体二者的感染提供保护。[0420]I.另外的载体[0421]会领会的是，可以在除PIV载体以外的载体上包括或表达重组RSVF蛋白和编码它的核酸分子。例如，可以使用质粒载体，以及其它病毒载体，例如，用于在宿主细胞中表达重组RSVF蛋白或其片段，或用于受试者的免疫接种，如本文中公开的。在一些实施方案中，可以作为初始-加强疫苗接种的一部分对受试者施用载体。在数个实施方案中，载体包括在疫苗中，诸如供初始-加强疫苗接种中使用的初始疫苗或加强疫苗。[0422]在数个例子中，载体可以是复制胜任和或减毒的病毒载体。病毒载体也可以是条件性复制胜任的。在其它例子中，病毒载体在宿主细胞中是复制缺陷的。[0423]已经构建了可以用于表达重组RSVF蛋白或其免疫原性片段的一些病毒载体，包括多瘤，即SV40Madzaketal.,1992,J.Gen.Virol.,73:1533-1536，腺病毒（Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6；Berlineretal.,1988,BioTechniques,6:616-629；Gorzigliaetal.,1992,J.Virol.,66:4407-4412；Quantinetal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:2581-2584;Rosenfeldetal.，1992,Ce11，68:143-155;Wilkinsonetal.,1992,Nucl.AcidsRes.,20:2233-2239；Stratford-PerricaudetetaI·，I990，Hum.GeneTher·，1:241-256，痕苗病毒（Macke11etal·，1992，Biotechnology，24:495-499，腺伴随病毒（Muzyczka，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol·，158:91-123;Onetal·，1990,Gene，89:279-282，疱疼病毒，包括HSV和EBVMargolskee，1992,Curr·Top.Microbiol·Immunol·，158:67-90;Johnsonetal.,1992,J.Virol.,66:2952-2965；Finketal.,1992,Hum.GeneTher.3:11-19；Breakfieldetal.,1987,MoI.NeurobioI.,I:337-371；Fresseetal.,1990,Biochem·Pharmacol·，40:2189-2199，辛德比斯病毒（H.Herweijeretal·，1995,HumanGeneTherapy6:116卜1167;美国专利No.5,091,309和5,2217,879，甲病毒S.Schlesinger,1993,TrendsBiotechnol.11:18-22；I.Frolovetal.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11371-11377和鸟（Brandyopadhyayetal.,1984，Mol.CellBiol.，4:749_754;Petropouplosetal.，1992，J.Virol.,66:3391-3397，鼠Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Tmmunol·,158:1-24;MiIIeretal.,1985,Mol.CellBiol.,5:431-437；Sorgeetal.,1984,Mol.CellBiol.,4:173〇-1737；Mannetal.,1985，J.Virol.，54:4Π-407，和人（Pageetal.,1990,J.Virol.,64:5370-5276;Buchschalcheretal.，1992，J.Virol·,66:2731-2739起源的逆转录病毒。杆状病毒（苜蓿尺蠖Autographacalifornica多核多角体病毒;AcMNPV载体也是本领域知道的，而且可以自商业性来源获得（诸如PharMingen,SanDiego，Calif.;ProteinSciencesCorp.，Meriden，Conn·;Stratagene,LaJolla,Calif.〇[0424]在数个实施方案中，病毒载体可以包括表达所公开的重组RSVF蛋白或其免疫原性片段诸如RSVF外域）的腺病毒载体。可以使用来自各种起源，亚型，或亚型混合物的腺病毒作为用于腺病毒载体的病毒基因组的来源。可以使用非人腺病毒例如猿，黑猩猩，大猩猩，鸟，犬，绵羊，或牛腺病毒来生成腺病毒载体。例如，可以使用猿腺病毒作为腺病毒载体的病毒基因组的来源。猿腺病毒可以是血清型1，3,7，11，16，18，19,20,27,33,38,39,48，49，50，或任何其它猿腺病毒血清型的。猿腺病毒可以通过使用本领域知道的任何合适缩写来提及，诸如例如SV，SAdV，SAV或sAV。在一些例子中，猿腺病毒载体是血清型3,7,11，16，18，19，20，27，33，38，或39的猿腺病毒载体。在一个例子中，使用黑猩猩血清型CAd3载体参见例如Peruzzietal.,Vaccine,27:1293-1300,2009。可以使用人腺病毒作为腺病毒载体的病毒基因组的来源。人腺病毒可以是各种亚群或血清型的。例如，腺病毒可以是A亚群例如血清型12，18，和31，8亚群例如血清型3,7，11，14，16,21，34,35，和50，：亚群例如血清型1，2,5,和6，D亚群（例如血清型8,9,10,13,15,17,19,20,22,23,24,25,26,27，28,29,30,32,33,36-39，和42-484亚群（例如血清型4^亚群例如血清型40和41，未归类的血清群例如血清型49和51，或任何其它腺病毒血清型的。本领域普通技术人员熟悉复制胜任和缺陷性腺病毒载体包括单一和多重复制缺陷性腺病毒载体）。复制缺陷性腺病毒载体包括多重复制缺陷性腺病毒载体）的例子披露于美国专利No.5，837，511;5，851，806;5,994,106;6,127,175;6,482,616;和7,195,896,和国际专利申请No.WO9428152，TO9502697，W09516772，W09534671，W09622378，W09712986，TO9721826,和WO03022311〇[0425]III.重组方法，载体，和宿主细胞[0426]可以通过合成和重组方法来生成本文中公开的重组副粘病毒和多核苷酸。因而，还提供了编码感染性副粘病毒克隆的多核苷酸和包括感染性克隆的宿主细胞，以及通过重组方法生成此类载体和宿主细胞的方法。[0427]还提供了编码本文中公开的任何重组RSVF蛋白的分离的核酸分子。[0428]如上文讨论的，可以通过本领域公知的技术来合成或准备所公开的副粘病毒或多核苷酸。参见例如W094027037和US20130052718。野生型副粘病毒基因组的核苷酸序列是知道的且容易得到的，例如在因特网上在GenBank处www-ncbi-nlm-nihgoventrez。可以使用本领域普通技术人员知道的方法来合成或扩增编码所公开的重组副粘病毒的核苷酸序列，包括在无细胞环境中利用DNA聚合酶。进一步地，本领域技术人员能容易地使用遗传代码来构建多种功能性等同核酸，诸如序列不同但编码相同蛋白质序列的核酸。[0429]可以通过克隆技术来制备例示性核酸。适宜的克隆和测序技术的例子，和足以指导通过许多克隆训练的技术人员的用法说明是知道的（参见例如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed,ColdSpringHarbor,NewYork,2012，和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,throughsupplement104,2013。来自生物学试剂和实验设备的制造商的产品信息也提供有用的信息。此类制造商包括SIGMAChemicalCompanySaintLouis，MO,RDSystemsMinneapolis,MN,PharmaciaAmershamPiscataway,NJ,CL0NTECHLaboratories，Inc·PaloAlto，CA，ChemGenesCorp.,AldrichChemicalCompanyMilwaukee,ffI,GlenResearch，Inc·，GIBCOBRLLifeTechnologies，Inc·Gaithersburg,MD,FlukaChemica-BiochemikaAnalytikaFlukaChemieAG,Buchs,Switzerland，InvitrogenCarlsbacUCA，和AppliedBiosystemsFosterCity,CA,VX及技术人员知道的许多其它商业性来源。[0430]重组副粘病毒的基因组可以包括一处或多处变异例如引起氨基酸删除，替代，或插入的突变），只要所得重组副粘病毒保留期望的生物学功能，诸如某一水平的减毒或免疫原性。序列中的这些变异可以是天然发生变异，或者它们可以是经由使用本领域技术人员知道的遗传工程技术而工程化改造的。此类技术的例子可见于参见例如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed.,ColdSpringHarbor,NewYork,2012和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,throughsupplement104,2013,通过援引将二者完整收入本文。[0431]可以对编码本文中描述的核酸进行修饰而不降低它的生物学活性。可以使用已知的重组方法来进行氨基酸替代，插入，和删除，诸如寡核苷酸介导的（定点）诱变，丙氨酸扫描，PCR诱变，定点诱变，盒式诱变，限制性选择诱变，等等（参见例如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed,ColdSpringHarbor,NewYork,2012，和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons，NewYork，throughsupplement104,2013。可以进行一些修饰以便于革巴向分子在融合蛋白中的克隆，表达，或掺入。此类修饰是本领域技术人员公知的，而且包括例如终止密码子，在氨基端添加甲硫氨酸以提供起始位点，置于任一末端的另外的核苷酸以创建方便定位的限制性位点。[0432]“保守”氨基酸替代是那些没有实质性影响或降低蛋白质的功能，诸如蛋白质当施用于受试者时诱导免疫应答的能力的替代。术语保守变异还包括使用替代的substituted氨基酸代替未替代的unsubstituted亲本氨基酸。而且，普通技术人员会认识到，在改变导致氨基酸用化学相似氨基酸替代的情况中，改变，添加或删除所编码的序列中的一个氨基酸或小百分比氨基酸例如少于5%，在一些实施方案中少于1%的个别替代，删除或添加是保守变异。[0433]提供功能相似氨基酸的保守氨基酸替代表是本领域普通技术人员公知的。下述六组是认为是彼此的保守替代的氨基酸的例子：[0434]1丙氨酸㈧，丝氨酸⑸，苏氨酸⑺；[0435]2天冬氨酸⑼，谷氨酸⑹；[0436]3天冬酰胺⑽，谷氨酰胺⑼；[0437]4精氨酸⑻，赖氨酸K;[0438]5异亮氨酸I，亮氨酸L，甲硫氨酸⑽，缬氨酸V;和[0439]6苯丙氨酸F，酪氨酸⑺，色氨酸⑼。[0440]可以自分离自生物学样品的病毒生成所公开的重组副粘病毒。可以通过本领域知道的标准重组方法来生成多核苷酸和载体，诸如聚合酶链式反应（Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed,ColdSpringHarbor,NewYork,2012，和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,throughsupplement104,2013。本领域技术人员还知道改变或修饰核酸序列的方法。[0441]可以自顺序克隆入包括用于在宿主中繁殖的选择标志的载体的聚合酶链式反应盒装配副粘病毒基因组。此类标志包括二氢叶酸脱氢酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性基因和用于大肠杆菌和其它细菌中的培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。[0442]可以使用标准重组方法将多核苷酸插入用于克隆的可复制载体。多种载体是公众可得的。例如，载体可以处于质粒，粘粒，病毒颗粒，或噬菌体的形式。可以通过多种规程将适宜的核酸序列插入载体。一般而言，使用本领域知道的技术将核酸插入适宜的限制性内切核酸酶位点。载体成分一般包括但不限于一种或多种信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。包括一个或多个这些成分的合适载体的构建采用技术人员知道的标准连接技术。[0443]合适的可复制载体的例子包括但不限于pUC19或pTMl。多核苷酸可以与适宜的启动子可操作连接，诸如例如T7聚合酶启动子，巨细胞病毒启动子，细胞聚合酶II启动子，或SPl启动子。可复制载体可以进一步包括用于转录起始，转录终止的位点，和用于翻译的核糖体结合位点。[0444]由副粘病毒基因组或编码副粘病毒蛋白的多核苷酸构成的重组载体导入宿主细胞诸如例如细菌细胞或真核细胞可以通过磷酸钙转染，DEAE-右旋糖酐介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，电核转运，化学转导，电转导，感染，或其它方法来实现。此类方法记载于标准实验室手册，诸如Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed,ColdSpringHarbor,NewYork,2012，和Ausubeletal.InCurrentProtocolsinMolecularBiologyjJohnffileySons,NewYork,throughsupplement104，2013D商业性转染试剂也是可得的，诸如LipofectamineInVitrogen，Carlsbad，Calif·和FuGENE6™RocheDiagnostics，Indianapolis，Ind·。合适的宿主细胞包括但不限于HEp-2细胞，FRhL-DBS2细胞，LLC-MK2细胞，MRC-5细胞，和Vero细胞。[0445]IV.免疫原性组合物[0446]还提供了包含本文中描述的重组副粘病毒诸如包括编码异源重组RSVF蛋白的基因组的重组PIV和药学可接受载剂的免疫原性组合物。可以通过本领域普通技术人员知道的多种施用模式来对受试者施用此类组合物，例如通过鼻内路径。用于制备可施用组合物的实际方法会是本领域技术人员知道或清楚的，而且更加详细地记载于诸如RemingtonsPharmaceuticalSciences,19thEd.,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania,1995等出版物。[0447]因而，本文中描述的重组副粘病毒可以与药学可接受载剂一起配制以帮助保留生物学活性，同时还促进在可接受温度范围内贮存期间升高的稳定性。潜在的载剂包括但不限于生理学平衡的培养基，磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳状液例如油水或水油乳状液），各种类型的润湿剂，防冻添加剂或稳定剂诸如蛋白质，肽或水解产物例如清蛋白，明胶），糖例如蔗糖，乳糖，山梨醇），氨基酸例如谷氨酸钠），或其它保护剂。所得水性溶液可以就这样包装供使用或冻干。冻干制剂在施用前与无菌溶液组合，用于一次或多次剂量给药任〇[0448]所配制的组合物尤其是液体配制剂可以含有抑菌剂以防止或最小化贮存期间的降解，包括但不限于有效浓度通常51%wv的苄醇，酚，间甲酚，氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯，和或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂对于有些患者可能是禁忌的；因此，冻干配制剂可以在含或不含此类成分的溶液任一中重建。[0449]所公开的药物组合物可以根据接近生理学条件的需要而含有药学可接受媒介物质，诸如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，润湿剂，等等，例如乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，单月桂酸山梨聚糖酯，和油酸三乙醇胺酯。[0450]药物组合物可以任选包括佐剂以增强宿主的免疫应答。合适的佐剂是例如toll样受体激动剂，明矾，A1P04，铝胶，脂质A和其衍生物或变体，油-乳状液，皂苷，中性脂质体，含有疫苗和细胞因子的脂质体，非离子嵌段共聚物，和趋化因子。在本领域公知的许多其它合适佐剂中，可以使用含有聚氧乙烯POE和聚氧丙烯POP的非离子嵌段聚合物，诸如POE-Ρ0Ρ-Ρ0Ε嵌段共聚物，MPL™3-0-脱酰单磷酰基脂质A;Corixa，Hamilton，IN和IL-12GeneticsInstitute，Cambridge，MA作为佐剂（Newmanetal.，1998，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems15:89-142。这些佐剂具有优势，即它们帮助以非特异性方式刺激免疫系统，由此增强对药物产品的免疫应答。[0451]在一些实施方案中，组合物可以包括编码来自一种特定RSV亚群或株的RSVF外域的重组副粘病毒，而且还有编码来自不同RSV亚群或株的RSVF外域的重组副粘病毒。例如，组合物可以包括包括来自A亚型和B亚型RSV的重组RSVF蛋白的重组副粘病毒。不同载体可以在混合物中同时施用，或分开施用。由于RSV的某些株之间的交叉保护现象，编码来自第一株的RSVF外域的一种副粘病毒的免疫接种可能针对相同或不同亚群的数个不同株提供保护。[0452]在一些情况中，可能想要组合重组病毒载体或其组合物与诱导针对其它因子特别是那些引起其它儿童病的）的保护性应答的其它药物产品（例如疫苗）。例如，包括本文中描述的重组副粘病毒的组合物可以与免疫接种实践咨询委员会AdvisoryCommitteeonImmunizationPractices，ACIP;cdc.govvaccinesacipindex.html对目标年龄组（例如大约1至6个月大的婴儿推荐的其它疫苗同时（典型地是分开的）或顺序施用。这些另外的疫苗包括但不限于IN施用的疫苗。照此，包括本文中描述的重组RSVF蛋白的重组副粘病毒可以与针对例如乙型肝炎HepB，白喉，破伤风和百日咳DTaP，肺炎球菌PCV，b型流感嗜血杆菌HaemophilusinfluenzaeHib，脊髓灰质炎，流感和轮状病毒的疫苗同时或顺序施用。[0453]基于它们的减毒和免疫原性来选择供免疫原性组合物诸如例如疫苗）中使用的重组副粘病毒。这些疫苗选择标准是依照公知方法确定的。优选地，候选病毒具有稳定的减毒表型，在接受了免疫接种的宿主中展现复制，且在接受者中有效引发免疫应答的产生，优选保护性免疫应答。优选地，候选病毒刺激并扩张免疫应答，例如诱导针对不同病毒株或亚群的免疫应答和或刺激由不同免疫学基础例如分泌对血清免疫球蛋白，细胞免疫，等等）介导的免疫应答。[0454]药物组合物典型地含有有效量的所公开的副粘病毒，而且可以通过常规技术来制备。典型地，每剂免疫原性组合物中的重组病毒的量选择成在没有显著，不利副作用的情况下诱导免疫应答的量。在一些实施方案中，可以以用于在受试者中诱导免疫应答例如在受试者中预防PIV和或RSV感染的单位剂量形式提供组合物。单位剂量形式含有对于施用于受试者合适的一个预选择剂量，或合适标记或计量倍数的两个或更多个预选择单位剂量，和或用于施用单位剂量或其倍数的计量装置。在其它实施方案中，组合物进一步包括佐剂。[0455]V.引发免疫应答的方法[0456]本文中提供的是在受试者中引发免疫应答的方法，其通过对该受试者施用一种或多种所公开的重组副粘病毒来进行。在一个特定例子中，受试者是人。免疫应答可以是保护性免疫应答，例如预防或减轻副粘病毒或重组副粘病毒中包括的异源基因的病毒的后续感染的应答。还可以使用引发免疫应答来治疗或抑制病毒感染和与其相关的病。在数个实施方案中，该方法包括施用包括减毒重组副流感病毒的免疫原性组合物，该减毒重组副流感病毒包括包括异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与PIVF蛋白跨膜TM域和胞质尾连接的重组RSVF外域。[0457]可以为治疗选择具有副粘病毒感染诸如RSV和或PIV感染或处于其发生风险例如由于暴露或有可能暴露于RSV和或PIV的受试者。在施用所公开的免疫原之后，可以对受试者监测副粘病毒感染或与其相关的症状，或二者。[0458]对受试者鼻内施用重组副粘病毒的方法是本领域普通技术人员知道的，就像为施用选择受试者，制备用于鼻内施用的包括重组副粘病毒的免疫原性组合物，和对受试者评估针对重组副粘病毒的免疫应答的方法。此类方法的例示性描述可见于例如Karronetal，2012·Vaccine，3026，3975-3981，通过援引将其完整收入本文。[0459]意图用本公开文本的治疗剂和方法治疗的典型受试者包括人，以及非人灵长动物和其它动物。因为几乎所有人到5岁时感染有RSV和PIV，所以包括整个出生群组作为免疫接种的有关群体。这可以例如通过在出生至6月龄，6月龄至5岁龄的任何时间，在妊娠妇女或育龄妇女）（通过抗体的被动转移来保护她们的婴儿），新生婴儿或胎儿的家庭成员，和年龄大于50岁的受试者中开始免疫接种方案来进行。本公开文本的范围意图包括母体免疫接种。在数个实施方案中，受试者是RSV或PIV3特异性抗体呈血清阴性的人受试者。在另外的实施方案中，受试者不超过1岁龄，诸如不超过6月龄，不超过3月龄，或不超过1月龄。[0460]处于具有严重症状例如需要住院）的RSV和或PIV感染的最大风险的受试者包括对严重疾病最易感的具有早产，支气管肺发育异常，和先天性心脏病的儿童。在儿童期和成人期期间，疾病是较温和的，但是可以与下气道疾病有关且常常因鼻窦炎而变得复杂。疾病严重性在收容的老年人例如超过65岁龄的人）中升高。严重疾病还在具有严重联合免疫缺陷疾病的人中或在骨髓或肺移植后发生。因而，可以为所公开的重组副粘病毒的施用选择这些受试者。[0461]为了为依照本公开文本的方法的预防或治疗鉴定受试者，采用公认的筛选方法来确定与目标或怀疑疾病或状况相关的风险因素，或确定受试者中现有疾病或状况的状态。这些筛选方法包括例如确定可能与目标或怀疑疾病或状况相关的环境，家族，职业，和其它此类风险因素的常规检查，以及诊断方法，诸如本领域可得的且公知的用于检测和或表征副粘病毒感染的各种ELISA和其它免疫测定方法。这些和其它例行方法容许临床医师选择需要使用本公开文本的方法和药物组合物来治疗的患者。与这些方法和原理一致，可以依照本文中的教导或本领域普通技术人员知道的其它常规方法作为独立的预防或治疗程序，或作为其它治疗的跟踪，辅助或配合治疗方案施用组合物。[0462]所公开的重组副粘病毒的施用可以是出于预防或治疗目的。当预防性提供时，可以在任何症状之前，例如在感染之前提供免疫原。预防性施用用来引发能预防或改善任何后续感染的免疫应答。在一些实施方案中，该方法可以涉及选择处于招致副粘病毒感染风险的受试者，并对该受试者施用有效量的所公开的重组副粘病毒。可以在预期的暴露于副粘病毒之前从而引发能削弱感染和或相关疾病症状的预期严重性，持续时间或程度的免疫应答），在暴露或怀疑暴露于该病毒之后，或在感染实际起始之后提供重组副粘病毒。在一些例子中，使用本文中公开的方法的治疗延长受试者的存活时间。[0463]当受试者随后感染或再感染野生型RSV或PIV时，对受试者施用所公开的包括RSV和PIV抗原的重组副粘病毒能引发产生针对严重下呼吸道疾病诸如肺炎和细支气管炎，或哮吼保护性的免疫应答。虽然自然循环的病毒仍然能够引起感染，特别是在上呼吸道中，但是作为疫苗接种和可能的后续野生型病毒感染所致抗性加强的结果，鼻炎的可能性降低了。在疫苗接种之后，有可检测水平的能够在体外和在体内中和同源相同亚群的）野生型病毒的宿主生成血清和分泌型抗体。在许多情况中，宿主抗体还会中和不同的非疫苗亚群的野生型病毒。为了实现更高水平的交叉保护，例如针对另一个亚群的异源株的，可以给受试者疫苗接种包括包括来自RSVA和B亚群二者的至少一种优势株的RSVF蛋白的重组病毒载体的组合物。[0464]以有效诱导或增强针对受试者优选人）中的病毒中包括的抗原的免疫应答的量对受试者提供本文中描述的重组病毒载体，和其免疫原性组合物。有效量会容许病毒的一些生长和繁殖以产生期望的免疫应答，但是不会生成病毒相关症状或病。基于本文中提供的指导和本领域的知识，本领域技术人员会容易地能够确定活疫苗中要使用的病毒的适当量。精确量会取决于数个因素，例如受试者的健康状态和重量，施用的模式，病毒的减毒程度，配制剂的性质，和受试者的免疫系统是否是受损的。[0465]可以在配合或初始-加强疫苗接种方案或组合配制剂中使用包括一种或多种所公开的重组副粘病毒的免疫原性组合物。在某些实施方案中，新颖的组合免疫原性组合物和配合免疫接种方案采用分开的免疫原或配制剂，每一种均致力于引发抗病毒免疫应答，诸如针对RSV和PIV蛋白的免疫应答。分开的引发抗病毒免疫应答的免疫原性组合物可以在在一个免疫接种步骤中施用于受试者的多价免疫原性组合物中组合，或者它们可以在配合或初始-加强免疫接种方案中分开在单价免疫原性组合物中）施用。[0466]涵盖的是，可以有数次加强，而且每次加强可以是不同的所公开的免疫原。在一些例子中还涵盖的是，加强可以是与另一次加强或初始相同的免疫原。[0467]—旦施用所公开的重组副粘病毒，受试者的免疫系统典型地通过生成对病毒蛋白特异性的抗体来响应免疫原性组合物。此类应答意味着对受试者投递了免疫学有效剂量。[0468]对于每位特定受试者，可以根据个体需要和施用免疫原性组合物或监督免疫原性组合物施用的人员的专业判断随时间评估和调整特定剂量方案。在一些实施方案中，会在评估有效剂量免疫接种方案的背景中测定受试者的抗体应答。在大多数情况中，评估受试者获得的血清或血浆中的抗体滴度会是足够的。是否施用加强接种和或改变施用于个体的治疗剂的量的决策可以至少部分基于抗体滴度水平。抗体滴度水平可以基于例如免疫结合测定法，其测量血清中结合至抗原包括例如RSVF蛋白）的抗体的浓度。所公开的免疫原的实际剂量会随诸如受试者的疾病适应证和特定状态例如该受试者的年龄，体型，健康，症状的程度，易感性因子，等等），施用的时间和路径，正在并行施用的其它药物或治疗，以及用于在受试者中引发期望活性或生物学应答的组合物的具体药理学等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的预防或治疗应答。[0469]有效剂量的确定典型地基于动物模型研究，接着是人体临床试验，而且受到显著降低受试者中目标疾病症状或状况的发生率或严重性，或在受试者中诱导期望应答诸如中和性免疫应答的施用方案指导。在这点上合适的模型包括例如鼠，大鼠，猪，猫，雪貂，非人灵长动物，和本领域知道的其它公认动物模型受试者。或者，可以使用体外模型（例如免疫学和组织病理学测定法来确定有效剂量。使用此类模型时，只需要普通计算和调整来确定用于施用治疗有效量的组合物例如有效引发期望的免疫应答或减轻目标疾病的一种或多种症状的量）的适宜浓度和剂量。在备选实施方案中，出于治疗或诊断目的任一，有效量或有效剂量的组合物可以仅仅抑制或增强一种或多种与本文中所列疾病或状况相关的选定生物学活性。在一个实施方案中，病毒施用的通用范围是约IO3至约IO7个噬斑形成单位PFU或更多的病毒每位人受试者，包括约IO4至约IO5PFU病毒每位人受试者。[0470]诱导降低或预防感染的免疫应答的免疫原性组合物的施用可以但是并非必须完全消除此类感染，只要感染可测量地降低，例如降低至少约50%，诸如至少约70%，或约80%，或甚至约90%在该药剂缺失下的感染，或与参照药剂相比。那些需要治疗的包括一般群体和或感染有副粘病毒诸如RSV和或PIV或处于其感染风险的患者。[0471]在一个例子中，期望应答是抑制或降低或预防RSV和或PIV感染或再感染。有效的方法不需要完全消除或降低或预防RSV和或PIV感染。例如，与合适对照相比，施用有效量的所公开的重组副粘病毒可以将后续RSV和或PIV感染例如如通过细胞感染或通过受到RSV和或PIV感染的受试者的数目或百分比测量的）降低期望量，例如至少10%，至少20%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%，或甚至至少100%消除或预防可检测的RSV和或PIV感染）。[0472]剂量和剂数会取决于设置，例如，在通过在先副粘病毒感染或免疫接种而初始的成人或任何人，一剂可能是足够的加强剂。在未接触的受试者中，在一些例子中，可以给予至少两剂，例如至少三剂。在一些实施方案中，给予每年加强，例如随同每年流感疫苗接种。[0473]在受试者的免疫接种之后，可以在适宜时间点自受试者收集血清，冷冻，并贮存，供抗体滴度测定法和或中和测试用。抗体水平的定量可以通过亚型特异性中和测定法或ELISA来实施。测定中和活性的方法是本领域普通技术人员知道的，而且本文中有进一步描述，包括但不限于噬斑减少中和（PRNT测定法，微量中和测定法，基于流式细胞术的测定法，单周期感染测定法。在一些实施方案中，可以使用一组RSV或PIV假pseudo病毒来测定血清中和活性。通过先前记载的PRVN测定法deGraafetal.，J.VirolMethods,143:169-174，2007在血清样品中测定病毒中和性抗体滴度。简言之，可以稀释血清样品并与大约50p.f.u.表达增强型绿色荧光蛋白的NL100或NL199—起于37°C温育60分钟。随后，将病毒-血清混合物添加至24孔板中的Vero-118细胞并于37°C温育。2小时后，用等量的感染培养基和2%甲基纤维素的混合物替换上清液。6天后，使用Typhoon9410可变模式成像仪GEHealthcare对荧光噬斑计数。抗体滴度表述为依照ReedMuench，Am.J.Hyg.,27,493-497，1938的方法计算的，导致噬斑数目减少50%的稀释度。[0474]另外的实施方案：[0475]条款1。一种重组副粘病毒，其包含a包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的跨膜域TM和胞质尾CT连接的异源病毒的I型跨膜蛋白的外域;或⑹包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的TM和CT连接的异源病毒的II型跨膜蛋白的外域。[0476]条款2。条款1的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒IHPIVl，重组人副流感病毒IHPIV2，重组人副流感病毒1HPIV3，重组副流感病毒5PIV5，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒NDV。[0477]条款3。条款2的重组副粘病毒，其包含:包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组副流感病毒（PIV，该异源基因编码与PIVF蛋白TM和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSVF外域;包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组NDV，该异源基因编码与NDVF蛋白TM和CT连接的重组RSVF外域;或包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组仙台病毒，该异源基因编码与仙台病毒F蛋白TM和CT连接的重组RSVF外域。[0478]条款4。条款1-3任一项的重组副粘病毒，其包含:包含包含如下异源基因的病毒基因组的重组PIV，该异源基因编码与PIVF蛋白TM和CT连接的重组RSVF外域。[0479]条款5。条款4的重组副粘病毒，其中该RSVF外域来自人RSVhRSVF蛋白。[0480]条款6。条款4或条款5的重组副粘病毒，其中该hRSVF蛋白来自A亚型hRSV或B亚型hRSV〇[0481]条款7。条款4-6任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域通过与天然RSVF蛋白序列相比的一处或多处氨基酸替代而稳定化于RSVF融合前构象。[0482]条款8。条款4-7任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含下列氨基酸：（a66E;b101P;c155C和290C;d190F;e207L;或（fa和b;a和（c;a和d;a和e;a，（d，和e;a，（c，（d，和e;a，（b，和c;a，（b，和d;a，（b，和e;a，（b，（e，和⑹；（a，⑹，（c，（d，和e;c和d;或c和e;或c，（d，和e的组合，其中氨基酸编号方式对应于SEQIDNO:1所列RSVF蛋白序列。[0483]条款9。条款8的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含下列氨基酸替代：（aK66E;bQ101P;cS155C和S290C;dS190F;eV207L;或（fa和（b;a和（c;a和（d;a和e;a，（d，和e;a，（c，（d，和e;a，⑹，和c;a，⑹，和d;a，⑹，和e;a，（b，（e，和d;a，（b，（c，（d，和e;c和d;或（c和e;或（c，（d，和e的组合。[0484]条款10。条款8或条款9的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含66E，101P，115C，290C，190F，和207L。[0485]条款11。条款4-10任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含与SEQIDNO:1WTRSVFA，2WTRSVFB，12A2HEK，14A2HEK+DS，或21A2HEK+DS-Cavl之一的RSV外域至少85%同一的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:12,14,或21的RSV外域的氨基酸序列。[0486]条款12。条款4-11任一项的重组副粘病毒，其中该PIV是重组PIVl，重组PIV2,或重组PIV3〇[0487]条款13。条款12的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组PIVl，且与RSVF外域连接的TM和CT来自PIVlF蛋白；重组PIV2,且与RSVF外域连接的TM和CT来自PIV2F蛋白；或重组PIV3，且与RSVF外域连接的TM和CT来自PIV3F蛋白。[0488]条款14。条款12或条款13的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组HPIVl且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT来自HPIVlF蛋白；重组HPIV2且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT来自HPIV2F蛋白；重组HPIV3且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT来自HPIV3F蛋白；或重组BHPIV3且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT来自BPIV3F蛋白。[0489]条款15。条款4-14任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域来自hRSVF蛋白，且该TM和CT来自BPIV3F蛋白。[0490]条款16。条款4-15任一项的重组副粘病毒，其中该重组PIV是：重组HPIVl且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT包含SEQIDNO:31所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:31至少90%同一的氨基酸序列；重组HPIV2且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT包含SEQIDNO:39所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:39至少90%同一的氨基酸序列；重组HPIV3且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT包含SEQIDNO:46所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:46至少90%同一的氨基酸序列;或重组BHPIV3且与RSVF外域连接的PIVFTM和CT包含SEQIDNO:53所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:53至少90%同一的氨基酸序列。[0491]条款17。条款4-16任一项的重组副粘病毒，其中该重组PIV是:重组HPIV3且编码与HPIV3FTM和CT连接的hRSVF外域的异源基因包含SEQIDNO:10所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；或重组BHPIV3且编码与BPIV3FTM和CT连接的hRSVF外域的异源基因包含SEQIDN0:21所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列。[0492]条款18。条款4-17任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域来自hRSVF蛋白且该重组PIV包含编码下述各项的病毒基因组:HPIV3F和HN蛋白和BPIV31?，：，¥，1，和1^蛋白，且其中与RSVF外域连接的TM和CT来自BPIV3F蛋白；HPIV1N，P，C，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSVF外域连接的TM和CT来自HPIVlF蛋白；HPIV2N，P，V，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSVF外域连接的TM和CT来自HPIV2F蛋白；或HPIV3N，P，C，M，F，HN和L蛋白，且其中与RSVF外域连接的TM和CT来自HPIV3F蛋白。[0493]条款19。条款4-18任一项的重组副粘病毒，其中与PIVTM和CT连接的重组RSVF外域是由Piv基因组的基因组启动子下游的第一或第二基因编码的。[0494]条款20。条款18或条款19的重组副粘病毒，其中该病毒基因组从上游到下游包含：PIV基因组启动子，接着是1?，^，1^，圆，和1^基因；且其中编码与？1¥了1和：1'连接的重组RSVF外域的基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，或编码N和P蛋白的基因之间。[0495]条款21。条款18-19任一项的重组副粘病毒，其包含编码下述各项的病毒基因组：分别包含SEQIDN0:21，101，47,48,49,52所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的序列的HPIV3F和HN基因和BPIV3N，P，C，V，M，和L基因。[0496]条款22。在前条款任一项的重组副粘病毒，其中该异源基因是为了人细胞中的表达而密码子优化的。[0497]条款23。条款22的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是：重组HPIV3且该异源基因编码与HPIV3FTM和CT连接的RSVF外域，且包含SEQIDNO:11GenScriptRSVF_HEK_DS-Cavl_H3TMCT所列核苷酸序列;或重组BHPIV3且该异源基因编码与BPIV3FTM和CT连接的RSVF外域，且包含SEQIDN0:22GenArtRSVF_HEK_DS-Cavl_B3TMCT或SEQIDNO:23GenScriptRSVF_HEK_DS-Cavl_B3TMCT所列核苷酸序列。[0498]条款24。一种重组病毒载体，其包含:包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与病毒基因组的I型膜蛋白的TM和CT连接的RSVF外域。[0499]条款25。条款24的病毒载体，其中该RSVF外域包含K66E和QlOlP氨基酸替代。[0500]条款26。一种重组病毒载体，其包含包含如下异源基因的病毒基因组，该异源基因编码包含K66E和QlOlP氨基酸替代的RSVF外域。[0501]条款27。条款24-26任一项的病毒载体，其中该RSVF蛋白通过一处或多处氨基酸替代而稳定化于融合前或融合后构象。[0502]条款28。条款24-27任一项的病毒载体，其中该RSVF外域通过S155C，S290C，S190F，和V207L氨基酸替代而稳定化于融合前构象。[0503]条款29。条款26-28任一项的病毒载体，其中该RSVF外域是可溶性的且可以自包含该病毒载体的宿主细胞分泌。[0504]条款30。条款24-29任一项的病毒载体，其中该病毒载体是重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒IHPIVl，重组人副流感病毒IHPIV2，重组人副流感病毒1HPIV3，重组副流感病毒5PIV5，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒NDV。[0505]条款31。条款24-30任一项的病毒载体，其中该RSVF外域来自人RSVhRSVF蛋白。[0506]条款32。条款24-31任一项的病毒载体，其中编码RSVF蛋白的异源基因包含SEQIDNO:18核苷酸1-1587所列核酸序列（外域由GenScript优化的RSVF_A2_HEK_DS-Cavl_B3CTDNA序列编码）。[0507]条款33。在前条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体，其中由感染有该重组副粘病毒或病毒载体的宿主细胞生成的病毒颗粒至少90%包含包含由该异源基因编码的外域的病毒包膜。[0508]条款34。在先条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体，其中该重组副粘病毒或病毒载体是减毒的。[0509]条款35。一种免疫原性组合物，其包含在前条款任一项的重组副粘病毒或病毒载体和药学可接受载剂。[0510]条款36。条款35的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。[0511]条款37。一种在受试者中引发针对病毒和由其编码的异源抗原的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物。[0512]条款38。一种在受试者中引发针对副粘病毒和由其编码的异源抗原的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含包含编码异源抗原的异源基因的重组副粘病毒。[0513]条款39。一种在受试者中引发针对RSV和PIV的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用包含治疗有效量的条款35或条款36的免疫原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含包含编码RSV抗原的异源基因的重组副粘病毒。[0514]条款40。条款37-39任一项的方法，其中该免疫应答是保护性免疫应答。[0515]条款41。条款37-40任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的初始-加强施用。[0516]条款42。条款37-41任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的鼻内或胃肠外施用。[0517]条款43。条款37-42任一项的方法，其中该受试者是人或兽医受试者。[0518]条款44。条款37-43任一项的方法，其中该受试者具有RSV或PIV感染或处于其风险。[0519]条款45。条款37-44任一项的方法，其中该受试者小于1岁龄。[0520]条款46。一种核酸分子，其包含条款1-25任一项的重组副粘病毒的基因组。[0521]条款47。一种重组RSVF蛋白或其免疫原性片段，其包含K66E和QlOlP氨基酸替代。[0522]条款48。条款47的重组RSVF蛋白或其免疫原性片段，其进一步包含：（aS155C和S290C;bS190F;cV207L;或（fa和⑹；（a和（c;⑹和（c;或（a，⑹，和（c的组合。[0523]条款49。条款47或条款48的重组RSVF蛋白的免疫原性片段，其包含RSVF外域。[0524]条款50。一种核酸分子，其编码条款47-49任一项的重组RSVF蛋白。实施例[0525]提供以下实施例以例示某些实施方案的特定特征，但是权利要求的范围不应限于所例示的那些特征。[0526]实施例1[0527]由减毒副流感病毒载体表达的呼吸道合胞病毒RSV融合0^糖蛋白的改善的表达和免疫原性[0528]这个实施例描述通过使用RSVF序列来自早期传代病毒，通过密码子优化，通过使用稳定且高度免疫原性的融合前和融合后形式的RSVF，和通过改造RSVF蛋白TM和CT使其更加有效地掺入载体颗粒来增强由重组BHPIV3表达的RSVF的免疫原性和稳定性的办法。[0529]引言。所施用的活减毒RSV株代表用于RSV疫苗的一种策略，而且这些当前处于开Hurwitz.2011.Expert.Rev.Vaccines.10:1415-1433；CollinsandMelero.2011.VirusRes.162:80-99；Karron,etal.2013.CurrentTopicsMicrobiologyandImmunology372:259-284。活减毒RSV株典型地会通过鼻内（IN路径来施用。然而，减毒一般导致抗原合成降低，导致免疫原性降低。获得减毒和免疫原性之间的合适平衡对于RSV是挑战性的。[0530]完全的，感染性的HPIV可以整个自转染细胞培养物中克隆的cDNA生成（使用反求遗传学）。为了表达而设计的外来基因会进行修饰，使得它的侧翼是HPIV转录信号称作基因起点和基因终点信号，分别位于每一种基因的起点和终点），而且会通过反求遗传学作为另外的基因插入HPIV基因组。然后外来基因会转录成分开的mRNA，像其它HPIV基因一样。HPIV能容纳和表达数个添加的外来基因（Skiadopoulos，etal.2002.Virology297:136-152。然而，多种基因可以是过度减毒性的，而且能搜集点突变（Skiad〇p〇Ul〇S，etal.2002.Virology297:136-152。[0531]HPIV转录在基因组的3’末端处的单一启动子处起始并顺序行进。一部分聚合酶在每一个基因接点处脱离模板，导致基因转录的负梯度。因此，启动子邻近基因表达比下游基因更加频繁。接近启动子放置外来基因会提高表达，但是具有影响下游载体基因表达的潜力。诸如基因起点或基因终点转录信号的效率的差异或RNA模板中有时存在但了解较少的其它结构性特征的影响等其它特征也能无法预测地影响插入基因或可读框ORF的表达Whelan,etal.2004.CurrentTopicsMicrobiologyandImmunology283:61-119〇另夕卜，在一些情况中，病毒构建物的特性可以受到仍然有待鉴定的因素的极大影响;例如，RSVF基因插入PIV3载体的P-M基因接点产生实质性温度敏感性的且减毒的病毒LiangB，etal.2014.JVirol88:4237-4250。因而，虽然来自HPIV基因组的表达的广泛细节一般是知道的，但是具体构建物可以给出无法预测的结果。[0532]在先前的研究中，使用BHPIV3载体作为载体，自启动子之后第一和第二基因组位置中添加的基因表达RSVG基因和F蛋白或自N和P基因之间的第二基因组位置中添加的基因表达RSVF基因。后一种病毒称作MEDI-534已经在血清阴性儿童中的临床研究中评估，而且是减毒的，耐受较好，且感染性的，但是针对RSV的免疫原性比希望的要低Bernstein,etal.2012.PediatricInfectiousDiseaseJournal31:109-114。来自疫苗接受者的脱落疫苗病毒的分析显示〜50%的标本含有带有预测会扰乱RSVF表达的突变的疫苗病毒。这很可能降低免疫原性。临床试验材料CTM的回顾性分析显示2.5%的这种病毒不表达RSVFYang，etal.2013.Vaccine31:2822-2827。另外，RSVF插入物积累在蛋白质水平灭活其表达的突变及这些突变在生长期间扩增的观察结果提示使RSVF蛋白的表达沉默具有选择性优势。这很可能是由于RSVF蛋白的高融合原性性质，它有效介导合胞体形成。在体外，这导致破坏细胞基质（cellsubstrate，会降低载体复制。另外，高水平的外来糖蛋白的合成能干扰载体糖蛋白经由内质网和胞吐途径的合成，加工和转运，而且能在位阻上干扰病毒粒体形态发生，等等。这些作用可以在体外和在体内发生。[0533]早期传代HEK型式的RSVF蛋白和密码子优化型式的RSVF可读框ORF的表达。升高的病毒抗原表达典型地提供增强的免疫原性。编码载体抗原的ORF的密码子优化能提高它的表达，继而增强它的免疫原性，例如自病毒或DNA载体表达的人免疫缺陷病毒抗原已经显不的（Gao,etal.2003.AIDSresearchandhumanretroviruses19:817-823;Carnero，etal.2009.JVirol83:584-597。然而，这些序列变化可以具有超出改善翻译的作用，诸如对mRNA稳定性和转运的作用，所以改变mRNA的核苷酸序列的作用可能是复杂的且无法预测的。因此，使用GeneArtGA算法设计密码子优化型式的RSVF序列并评估以确定它是否赋予蛋白质表达。[0534]在设计这个密码子优化的ORF时，错误使用了1960年代的一种早期传代型式的RSV株A2的氨基酸序列（Connors，etal.l995.Virology208:478-484;Whitehead，etal.1998.JVirol72:4467-4471。这种1960年代的早期传代或低传代株在它的繁殖中使用人胚肾HEK细胞培养物之后称作HEKAEK病毒与当前的高传代的实验室型式的RSV株A2的区别在于两处氨基酸指派Connors，etal·1995.Virology208:478-484;Whitehead,etal.1998.JVirol72:4467-4471AEK型式具有指派66E和101P，而高传代的实验室A2株具有指派66K和101Q以下称作“非HEK”指派）（图1。然而，鉴于它们的高突变率，病毒株之间或给定株的原种之间序列差异的发生对于RNA病毒是常见的，而且HEK差异先前没有知道的重要性。进一步地，称作RSVNIHΔΜ2-2的减毒RSV疫苗候选中HEK指派的存在与细胞培养物复制效率的较小降低相关。另外，位置66处的HEK指派鉴定为影响RSV感染期间的合胞体形成。因而，鉴于它们与复制降低的关联，意图避免HEK指派。然而，因为含有HEK指派的型式的RSVF意外地用于初始密码子优化，所以构建平行的GA优化的非HEK型式并比较两种型式（图1。两种型式的RSVF放置在BPIV3基因起点和基因终点转录信号的控制下并插入rBHPIV3载体的第2位置（图1。在所有后续的表达RSVF的rBHPIV3构建物中使用该转录信号和插入物位置，从而始终提供直接比较。[0535]用两种不同载体称作“HEKGA-opt”和“非HEKGA-opt”）感染Vero细胞，在感染后48小时制备细胞裂解物，并将蛋白质提交变性去污剂存在下及还原性或非还原性条件下的凝胶电泳。通过Western印迹将分开的蛋白质转移至膜并使用对RSVF特异性的抗体进行分析（图2。这显示了HEK指派的存在与较小（〜2倍但一致的RSVF蛋白表达升高相关（图2。这一发现的一种非限制性解释是HEK指派提高F蛋白稳定性，尽管对蛋白质合成的影响是可能的但看来不太可能，原因在于HEK和非HEK型式的FORF除了两个密码子以外是同一的。另夕卜，当在非还原性条件下分析时，HEK指派的存在与RSVF三聚体的凝胶迀移率的降低相关图2。这提示这些指派改变F蛋白三聚体结构。更引人注目地，HEK型式的RSVF的表达与同非HEK型式相比合胞体形成的剧烈降低相关（图3，即使正如早就注意到的，HEK型式以略微升高的水平表达。这种测定法利用受到rBHPIV3空载体感染的细胞中诱导的明显合胞体的普遍缺失，而来自载体的RSVF蛋白表达导致一般与RSVF蛋白表达量成比例的合胞体形成。这为自PIV载体表达的RSVF蛋白的数量和功能提供一种测定法。这些关注HEK的观察结果指示HEK指派与RSVF的合成稳定性，结构，和融合原性活性中的差异相关，而且这些作用在任何其它RSV蛋白缺失下发生，因而与来自异源载体的表达直接有关。[0536]因为HEK指派来自1960年代的RSV株A2的低传代原种，所以它们很可能代表原始临床分离物，而非HEK指派在后续年代里在广泛体外传代期间出现。这提示HEK型式的F的低融合原性表型更加代表原始生物学病毒。非HEK型式可能代表在细胞培养物中传代期间选择的高融合原性变体。高融合原性型式的RSVF在自然界中可能不太有利，因为它可能去稳定化病毒，但是可能在细胞单层中的快速生长的实验室设置中得到选择。检查了来自GenBank数据库中的临床分离物的RSVF的226种序列，发现临床分离物通常含有HEK指派。这与这些指派代表循环中的RSV—致。无论如何，HEK指派提供F蛋白表达的适度升高且提供低融合原性形式的RSVF。合胞体形成降低是有利的，因为它降低可能另外干扰HPIV载体复制且有利于选择RSVF插入物沉默的载体的细胞病原性。因此，HEK指派具有三重优势，代表更加天然且临床有关形式的F蛋白，提供蛋白质表达的适度升高，和降低使RSVF插入物沉默的选择压力。[0537]还评估了密码子优化对RSVF表达和免疫原性的作用。连同通过两种其它不同算法生成的两种其它密码子优化的RSVHEKF序列，使用上文描述的含有HEK且GA优化的型式HEKGA-opt。评估多种优化型式不是典型实践，因为它提高花费和不便且尚未显示是有用的。两种其它来源是DNA2.0D2和GenScriptGS算法;比较还包括非HEK，非密码子优化的型式（图4。密码子优化导致RSVF蛋白合成显著增强，令人惊讶的是不同型式的程度不同。对含有HEK的GenScript优化的F蛋白（HEKGS-opt观察到最高表达，比未修饰的RSVFnon-HEKnon-opt高10倍Vero细胞和16倍LLC-MK2细胞）（图5。更加有效的ORF的表达水平如此之高，使得逐渐升高水平的合胞体形成明显与升高水平的F表达有关，不管HEK指派的存在图6，尽管可以假设合胞体形成在HEK指派缺失下甚至会更快且更加广泛。[0538]还使用先前记载的算法（Coleman，etal.2008.Science320:1784-1787作为提高F蛋白表达的手段评估了密码子对优化。密码子对优化提高与高表达相关的密码子对的频率。然而，这在RSVF的情况中没有赋予任何表达升高。[0539]与预期相反，RSVF表达升高10至16倍和伴随的合胞体形成升高对细胞培养物中的载体复制没有显著的负面影响（图7。可能预期高水平的RSVF表达和合胞体形成会在早就注意到的多个步骤任一干扰载体，包括载体糖蛋白合成，加工，胞吐，载体颗粒形成，和细胞存活力，但是情况不是这样。这是特别令人惊讶的，因为正如早就注意到的，MEDI-534中使RSVF基因的表达沉默的突变的积累和扩增提示存在针对RSVF蛋白的表达的实质性选择压力。与空载体相比，所有具有RSVF插入物的载体适度减毒（图7-或许涉及共同的减毒效果，诸如提高基因组长度和基因数目-但是以彼此相似的动力学复制且生长至比空载体的峰滴度略微更低的较高的峰滴度图7。峰滴度的适度变异很可能代表实验性变异性。[0540]在仓鼠模型中评估rBHPIV3载体的体内复制，免疫原性，和保护功效。以一剂IO5个TCID5q组织-培养-感染-剂量-50单位每只动物给多组仓鼠鼻内免疫接种rBHPIV3载体。另外，包括以一剂IO6个噬斑形成单位Pfu给予的野生型wtRSV作为诱导RSV特异性免疫的阳性对照。包括wtRSV对照时要警告wtRSV是非减毒病毒，而载体是减毒的且因该原因而可能是免疫原性相对较低的。在感染后第3和5天对6只动物每种病毒每天处以安乐死，并收集鼻甲和肺用于病毒滴定以测量体内复制。这显示与空载体相比，携带RSVF插入物的载体在鼻甲中（上呼吸道适度减毒，而且在肺中（下呼吸道实质性减毒（图8。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较:对于空载体，第3和5天的滴度是相当的，而对于携带RSVF的载体，第3天滴度比第5天滴度要低，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。令人惊讶地，在具有RSVF插入物的载体中，那些具有增强的RSVF表达的没有比具有更少RSVF表达的（S卩non-HEKnon-opt减毒更多。因而，将RSVF插入物添加至rBHPIV3载体在体内是减毒性的-或许是由于一些共同特征，诸如基因组长度或基因数目升高-但是这看来没有受到RSVF蛋白的合成水平的实质性影响。[0541]通过使用补充有豚鼠补体的60%噬斑减少测定法它是一种标准测定法测量RSV中和性抗体的血清滴度来评估载体的免疫原性。所有表达RSVF的载体均诱导相似高滴度的RSV中和性血清抗体，不管HEK指派或密码子优化（图9。存在与提高RSVF表达相关的中和性滴度的适度渐进性升高，但是差异不是统计学显著的。作为对照平行感染的WTRSV诱导比载体显著更高滴度的RSV中和性抗体。然而，重要的是要注意，通过RSV感染诱导的中和性抗体包括来自F和G中和抗原二者的贡献，而载体仅仅具有对中和性滴度做出贡献的F特异性抗体。另外，非减毒的wtRSV对照比减毒的载体更加有效地复制，尤其是在肺中（图8，这会与载体相比提高它的免疫原性。[0542]为了评估这些载体的保护功效，免疫接种后30天通过鼻内感染IO6PfuwtRSV每只动物攻击来自图9中的实验，以6只动物分组的免疫接种仓鼠。在攻击后3天自处以安乐死的动物收集鼻甲和肺，制备组织匀浆物，并通过噬斑测定法评估以测量攻击RSV复制的水平。表达RSVF的载体赋予肺中几乎完全的保护和鼻甲中中等水平的保护，而wtRSV赋予这两个解剖学部位中几乎完全的保护（图10。表达RSVF的载体间在针对RSV攻击的保护功效方面没有显著差异。应当注意的是，由RSV赋予的保护会包括来自针对F和G蛋白二者的中和性抗体以及针对潜在所有RSV蛋白的细胞免疫的贡献，而由载体赋予的保护会包括仅仅针对F蛋白的体液和细胞免疫。另外，正如注意到的，RSV对照是在免疫接种期间复制至比载体更高滴度的非减毒野生型病毒图8，尤其在肺中，这会提高它的免疫原性和保护功效。[0543]这些结果显示使用HEK指派和密码子优化的序列所致RSVF蛋白表达升高10至16倍没有导致RSV中和性血清抗体的诱导显著升高尽管观察到升高的趋势或针对wtRSV攻击的保护显著升高。与之对比，相似水平的人免疫缺陷病毒抗原表达升高导致不同动物模型中其它病毒载体和DNA疫苗的保护增强（Gao,etal.2003.AIDSresearchandhumanretroviruses19:817-823;Carnero，etal.2009.JVirol83:584-597。先前还观察到rBHPIV3载体中位置I或2较之6处的插入所致RSVF表达的30至69倍差异诱导仓鼠中保护功效的显著差异LiangB，etal.2014JVirol88:4237-4250。因而，一般认为抗原合成升高会赋予免疫原性升高。然而，在一些情况中，这种作用的程度可能不足以不含糊地检测至IJ，或者可能是给定的体内模型可能不够敏感。因而，本研究中的10至16倍差异可能不足以诱导在半允许性仓鼠模型中是统计学显著的足够程度的作用。更高RSVF表达的有益效果可能与其它特征组合时，或在临床前和临床评估中具有更大样品尺寸的允许性宿主（即灵长动物和人）中更加突出。特别地，在这项研究中观察到的F蛋白表达的10至16倍升高是在Vero非洲绿猴或LLC-MK2恒河猴细胞中，其中为了人使用的密码子优化鉴于这些灵长动物与人相对较近的系统发生学关联性很可能会是有效的。与之对比，体内免疫原性测定法采用仓鼠，其中为了人使用的密码子优化可能不会有效提高表达和由此免疫原性。[0544]由rBHPIV3载体表达的融合前和融合后形式的RSVF的免疫原性的评估。像所有副粘病毒F蛋白一样，RSVF蛋白首先装配成融合前构象，即首先在感染细胞的表面上积累并掺入病毒粒体的型式。诸如通过与邻近靶细胞膜接触，可以触发融合前F经历介导膜融合的大量构象变化，以融合后构象的F蛋白收场（Calder，etal.2000.Virology271:122-131;McLellan，etal.2013.Science340:1113_1117;McLellan，etal.2011.JVirol85:7788-7796;Swanson，etal.2011.Proc.Nat，lAcad.Sci.U.S.A.108:9619-9624〇RSVF蛋白在副粘病毒中是值得注意的，在于对触发高度易感且能容易地过早触发，这可能促成RSV感染性的显著不稳定性。还有证据显示感染细胞中积累的RSVF蛋白多是构象上异质的，这可以起降低病毒中和性抗体的诱导的诱t耳的作用（Sakurai，etal.1999.JVirol73:2956-2962。因此，出于超过一个原因表达稳定化构象的RSVF会是有利的。[0545]最近记载了稳定的融合后形式的RSVFMcLellan，etal.2011.JVirol85:7788-7796;Swanson，etal.2011.Proc.Nat’IAcad.Sci·υ·S·A.108:9619-9624。这种稳定的融合后形式是通过截短疏水性融合肽和去除C端跨膜域TM和胞质尾CT而重组生成的（Ruiz-ArguelIo，etal.2004JGeneralVirology85:3677-3687。由于缺少TM和CT，这种融合后形式不会是膜锚定的且会是分泌的。融合后形式的RSVF显示出在小鼠中是免疫原性的且保护性的（Swanson，etal·2011·Proc·Nat’IAcad.Sci.U.S.A.108:9619-96¾〇[0546]然而，认为融合前形式的RSVF的免疫原性比融合后形式高得多（McLellan，etal.2013.Science340:1113-1117。这是基于康复期动物和人血清中的绝大部分中和活性是由不结合融合后F蛋白且推测是对融合前形式特异性的抗体赋予的观察结果McLellan，etaI.20I3.Science340:11I3-11I7；Magrο,etal.2012.ProcNat'IAcad.Sci.U.S.A.109:3089-3094。最近测定了融合前形式的RSVF的结构，而且经由基于结构的突变来稳定化这种融合前构象成为可能:这些之一涉及引入二硫键DS，且另一涉及三聚体结构中的预测空腔中的氨基酸替代（Cavl，而且这些的组合称作DS-CavlMcLellan，etal_2013.Science342:592-598。在小鼠和短尾恒河猴macaques中作为亚基疫苗评估了重组DS和DS-Cavl形式的RSVF蛋白，而且显示出诱导比融合后形式显著更高水平的RSV中和性血清抗体，其中DS-Cavl形式的免疫原性比DS形式要高McLellan，etal·2013·Science342:592-598〇[0547]评估了当自活减毒rBHPIV3载体表达时融合后和融合前形式的RSVF的免疫原性。将具有HEK指派的融合后和稳定化的融合前形式DS和DS-Cavl的RSVF进行GA密码子优化并插入rBHPIV3载体的第2基因组位置（图11。将这些与HEKGA-opt以及删除了CT和TM，留下外域的含有HEK的，GA优化的F蛋白的一种型式Ecto比较（图11。还将这些构建物与non-HEKnon-opt构建物比较。[0548]图11中呈现的数据和后续实验中使用了GA优化的F0RF。在一些情况中构建了具有GS优化的ORF的平行构建物（见图35，但是有待评估。鉴于GS优化的ORF的卓越表达（图5，GS优化型式可能更具免疫原性和保护性。还有，为了简要，有时自图11和后续图中的和后续正文中的构建物名称省略标识符“HEK”和“GA-opt”，但是图中指示了这些特征的存在即“所有上述型式的RSVF是HEK，GA优化的”，图11。[0549]挽救具有这些各式各样形式的RSVF的载体，并使每一种在体外生长至较高的，相似的滴度（图12。这些一般就生长动力学和终产量而言与空rBHPIV3载体相比略微减毒，正如先前对其它载体构建物注意到的见图7。[0550]在感染有各种构建物的Vero和LLC-MK2细胞中评估了各种形式的RSVF蛋白的表达效率（图13A和B。感染后48小时收获感染细胞培养物并通过Western印迹进行分析。正如预期的，天然形式的RSVF即HEKGA-opt是细胞相关的。发现融合后和Ecto形式是分泌的以及细胞相关的。融合后F的分泌一致地比Ecto形式更加有效:后者可能更多地保持细胞相关的，因为它含有更高含量的疏水性序列。出乎意料地，DS和DS-Cavl形式的F更加有效地表达（图13B。既然这些病毒以相似的动力学复制且既然ORF是相似GA优化的，那么这种表达升高很可能反映DS和DS-Cavl形式升高的蛋白稳定性。蛋白质工程能实质性影响糖蛋白的表达，加工，和稳定性，而且常常是负面方式，因此通过这种活载体有效表达DS和DS-Cavl是一项不能可靠预测的本质特性。[0551]在仓鼠中评估了这些载体的体内复制（图14。在鼻甲中，所有具有RSVF插入物的载体适度地比空载体减毒更多（图14A。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较:对于空载体，这些值是相当的，而对于携带RSVF的载体，第5天滴度比第3天滴度要高，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。具有融合后F的载体复制至比具有其它形式的F的载体更高的滴度，而具有融合前F的载体DS复制至更低的滴度，这可能代表实验变异性或可能代表对载体复制的可信全异影响。在肺中，所有具有RSVF插入物的载体比空载体减毒实质性更多（图14B。与鼻甲一致，具有融合后F的载体在肺中也复制至比其它载体有点更高的滴度，而表达融合前DS型式的载体表现出减毒有点更多。RSV对照它是完全野生型病毒比表达RSVF的减毒rBHPIV3载体更加有效地复制；例如，wtRSV在鼻甲和肺中分别复制至比表达融合前DSF的载体要高100和1〇〇〇倍的滴度。通过60%噬斑减少测定法测定了RSV中和性血清抗体滴度。这是以两种方式实施的：（i在添加的补体存在下这是通常的实践，正如图9中早就显示的），和（ii在添加的补体缺失下（分别为图15A和B。添加的补体的存在提供病毒特异性抗体的最灵敏检测，因为补体潜在地对所有结合至病毒粒体的抗体赋予病毒裂解能力，而且还能发挥位阻效应Yoderetal2004JMedVirol72:688-694。与之对比，补体不依赖性中和测定法会只检测在不涉及补体蛋白的病毒裂解功能或位阻效应的情况下能够中和RSV的高质量中和性抗体。已经提出“在没有补体的情况下实施的中和测定法可能最能反映呼吸道中的生理学条件”（Yoderetal2004JMedVirol72:688-694。在含有补体的测定法中（图15A，具有融合后F的载体在各载体中免疫原性较差，尽管它在仓鼠中复制至最高滴度;而具有融合前DSF的载体在所测试的载体中免疫原性最高，尽管它减毒最多。在补体不依赖性测定法中（图15B，在各载体中，只有表达融合前DSF的载体诱导高滴度的中和性抗体。具有未修饰，融合后，或EctoF的其它载体无一有效诱导高质量中和性抗体。wtRSV对照有效诱导在含有补体和不依赖于补体的测定法二者中均为中和性的抗体。引人注目地，具有融合前DSF的载体在诱导高质量RSV中和性抗体方面在统计学上与wtRSV相似（图15B。这是值得注意的，因为这种减毒载体的复制效率比非减毒wtRSV低100至1000倍，而且由wtRSV赋予的中和性活性具有另外的来自RSVG蛋白的贡献。这提示表达融合前DS形式的RSVF的载体在诱导非常有效的中和性抗体方面是非常有力的且高免疫原性的。[0552]为了评估这些载体的保护功效，免疫接种后30天通过鼻内感染IO6PfuwtRSV每只动物攻击来自图15中的实验的免疫接种仓鼠。感染后3天处死动物，收获鼻甲和肺，并加工成通过噬斑滴定测定的组织匀浆物（图16。在鼻甲中（图16A，表达non-HEKnon-optF，或HEKGA-opt，或EctoF的构建物赋予适度水平的保护，而融合后F和尤其是融合前DSF是有点更高保护性的。在肺中（图16B，所有载体构建物提供针对RSV攻击的实质性保护，除了融合后形式，它赋予最少的保护（图16BRSV对照提供鼻甲中接近完全的保护和肺中完全的保护;然而，正如早就注意到的，在表达所有RSV蛋白作为细胞免疫的潜在抗原，以及高至1000倍更加有效地复制以外，wtRSV具有表达F和G中和抗原二者的优势（图14。[0553]将Cav-I突变添加至DS构建物提供升高的免疫原性作为亚基疫苗McLelIan，etal.2013.Science342:592-598，而且预期进一步增强自病毒载体表达的融合前RSVF的免疫原性。还有，DS和DS-Cavl形式的RSVF有待在提供最大表达升高的GS优化的背景中评估免疫原性和保护功效（图5和6。已经构建并回收了这些进一步的构建物，并制备成工作池（workingpool图35。[0554]通过推动RSVF蛋白掺入rBHPIV3载体的病毒粒体颗粒来增强它的免疫原性。抗原掺入病毒样颗粒VLP或腺伴随病毒颗粒已经显示出提高它们的免疫原性Rybniker，etal.2012.JVirol86:13800-13804;McGinnes，etal.2011.JVirol85:366-377。但是不清楚异源抗原掺入感染性病毒的病毒包膜是否能增强它的免疫原性。当由rBHPIV3表达时，天然RSVF蛋白（即HEKGA-opt仅仅以痕量掺入载体颗粒见下文）。[0555]Zimmer等人的一项在先研究（ZimmeretalJVirol200579:10467-77评估了来自仙台病毒中添加的基因的RSVF蛋白的表达，仙台病毒是HPIVl的鼠亲戚而且还与HPIV3密切相关。该研究显示，就像rBHPIV3，很少的RSVF蛋白掺入仙台病毒载体颗粒。调查人员将RSVF蛋白的CT或CT加TM用来自仙台F蛋白的对应序列替换，前提是这会改善外来RSVF蛋白与载体颗粒相互作用的效率。这些修饰确实提高工程化RSVF掺入仙台颗粒，但是仅在仙台F蛋白基因删除的情况中。该删除载体F蛋白的要求在本研究中会是不想要的，因为自rBHPIV3删除载体F蛋白会具有实质性改变它的复制特性的可能，尤其是在体内，而且还会去除HPIV3保护性抗原之一。[0556]尽管有这种清楚的先例指示这种策略会是不合适的，还是生成了如下rBHPIV3构建物，其中RSVF蛋白的CT或CT加TM用载体PIVF蛋白的替换分别产生称作B3CT和B3TMCT的构建物，图17。来自rBHPIV3的TM和CT区的长度分别为21和26个氨基酸。本研究中的构建是用在天然F蛋白中含有HEK指派和GA优化的F蛋白的型式HEKGA-opt，还有用融合前DS和DS-Cavl形式进行（图17。（使用GA优化F0RF。所有嵌合F基因插入rBHPIV3的第2位置，用于与上文描述的构建物直接比较。[0557]所有病毒容易通过反求遗传学来回收。为了对RSVF和它的修饰衍生物的包装效率定量，制备蔗糖纯化的病毒，用于Western印迹分析以测定颗粒中RSVF的量图18。将等量的每一种蔗糖纯化原种（〇.5ug蛋白质每份样品）提交变性，还原性凝胶电泳并通过Western印迹进行分析。这显示非嵌合F蛋白（来自HEKGA-opt相对较差地掺入rBHPIV3病毒粒体（图18，2道）。然而，B3CT和B3TMCT修饰将掺入效率剧烈增强19至20倍（图18，3和4道）。确实，当与等蛋白质量的wtRSV病毒粒体（图18,5道相比时，载体颗粒中掺入的B3CT和B3TMCTF蛋白的量看来与RSV颗粒中天然F的量相等。对具有B3CT或B3TMCT的嵌合融合前DS形式的RSVF也观察到类似增强的包装效率（图18,6和7道）。因而，RSVFB3CT和B3TMCT进入rBHPIV3载体的有效包装不要求删除载体F蛋白，且因而显著不同于仙台先例。[0558]还使用RSV特异性抗体和免疫金标记用透射电子显微术TEM检查了RSVF的包装图19A-FeSV颗粒的表面上的RSVF刺突得到标记（图19A，而在空rBHPIV3载体的表面上无法观察到标记（图19B。在载体包膜中检测到非常有限的天然RSVF的标记（图19C，与图18中的结果一致，其显示通过Western印迹分析在纯化的rBHPIV3病毒粒体中检测到很少的天然F。与之对比，表达具有B3CT或B3TMCT的嵌合F的载体显示增强的标记（图19D和E，指示这些嵌合形式有效包装入载体包膜。同样地，具有B3TMCT的融合前DSRSVF也有效包装入载体颗粒（图19F。这确认了B3CT和B3TMCT修饰导致RSVF掺入rBHPIV3颗粒剧烈升高。另外，这显示掺入的RSVF蛋白存在于外观与可信RSV颗粒相似的免疫学活性表面刺突中。而且，稳定化的融合前DSF蛋白还有效出现于病毒粒体表面。[0559]RSVFB3CT和B3TMCT进入载体颗粒的高包装效率提出了这对于载体复制会是削弱性的可能性，因为一般假设病毒粒体表面出于效率是有组织的且在它的容量方面限于表面蛋白，所以表面蛋白的组成的变化会是削弱性的，尤其因为已修饰的B3CT和B3TMCTRSVF蛋白含有认为与内部病毒蛋白相互作用的载体F蛋白的CT或TMCT区。例如，RSVF有效掺入载体包膜可能置换载体HN和F糖蛋白，或者可能干扰各载体成分之间诸如病毒粒体装配期间载体F和HN糖蛋白和内部M蛋白之间，或必须相互作用以有效起始病毒进入的载体F和HN蛋白之间）的相互作用。令人惊讶地，发现所有携带RSVFB3CT和B3TMCT的载体在体外有效复制至与具有在TM和CT方面未修饰的RSVF蛋白的载体HEKGA-opt，图20无法区分的高滴度。因而，没有证据显示RSVF掺入载体颗粒升高导致体外复制有任何降低。这是重要的，因为载体的有效体外复制对于有效疫苗制造和临床评估会是本质性的。它还提不尚惨入效率不会对使RSVF表达沉默的突变设置强选择压力。[0560]通过Western印迹检查了嵌合形式的RSVF通过rBHPIV3载体的细胞内表达。这是在感染后48小时收获的Vero细胞中评估的（图21。有趣的是，B3CT和B3TMCT型式的F均有效表达，而且确实表现出比天然FS卩HEKGA-opt略微更加有效地表达（图21A。另外，DS或DS-Cavl修饰表现出进一步提高表达（图21B，正如在先注意到的（图13B。这些作用看来是叠加的，因为具有B3CT或B3TMCT的DS或DS-Cavl构建物甚至比单独具有DS或DS-Cavl的构建物更加有效地表达。这种升高的表达对于疫苗目的会是有利的，因为它提供更高水平的抗原。正如注意到的，蛋白质工程和域交换具有负面影响糖蛋白的表达，加工，和稳定性的可能，因而这些具有DS，DS-Cavl，B3CT，和B3TMCT修饰的糖蛋白通过这种活载体的有效表达是一种无法可靠预测的特性。[0561]测定了这些构建物在Vero细胞中诱导合胞体形成的能力。出乎意料地，携带B3CT替代的RSVF展现高融合原性表型，而携带B3TMCT替代的RSVF在低融合原性方面类似天然F例如HEKGA-opt图22;还见图3。一旦延长温育，B3TMCT确实在细胞单层中诱导合胞体形成，指示它仍然是功能性的且因而是构象上完整的。这些发现提示，在B3CT和B3TMCT构建物之间，后者会是优选的，因为广泛的合胞体形成和所致细胞病理学可能通过过早破坏细胞基质而在体外和在体内降低载体生成，而且还可能由于过早触发而干扰感染性的稳定性。融合前DS形式无一在细胞单层中诱导合胞体。这是完全出乎意料的，因为稳定化型式的融合前F蛋白经历介导融合所需要的大量构象变化的能力应当更低。这些发现提示融合前DS形式的RSVF确实在载体感染细胞的背景中得到实质性稳定化。[0562]通过鼻内感染在仓鼠中检查了表达B3CT和B3TMCTRSVF构建物的载体的复制（图23。具有非HEK非优化的Fnon-HEKnon-opt或HEK和GA优化的FHEKGA-opt的载体在鼻甲中与空rBHPIV3载体相比有点减毒更多，说明插入物的减毒作用。与空载体相比升高的减毒显现为病毒脱落的值更低。它还显现为第3天和第5天滴度的比较:对于空载体，这些值是相当的，而对于携带RSVF的载体，第3天滴度比第5天滴度要低，指示这些构建物实现它们的最大滴度需要更久。表达B3CT，或B3TMCT，或具有B3CTDSB3CT或B3TMCTDSB3TMCT的融合前FDS的载体在鼻甲中减毒实质性而且在大多数情况中显著更多（图23A。这很可能反映RSVF蛋白掺入载体颗粒的减毒作用:在体外没有观察到这种减毒作用（图20。在肺中，所有表达RSVF的载体与空载体相比减毒实质性更多（图23B。引人注目的是，高融合原性B3CT构建物在鼻甲和肺二者中比平行稳定化DSB3CT构建物减毒显著更多，提示融合升高在这些条件下在体内确实是减毒性的（即干扰复制）。如果这在半允许性宿主诸如仓鼠中是明显的，那么它在人宿主中可能实质性更加突出。与减毒载体相比，非减毒WtRSVA2对照在鼻甲中复制至高100至1000倍的滴度，而在肺中复制至高1000至1〇,〇〇〇倍的滴度。[0563]通过在添加的补体存在或缺失下使用60%噬斑减少测定法对仓鼠血清分析RSV中和性抗体，测定了载体的免疫原性分别为图24A和B。所有表达具有B3CT或B3TMCT修饰的F蛋白的构建物诱导在补体存在下检测的RSV中和性血清抗体的实质性滴度（图24A。组合B3CT或B3TMCT与融合前DS突变的构建物给出与没有DS突变的平行构建物相比有点更高水平的中和性抗体。当在补体存在下测定时（图24A，所有减毒载体构建物诱导与非减毒wtRSV相比更低滴度的RSV中和性抗体，尽管正如注意到的，wtRSV具有G中和抗原的进一步贡献和复制效率比减毒载体高100至10,〇〇〇倍的优势。[0564]在没有补体的情况下实施的测定法的型式中（图24B，三种载体有效诱导在这些条件下检测的RSV中和性抗体，即表达B3TMCTF的载体和表达含有B3CT和B3TMCT修饰的融合前DSF的载体。B3TMCT和DSB3TMCT构建物诱导比wtRSV有点更多的高质量RSV中和性血清抗体，尽管这种差异不显著。不过，鉴于这些载体只表达两种RSV中和性抗原之一且复制效率与wtRSV相比低10至10,000倍，这一发现是值得注意的（图22。与B3TMCT载体形成对比，B3CT当在补体缺失下测定时没有诱导显著的抗体应答（图24B，尽管它以与B3TMCT相似的效率掺入病毒粒体（图18。类似地，DSB3CT的免疫原性也比B3TMCT，DS低（图24B。这指示B3TMCT可能是结构上或抗原上与B3CT相比卓越的RSVF形式，或者可能是B3CT的高融合原性表型在体内降低它的表达和免疫原性。这些研究清楚地显示B3TMCT大大增强RSVF的免疫原性。[0565]为了评估载体的保护功效，免疫接种后30天用IO6PfuwtRSV鼻内攻击免疫接种仓鼠（图25。与免疫原性数据一致，B3CT在鼻甲和肺二者中的保护性均更低。B3TMCT针对RSV攻击更具保护性，而且DSB3TMCT是载体构建物中保护性最高的（尽管差异较小），只有一只免疫接种仓鼠显示鼻甲中可检测的RSV复制且均在肺中得到完全保护，提供与非减毒wtRSV对照所赋予相似的保护（图24ASB3TMCT构建物和wtRSV之间相当水平的保护功效是特别引人注目的，因为后者复制至比DSB3TMCT高2-4个log的滴度，表达F和GRSV中和抗原二者，且表达所有RSV蛋白作为细胞免疫的潜在抗原。这指示具有包装的融合前形式的RSVF的rBHPIV3载体DSB3TMCT具有很高的免疫原性和保护性。[0566]rBHPIV3-RSV-F构建物在仓鼠中的稳定性。鉴于MEDI-534在临床研究中的遗传不稳定性的经验Yangetal2013Vaccine31:2822-2827，关键问题是RSVF插入物的表达是否在体内复制期间保持稳定。测定了已经在图8,14,和23中的仓鼠中进行了分析的所有12种不同rBHPIV3-RSV-F构建物的遗传稳定性。通过能同时检测病毒噬斑中RSVF蛋白和载体蛋白的表达的荧光双重染色噬斑测定法来分析感染后第3和5天收集的肺和鼻甲的组织匀浆物（图26。在这种测定法中，用以红色荧光显现的F特异性抗体检测RSVF表达，并用以绿色荧光显现的HPIV3特异性抗血清（来自用纯化的HPIV3病毒粒体超免疫的家兔检测PIV3抗原的表达。当合并时，维持RSVF表达的rBHPIV3噬斑表现为黄色，而丧失RSVF插入物表达的那些保持绿色（图26。这项分析显示，RSVF插入物在仓鼠中复制期间一般是稳定的（图26。对于大多数样品，较高稀释度孔其中能辨别个别噬斑）中所有回收的病毒表现为黄色斑，且因而表达RSVF蛋白。在其它标本的一个子集中，斑的一个子集中有RSVF表达的零星丧失，产生小百分比的绿色噬斑通常〈12%。另外，没有证据显示RSVF表达的丧失随时间逐渐增加;换言之，来自第5天的标本上表达的丧失频率与第3天相比没有更高。在一种情况中，在来自第3天的一份鼻甲标本中有高水平的表达丧失（14%剩余表达，#9组中的#511仓鼠），而来自相同动物的肺标本具有100%表达。一般而言，这指示RSVF插入物的表达对于所有测试的构建物是实质性稳定的。它还显示构建物无一表现为不成比例地不稳定的。因而，高水平的RSVF表达和合胞体形成，或稳定化形式的RSV的表达，或高水平的已修饰F掺入对于rBHPIV3载体是减毒性的载体颗粒没有表现为有利于RSVF表达沉默的突变体的出现。[0567]对图1-26中描述和评估的12种rBHPIV3构建物进一步评估可能的温度敏感性表型。对于每一种载体，使相等的小样于32，35，36，37，38，39，和40°C在甲基纤维素下形成噬斑（图27。彡100倍的噬斑形成减少指示该温度处的温度敏感性。空rBHPIV3载体在40°C是温度敏感性的（图27，而HPIV3和BPIV3无一在这个温度是温度敏感性的。这指示嵌合化（即将HPIV3F和HN基因替换入BPIV3主链赋予轻微的温度敏感性表型。每一种另外含有RSVF插入物的载体在37-38°C是温度敏感性的，指示另外的基因的存在提升温度敏感性表型。最ts的构建物是B3CT，B3TMCT，和DSB3CT图27中的#7，8，12。这暗示RSVF包装入病毒颗粒提示这种表型。一种可能的解释会是载体中RSVF的存在使得颗粒有点不稳定且对升高的温度易感。具有RSVF的有效包装的其余构建物，S卩DSB3TMCT图27中的构建物13是略微更低温度敏感性的，提示与DS和B3TMCT相关的低融合原性表型一定程度地改善不稳定性。总之，这些发现提供一种手段来赋予减毒或减轻减毒，这取决于构建物设计，而且无论如何提供在设计疫苗病毒中重要的信息。[0568]恒河猴中选定rBHPIV3-RSV-F构建物的评估。为了进一步调查“DS”和“B3TMCT”突变对载体复制，免疫原性，和保护功效的影响，在恒河猴中对两种候选HEKGA-optDS和HEKGA-〇ptDSB3TMCT评估复制和免疫原性（图28。包括具有未修饰RSVF的BHPIV3载体non-HEKnon-opt作为比较的基线对照。鉴于灵长动物中的研究的花费和伦理考虑，评估了有限数目的构建物。通过组合的IN和气管内（IT路径对猴免疫接种总共2X106TCID50每一种rBHPIV3载体。在指示日（图29收集鼻咽拭样和气管灌洗样品以监测病毒脱落作为复制的测量。在第〇，14,21，和28天收集血清。在第28天以IO6Pfu每个部位用wtRSVIN和IT攻击所有动物，并在第35和56天收集血清样品。[0569]non-HEKnon-opt和HEKGA-optDS病毒在上和下呼吸道中复制至大约IO5和IO3TCID5q单位每ml的峰滴度分别为图29A和B。与之对比，HEKGA-〇ptDSB3TMCT构建物在恒河猴的上和下呼吸道二者中剧烈更多减毒（图29A和B。这指示B3TMCT对rBHPIV3构建物赋予实质性减毒，而DS突变没有表现出赋予显著减毒。因而，B3TMCT修饰在仓鼠中赋予减毒的温和趋势（图23在非人灵长动物中实质性更大。[0570]正如注意到的，在第0，14，21，28，35，和56天收集血清。通过针对HPIV3的60%噬斑减少测定法分析对rBHPIV3载体特异性的血清抗体（图30。这显示针对高度减毒的HEKGA-〇ptDSB3TMCT构建物的载体特异性中和性血清抗体应答与non-HEKnon-opt和HEKGA-optDS构建物相比更慢且有点降低。这与降低的抗原负载会降低免疫原性的预期一致。在28天后滴度变得更加相似，而且正如预期的，没有来自第28天的RSV攻击的载体特异性免疫的加强（因为RSV不含任何载体抗原）。[0571]通过在补体存在和缺失下实施的噬斑减少测定法对RSV特异性中和性血清抗体应答定量分别为图31和32。在补体存在下的测定法显示响应HEKGA-〇ptDSB3TMCT构建物的RSV中和性血清抗体诱导比其它两种构建物更加快速且达到显著更高的滴度图31ASV特异性中和性血清抗体的这种更大诱导是引人注目且令人惊讶的，因为这种构建物在复制方面受限制高得多（图29。当先前在仓鼠中测定时（图24，这种构建物给出与HEKGA-optDS相比并非统计上显著的明显升高:在非人灵长动物中观察到的更大升高与仓鼠模型是这些人和牛人病毒的较低敏感性模型的观念一致。例如，当在第28天在补体缺失下实施测定法以测量高质量抗体时也观察到恒河猴中响应HEKGA-〇ptDSB3TMCT构建物的RSV中和性血清抗体的更大诱导：确实，这种构建物较之其它两种构建物的滴度差异比在补体存在下观察到的实质性更大（图32。总之，这些结果指示DS突变没有实质性提高RSV中和性血清抗体的数量（图31但确实提高质量（图32，而进一步添加B3TMCT修饰剧烈提高RSV中和性血清抗体的数量图31和质量图32二者。[0572]第28天施用的RSV攻击病毒受到所有载体的完全限制，而且未能自来自任何动物的鼻咽拭样和气管灌洗样品回收到感染性攻击RSV，因此这项实验没有提供这些病毒的比较特性的进一步信息。有时观察到实验动物中针对短期RSV攻击的完全保护，因为这些模型中RSV复制的半允许性性质推动复制的限制。RSV特异性抗体应答在第28天后继续升高，但是不清楚这种应答是否是由于首要感染或攻击。[0573]使用荧光双重染色噬斑测定法对在第4,5,和6天峰脱落的时间）自恒河猴回收的病毒分析RSVF蛋白的表达。数据的汇总显示于图33。这项分析显示RSVF插入物在猴中复制期间一般是稳定的。结果与图26中关于仓鼠研究显示的那些非常相似。对于大多数来自恒河猴的样品，几乎所有回收的病毒表现为黄色噬斑且因而表达RSVF蛋白。有些标本中有RSVF表达的零星丧失，典型的是给定标本中〈10%回收的噬斑。没有证据显示表达丧失随时间显著升高，而且有时在早期时间点观察到表达丧失的证据，但是在来自相同动物的较晚时间点没有。也没有证据显示特定构建物与较之另一种构建物不成比例的更大RSVF表达丧失相关。例如，尽管HEKGA-〇ptB3TMCT的表达对于rBHPIV3载体是高度减毒性的，然而没有证据显示RSVF表达丧失的病毒的选择升高。[0574]还生成了表达具有GenScriptGS优化且含有HEK指派和DS-Cavl修饰的RSVF外域氨基酸1-513,缺少TM和CTi或的rBHPIV3载体。将外域融合至4个氨基酸的接头，接着是在它C端的三聚体稳定化折叠子序列，即构建物#19HEKGS-〇ptDS-Cavl[l-513]折叠子）。先前在小鼠和恒河猴中作为亚基疫苗评估了这种形式的融合前RSVFMcLellan，etal.2013.Science342:592-598。这种RSVF蛋白应当作为部分分泌形式表达，类似构建物#8HEKGA-optEcto，但是具有下述改善，S卩GS优化所致更加有效的翻译，DS-Cavl修饰所致更好的免疫原性，和折叠子稳定化域所致更大的三聚体稳定性。可以使用这种构建物来比较分泌DS-Cavl形式与膜锚定形式，S卩#16HEKGS-optDS-Cavl和病毒粒体掺入形式，SP#18HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT相比的免疫原性如何。[0575]来自这项研究的点：（1仓鼠模型，虽然方便，但是可能对各种构建物的复制，表达，和免疫原性的变化有点不敏感性，而且可能的情况是与这些构建物相关的效果诸如减毒和免疫原性在这些疫苗构建物意图的人宿主中会实质性更大。例如，虽然HEKGA-optDSB3TMCT构建物中B3TMCT修饰的存在在仓鼠模型中只赋予减毒的适度升高（图23，但是它在与可信的人宿主更加密切相关的恒河猴中减毒实质性更多（图29。而且，HEKGA-optDSB3TMCT和其它构建物之间对于RSV中和性抗体的免疫原性的差异在恒河猴中（图31比在仓鼠中（图24实质性更大，尽管该构建物在恒河猴中减毒实质性更多（图29。因而，内在免疫原性每PfuHEKGA-〇ptDSB3TMCT表现为在恒河猴中比在仓鼠中大得多，且因而可能类似地在人中更大。在仓鼠中的这种明显不敏感性可能解释了例如为什么仓鼠模型没有可靠地提供与RSVF表达升高16倍相关的免疫原性差异（图9。还应当注意的是为了人使用的密码子优化可能不为仓鼠中的表达提供与灵长动物细胞和人疫苗接种者相比相当的升高，这可能有助于与灵长动物相比降低在仓鼠模型中的免疫原性。（2另一个主题是降低由RSVF诱导的合胞体形成的量的合意性。在体外，合胞体形成没有表现出限制单层培养物中的复制，尽管可能的是它可能变成用于制造的微载体细胞培养物系统中的一个因素，因此控制合胞体形成看来是谨慎的。对于大多数构建物，存在HEK指派，它们强烈遏制合胞体形成。像HEK指派一样，DS和DS-Cavl构建物也强烈遏制合胞体形成且因而提供出乎意料的好处。一种与合胞体形成上调相关的构建物，即HEKGA-〇ptB3CT，确实在仓鼠中展现降低的复制（图23和免疫原性（图24，给出合胞体形成升高在体内可能是有害的指示。这在灵长动物宿主中可能更加突出。因此，GS-opt，HEK，DS或DS-Cavl，和B3TMCT的组合鉴定为在合胞体形成的两种遏制物的背景中（HEK和DS-Cavl，及在并非高融合原性的包装信号存在下B3TMCT会给出最高水平的RSVF表达的组合（由于HEK加GS-opt，加表现为提供升高的F蛋白积累的融合前F蛋白稳定化）。（3两种特征（S卩B3TMCT和DS突变独立地与高质量RSV中和性血清抗体的实质性诱导相关。恒河猴研究提示B3TMCT在与人中的预期疫苗性能有关的灵长动物宿主中是这两个因素中更加重要的（图32。重要的是，B3TMCT修饰还剧烈提高RSV中和性血清抗体应答的数量（图31。（4出乎意料地且幸运地，当通过双重免疫荧光测定法评估时，改善RSVF表达和包装的特征没有表现为赋予针对RSVF表达丧失的显著选择压力。正如早就注意到的，RSVF插入物表达丧失是MEDI-534的一个问题，但是在本研究中采用MEDI-534中没有采用的许多特征来下调融合，而且这可能在稳定化RSVF插入物中发挥主要作用。另外，通过评估包装信号的两个交叠集合，有可能鉴定并避免具有高融合原性的包装信号，及鉴定并选择具有实质性降低的融合的包装信号。（5特别是，B3TMCT修饰作为提高免疫原性的一个重要因素出现。HEK，GA-〇pt或GS-opt，和DS或DS-Cavl修饰作为次要改善出现。正如注意到的，B3TMCT具有在恒河猴中强烈减毒载体的作用。在高度减毒的rBHPIV3载体的背景中使用这种修饰产生表现为实质性过减毒的载体。然而，使用反求遗传学，B3TMCTF蛋白（在需要时，具有HEK，加GA-或GS-opt，加DS或DS-Cavl修饰可以与减毒较少的载体主链，诸如携带一处或多处已知的稳定化减毒突变的野生型HPIVl，2,或3或型式组合以创建减毒较少的构建物。既然rBHPIV3中的B3TMCT构建物具有很高的免疫原性，尽管是非常过减毒的，那么复制好10至100倍的表达这种蛋白的构建物应当是恰当减毒的且实质性更高免疫原性的。[0576]表达已修饰型式的RSVFORF和蛋白质的重组rBHPIV3载体的另外的测定法。[0577]实施了另外的测定法来评估：（i包括DS融合前稳定化突变和B3TMCT包装信号的GS-opt型式的构建物，和（ii包括两处空腔填充突变S190F和V270L与DS突变的组合的DS-Cavl融合前稳定化突变。所测定的F蛋白还含有两处HEK氨基酸指派，它们产生与上文描述的A2株的早期传代称作HEK-7的氨基酸序列同一的氨基酸序列。这些测定法显示：[0578]I.DS-Cavl和B3TMCT独立赋予诱导显著水平的补体不依赖性RSV中和性抗体认为与体内保护最有关的能力。[0579]2.DS-Cavl加B3TMCT的组合给出免疫原性的进一步升高。[0580]3.两种最高免疫原性的构建物是HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT图53，#7组）和HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组），区别仅在于密码子优化的来源，其中GS-opt表现为最高免疫原性。[0581]4·虽然HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT#7组）和HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT图53，#10组在成对比较中并非统计上可区分的，但是后者的免疫原性比wtRSV显著更高。这些发现显示HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组是仓鼠模型中免疫原性最高的构建物，特别是对于在不需要添加补体的情况下检测的高度有效的中和性抗体（图53，而且因而GS-opt和DS-Cavl的进一步修饰表现出提高免疫原性。这也是仓鼠攻击研究中保护性最高的构建物。[0582]5.rBHPIV3载体获取赋予大噬斑表型和减毒的突变的倾向通过载体HN蛋白中的三处核苷酸和两处氨基酸突变得到本质上消除。[0583]6.自第一基因位置N前表达HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT插入物，产生的构建物在Vero细胞中有效复制，能在具有高百分比的RSVF表达的制备物中获得，且有效表达RSVF蛋白。[0584]动物研究的汇总。如指示的，图35指示已经在仓鼠中的两项不同研究和恒河猴中的两项不同研究中评估的构建物：“第1仓鼠研究”涵盖图8-9，14-16，和23-26;“第INHP研究”涵盖图29-33;“第2仓鼠研究”涵盖图51-54;“第2NHP研究”涵盖图55和57。[0585]GA-opt病毒的体外多周期复制。图46和47图示与空载体相比，HEKGA-optDS-Cavl构建物自身或进一步添加B3TMCT包装信号的构建物（图35中的构建物#13和15的多周期复制。这是在非洲绿猴肾Vero细胞中（图46它是用于疫苗制造的细胞基质），及在恒河猴肾LLC-MK2细胞中⑻（它是一种常用实验室细胞系，与Vero细胞不同，它典型地通过病毒感染而诱导表达I型干扰素）进行的。这项实验显示两种含有DS-Cavl的构建物（有或无B3TMCT有效且彼此相似地复制，而且与空载体相比适度减毒。尽管有这种适度减毒，两种含有DS-Cavl的构建物均复制至比107TCID5Qml更高的滴度。这种适度减毒样式与用表达不同型式的RSVF的其它rBHPIV3载体获得的结果非常相似例如图7,12,和20。因而，这些结果显示携带这些已修饰插入物的rBHPIV3以完全满足疫苗制造的有效方式复制。[0586]GS-opt病毒的体外多周期复制。图48图示HEKGS-opt主链（图35中的构建物#5的多周期复制，与进一步添加DS-Cavl#16，DS-CavlB3TMCT的组合#18，和DS-Cavl，外域1-513,和促进外域寡聚化的C端“折叠子”域的组合#19的型式比较，与空载体比较。Vero图48A和LLC-MK2⑻细胞中的评估显示表达各种形式的RSVF的载体以非常相似的动力学和产率复制，而且与空载体相比适度减毒。它们在细胞培养物中均复制至比107TCID5QmL更高的滴度。这些结果显示携带这些已修饰插入物的rBHPIV3以完全满足疫苗制造的有效方式复制。[0587]GA-和GS-opt病毒的体外多周期复制。图49图示区别在于GA优化或GS优化的多对构建物的多周期复制：具体而言:HEKGS-optDS-Cavl较之HEKGA-optDS-Cavl顶部小图，分别为来自图35的构建物#16和13，和HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT较之HEKGA-optDS-CavlB3TMCT底部小图，分别为来自图35的构建物#18和15。在Vero图49A，C和LLC-MK2B，D细胞中评估两对构建物中每一个。GS-opt构建物有时复制比GA-opt构建物边缘性更加有效例如图49C和49D，尤其在第一次3-4天温育期间。[0588]体外RSVF表达。图50图示Vero和LLC-MK2细胞中RSVF和载体蛋白通过rBHPIV3构建物的表达。这比较通过册164-〇?以图50,2道；图35，构建物#3较之册163-〇?以图50，3道;图35,构建物5进行的表达:与实施例1图5中描述的结果一致，GS优化导致有点更高的RSVF蛋白表达。HEKGS-opt构建物还与另外含有DS-Cavl图50,3道；图35,构建物#16，或DS-CavlB3TMCT图50，5道；图35，构建物#18，或DS-CavlAl-513折叠子（图50，8道;图35,构建物#19的型式比较。比较还包括wtRSV感染的（图50,6道）或模拟感染的（7道细胞。结果显示每一种GS-opt构建物均指导RSVF的有效表达，而且确实表达比wtRSV多得多的RSVF图50，6道）。三种编码全长DS-CavlF蛋白的GS-opt构建物感染的细胞（图50，4，5，和8道具有有点更多的RSVF蛋白FO前体积累，提示它的融合前稳定化可能具有边缘性降低的切割效率。然而，一般而言，每一种构建物均非常有效地表达RSVF蛋白。融合前折叠子构建物，HEKGS-〇ptDS-CavVl-513折叠子（图50,8道），仅仅部分分泌入培养基（图50A，下部小图），而且分泌形式完全是已切割Fdl图4A，下部小图，8道），而所有细胞伴随形式是未切割Fo图4A，上部小图，B和C，8道）。在培养基上清液中没有检测到其它测试形式的RSVF，指示它们不分泌。DS-CavVl-513折叠子构建物的无效低效切割和分泌是出乎意料的，因为这种三聚化域先前已经成功用于制备纯化的F蛋白（McLellanetalScience2013Nov1;3426158:592-8.doi:10.1126science.l243283。这说明外来蛋白通过导向vectored构建物的表达可能是不可预测的，而本文中多种构建物的详细评估提供综合评估，导致多种合适，成功构建物的鉴定。[0589]仓鼠研究。在仓鼠中对多种含有B3TMCT，DS，和DS-Cavl的进一步添加的GA-opt和GS-opt构建物构建物在图35中标识为“第2仓鼠研究”）评估复制效率图51，RSVF蛋白表达稳定性，RSV中和性血清抗体刺激图52和53，和针对RSV攻击的保护功效图54。[0590]仓鼠中的复制。评估GA-opt和GS-opt构建物在仓鼠上鼻甲）和下肺呼吸道中的复制（图51。在鼻甲中，HEKGA-〇ptB3TMCT#5组和HEKGA-〇ptDSB3TMCT#6组）比其它更受限制。在肺中，具有B3TMCT的GA-opt构建物（HEKGA-〇ptB3TMCT，#5组，HEKGA-opt0583了]\0'，#6组，和冊164-^丨05-〇3¥183了]\«：1'，#7组）更受限制。类似地，具有83了]\0'的GS-opt构建物，即HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组）与比HEKGS-optDS-Cavl#9组减毒更多。这些观察结果提示B3TMCT提高减毒水平。另外，GA-opt构建物表现为比GS-opt构建物减毒更多。例如，DS-Cavl和DS-CavlB3TMCT的GS-opt构建物，即HEKGS-optDS-Cavl#9组）和HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组）在LRT中复制至5.0和4.21^^1。1'：1〇5。^的均值峰滴度，比等同GA-opt构建物的均值滴度，S卩4.0和3.4L〇g1QTCID5Qg#4和7组更高。这提示GS-optRSVF插入物比GA-optRSVF减毒更少。[0591]RSVF蛋白的表达的稳定性。通过分析免疫接种后第5天收获的免疫接种仓鼠的鼻甲和肺样品用双重染色噬斑测定法评估它们体内复制期间通过rBHPIV3载体的RSVF表达的稳定性。大多数样品（107份中的92份具有超过90%的复制载体仍然表达RSVF;107份中的6份具有89-80%的载体表达RSVF;107份中的9份具有少于79%的复制载体表达RSVF;仅7份样品具有50%的载体丧失RSVF表达。在有50%载体丧失RSVF表达的这7份样品中，4份是GA-opt构建物，3份是GS-opt构建物。没有证据显示GA-opt，或GS-opt，或DS，或DS-Cavl，或TMCT与不稳定性的任何特定升高相关。很可能的是个别制备物间不同水平的不稳定性反映很大程度上不依赖于具体构建物的零星突变，且因而每一种构建物的数份独立制备物的评估很可能会鉴定具有很高百分比的RSVF蛋白表达的一份或多份。[0592]RSV中和性血清抗体的滴度。在添加豚鼠补体下（图52或在补体缺失下（图53通过RSV中和测定法测定RSV中和性血清抗体滴度。在添加补体下实施的测定法常常用于RSV和HPIV3中和测定法，因为它容许灵敏检测病毒特异性抗体，因为补体能对在其它情况下在体外可能不是中和性的抗体赋予病毒裂解和空间位阻能力（YoderetalJMedVirol72:688-694，2004。与之对比，已经提出在体外在补体缺失下中和RSV的抗体对于保护是最有关的（YoderetalJMedVirol72:688-694,2004，而且在之前的研究中已经与针对RSV攻击的更高水平的保护关联起来LiangetalJVirol89:9499-9510,2015。认为在体外不依赖于添加补体而中和的抗体是“高质量”的且指示性质上卓越的免疫原性。[0593]在补体依赖性测定法中（图52，所有表达RSVF的rBHPIV3载体诱导高滴度的RSV中和性抗体，除了免疫原性较差的HEKGS-〇ptDS-CaVl-513折叠子构建物。GS-opt构建物诱导比它们的GA-opt构建物对应物更高滴度的RSV血清中和性抗体#9组HEKGS-optDS-Cavl的11·OLog2PRNT6O对M组HEKGA-optDS-Cavl的10·2Log2PRNT6。；#10组HEKGS-optDS-CavlB3TMCT的11·8Log2PRNT6〇对#7组HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT的10.4L〇g2PRNT6Q。在补体依赖性测定法中（图52，引人注目的是，在统计上免疫原性与wtRSV黄金标准）一样的三种构建物是GS-opt构建物HEKGS-opt#8组），HEKGS-〇ptDS-Cavl#9组），和HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组）。[0594]在补体不依赖性测定法中（图53，表达天然形式的RSVF的载体non-HEKnon-opt和HEKGS-opt没有诱导可检测的RSV中和性抗体，确认并扩充来自实施例1的结果。融合前稳定化突变DS，DS-Cavl和包装信号B3TMCT独立提高对于高质量RSV中和性抗体而言的免疫原性例如，在B3TMCT缺失下具有DS和或Cavl的构建物以#3，4，和9组例示，而在DSCav-I缺失下具有B3TMCT的构建物以#5组例示）。融合前稳定化突变加B3TMCT的组合具有免疫原性的叠加性改善，这是对GA-opt以及GS-opt构建物观察到的（例如#6，7，和10组）。在补体不依赖性测定法中，HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT构建物#10组诱导比任何其它载体所诱导的显著更高滴度的RSV中和性血清抗体7.6L〇g2PRNT6Q，除了它的GA-opt对应物HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT#7组），其诱导更低的滴度6.8Log2PRNT6Q但并非显著更低。然而，由HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT构建物（#10组），而非HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT#7组诱导的抗体滴度比wtRSV#12组）显著更高，且因此HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT构建物#10组是载体和wtRSV中对于高质量RSV中和性抗体而言免疫原性最高的。[0595]RSV攻击。用wtRSVIN攻击免疫接种仓鼠以评估保护功效（图54。正如图54中显示的，除了DS-CavlAl-513折叠子构建物，所有表达RSVF的载体在URT图54A和LRT图54B中诱导显著保护。DS-Cavl1-513折叠子缺少保护符合它在RSV血清中和测定法中显示的较差免疫原性（图52和53。与由wtRSV赋予的无菌免疫（sterileimmunity相比，HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT在所有测试载体中赋予最大保护且与wtRSV几乎等同：只有1只免疫接种这种载体的仓鼠具有可检测的wtRSV，而且仅仅在鼻甲中以很低的水平。在鼻甲中HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT#10组的保护功效与来自wtRSV#12组）的在统计上不可区分，而HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT#7组具有显著更低的保护性，支持前一种构建物是免疫原性最高的构建物的想法。在保护方面与wtRSV的这种等同是值得注意的，因为wtRSV表达两种中和抗原，G和F，而且还表达所有病毒蛋白作为细胞免疫的潜在抗原，而载体只表达RSVF蛋白。已经显示细胞免疫在啮齿动物中的RSV攻击研究中赋予有力保护例如ConnorsetalJVirol66:1277-1281,1992〇[0596]恒河猴中的评估。选择在仓鼠中具有最高免疫原性的三种载体来评估它们在恒河猴中的复制和免疫原性（图55。这些构建物包括HEKGA-〇ptDSB3TMCT图55的顶部处的构建物），它在第INHP研究中鉴定为特别有效（图28-32,实施例1中）。第二种构建物是HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT，它与第一种构建物相同，只是它具有DS-Cavl代替DS。第三种构建物是HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT，它与前面的构建物的区别在于具有GS-opt代替GA-opt。这后两种构建物在图53中诱导最高滴度的“高质量”RSV中和性血清抗体。[0597]恒河猴中的复制。具有GA-opt和GS-opt型式的HEKDS_CavlB3TMCT的平行构建物在URT中以相似的动力学复制，如通过鼻咽拭样采样的（图56A。然而，在LRT中没有观察到这种等同，如通过气管灌洗采样的:GS-opt型式比GA-opt型式减毒更少（图56B。这些结果与在图51中的仓鼠中观察到的一致。关于具有DS较之DS-Cavl的平行构建物HEKGA-optDSB3TMCT较之HEKGA-〇ptDS-CavlB3TMCT的比较，前一种病毒在URT中减毒更多（图56A;但是它们在LRT中以相似的效率复制（图56B。这些结果也与在图51中的仓鼠中观察到的一致。值得注意的是，与在第INHP研究中测试的相同构建物（图29，实施例1相比，HEKGA-〇ptDSB3TMCT在这项研究中在URT和LRT二者中复制至显著更高的滴度高〜10倍）。先前的研究（图29中的猴比图56中使用的猴老6岁且重量大2-3倍。可能是这些病毒的复制在年轻的猴中更加有效，或者差异可能反映这两项实验之间的变异性。[0598]RSV中和性血清抗体。虽然图56中的三种载体在恒河猴中以略微不同的效率复制，但是它们诱导相当的高水平的RSV中和性血清抗体，是通过补体依赖性图57A和补体不依赖性图57B测定法测定的。[0599]在第一基因位置处插入RSVF。实施例1和本实施例中的所有在先BHPIV3-RSV-F构建物均涉及在载体N和P基因之间的第二基因位置中插入的RSV基因。在第一位置处插入未修饰RSVF与生长受损或RSVF蛋白表达稳定性降低的任何明显问题不相关。调查了优化，改造形式的RSVF是否能自第一基因位置有效且稳定表达。具体而言，将HEKGS-optDS-CavlB3TMCT型式的RSVF插入N前位置图58A。[0600]HN中赋予载体的表型不稳定性的两处氨基酸指派的鉴定和修饰。先前注意到rBHPIV3载体在体外传代后展现出表型不稳定性LiangetalJVirol88:4237-4250。具体而言，实质性比例的载体在传代期间获取了大噬斑表型。这发生于不同插入物以及空载体，指示它是载体独自的一项特性且不是外来基因特异性的。6个克隆的大噬斑病毒的全基因组序列分析显示每一个获取了HN中的H552Q错义突变，以及F中的三处不同错义突变中的一处，及一些情况中L中的一处或两处错义突变LiangetalJVirol88:4237-4250。11个另外的大噬斑克隆的部分测序显示这些中的7个含有HN中的H552Q突变，而其它4个均含有HN中的四处其它错义突变N240K，P241L，R242K，或F558L中的一处。与HPIV3HN蛋白的晶体结构（LawrenceetalJMolBiol335:1343-1357,2004的比较指示所有这些HN突变位于HN球状头的二聚体界面中。另外，先前记载了通过神经氨酸酶处理细胞上的生长选择的一种HPIV3变体中的H552Q突变，该HPIV3变体具有大噬斑表型，具有更高的对含有唾液酸的受体的亲合力，具有增强的F蛋白触发，而且在啮齿动物中是减毒的MosconaetalJVirol67:6463-6468；PorottoetalJVirol81:3216-3228；PalermoetalJVirol83:6900-6908。这提示rBHIPIV3载体中的HPIV3HN基因中的偶然突变是相似的且大概是因为它们提高rBHPIV3载体对Vero细胞的结合亲和力而选择的。然而，其他人关于大噬斑表型与体内实质性减毒相关的观察结果MosconaetalJVirol67:6463_6468;PorottoetalJVirol81:3216-3228;PalermoetalJVirol83:6900-6908对于本载体会是不利的，因为这很可能会导致过减毒。HPIV3反求遗传学系统含有HN基因中的两处突变：cDNA克隆中有导致T263I错义突变的偶然的C7589T核苷酸突变（相对于完整反基因组序列），和作为标志物有目的地引入的导致P370T突变的C7913A和A7915T突变DurbinetalVirology235:323-332,1997。这后一种错义突变已经设计成消融受到两种可得HPIV3中和性单克隆抗体单抗4236和1707识别的表位。将这些突变恢复成它们的野生型指派，艮P7593C263T和7913C+7915A370P图58B。引人注目地，这些变化防止在Vero细胞中传代期间获取大噬斑表型（未显示）。因此，别的携带HPIV3HN基因的载体构建物包括但不限于基于rBHPIV3和HPIV3的载体优选应当含有这些指派。例如，将I263T和T370P突变掺入图58A中所示HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCTpre-N构建物。会修饰所有携带HPIV3HN基因的感兴趣载体以含有263T和370P指派。[0601]病毒回收。回收有HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT插入N前位置的rBHPIV3载体（图58A并生长至高至8.21og1QTCID5QmL的滴度，且因而就病毒产量而言具有很少的生长限制或没有生长限制，这对于疫苗制造是重要的。这种病毒的噬斑尺寸一般比插入第二位置的相同型式的RSVF未显示更小，指示对生长有在病毒产量方面不明显的适度限制。[0602]RSVF蛋白的表达的稳定性。通过双重染色噬斑测定法分析病毒的两份制备物以评估RSVF蛋白的表达的稳定性。实施两个独立挽救病毒集合称作CL20a和CL24a的双重染色噬斑表型。在感染10倍连续稀释病毒的24孔板中的Vero单层上进行噬斑测定法。用含有0.8%甲基纤维素的培养基覆盖感染单层并于32°C温育6天。在冰冷的80%甲醇中混合后，将单层与三种针对RSVF的小鼠单克隆抗体（1129，1109，1243的混合物和家兔抗HPIV3超免疫血清一起温育，接着与IRDye680红色，检测RSVF缀合的山羊抗小鼠和IRDye800绿色，检测HPIV3缀合的山羊抗家兔抗体一起温育。[0603]一份制备物在细胞培养物中传代后是稳定的，而第二份制备物在〜40%的病毒中具有绿色染色且因而具有RSVF表达丧失的证据。这些结果指示RSVF表达丧失在病毒制备物中可发生且可放大，但是它表现为零星的且仔细监测能鉴定具有高比例的表达的制备物。[0604]细胞内蛋白质表达。在Vero图59A和LLC-MK2图59B细胞中分析来自N前位置的RSVF表达。在Vero细胞中，HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT型式的RSVF作为Fi和Fo链表达图59A，而且来自N前位置的总表达与自N-P位置表达的相当。但是在LLC-MK2细胞中（图59B，这种型式的RSVF作为Fo链优势表达，而且来自N前的表达比来自N-P位置的（图59B，3,4,5道实质性更加有效。在这两种类型的细胞中，这种型式的RSVF以比未修饰RSVFnon-HEKnon-opt，图59A，59B，3和4道较之6道高得多的水平表达。[0605]实施例2:[0606]作为二价HPIV1RSV疫苗的表达人呼吸道合胞病毒RSV的融合F糖蛋白的减毒人副流感病毒1型HPIVl[0607]这个实施例例示自两种减毒rHPIVl主链的三个基因组位置表达RSVF抗原的活减毒rHPIVl载体的RSV疫苗的开发和临床前评估。仓鼠中的临床前评估指示携带PC基因中的减毒删除突变CAm且自N前位置表达RSVF的rHPIVlCAmTl载体是充分减毒，稳定且针对RSV和HPIVl免疫原性的并针对RSV攻击感染提供显著保护。这项研究证明rHPIVl能作为RSV疫苗载体用于实现针对两种主要儿童疾病的二价保护。[0608]引言。与包含RSV的减毒株的RSV疫苗相比，包含表达RSVF蛋白的活减毒HPIV载体诸如自HPIVl开发的）的RSV疫苗提供数项优势。一项优势是它提供针对RSV和作为载体使用的HPIV血清型的二价疫苗。这是重要的，因为，正如注意到的，HPIV也是儿科呼吸道疾病的重要的，未受控制的因子，流行病学和发病机理的特征与RSV的那些交叠。因而，组合的HPIVRSV疫苗是会扩宽针对儿科呼吸道疾病的覆盖的一种合乎逻辑的组合。另外，RSV感染性是臭名昭著的，因为它倾向于在操作期间不稳定，这使疫苗开发，制造，和投递变得复杂。HPIV是实质性更加稳定的，这对于将RSV疫苗延伸至最需要它们的发展中国家可能是至关紧要的。在体外生长的RSV常常形成长丝，使制造变得复杂，而HPIV形成更小的球形颗粒。还可能的是，与HPIV相比，RSV是内在致病性更高且甚至可能免疫抑制性的，这会是HPIV为载体的RSV疫苗的另一项优势。还已经发现，在啮齿动物中，在活减毒RSV株之后施用的作为加强使用的HPIV为载体的疫苗具有比第二剂相同减毒RSV株更高的免疫原性。因而，源自初次免疫接种的RSV特异性免疫可能预期比HPIV为载体的病毒更加有效地限制第二剂减毒RSV株的复制，并且指示HPIV为载体的RSV疫苗的另一项潜在优势。[0609]HPIVl基因组是单链负义RNA。它由短3’前导区，接着是编码N，P，C，M，F，HN，和L蛋白的6个基因，和短尾随区组成。每种基因编码一种主要病毒蛋白：N，核蛋白；P，磷蛋白；M，内部基质蛋白；F，融合糖蛋白；HN，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白；和L，主要聚合酶亚基。另外，P基因携带表达抑制宿主干扰素（IFN应答并阻断凋亡的一组羧基-共末端C辅助蛋白carboxy-c〇-terminalCaccessoryprotein的一个交叠ORFBartlett，etal.2008.Jvirology82:8965-8977。像其它不分段负链RNA病毒一样，HPIVl转录起始于3’末端启动子并以受到基因终点GE-基因间（IG-基因起点GS信号调节的开始-终止过程沿着基因组行进以生成一系列单顺反子mRNA。有转录降低的3’至5’梯度，接近启动子的基因以更高水平表达Nagai·1999.Reviewsinmedicalvirology9:83-99。像其它副粘病毒一样，可以在来自转染cDNA的细胞培养物中回收完整的感染性的，复制胜任的HPIVl反求遗传学。[0610]先前的研究已经记载了牛和人PIV3的嵌合物作为RSVF蛋白的载体的开发Schmidtetal2000JVirol74:8922-8929；Schmidtetal2001JVirol75:4594-4603；Schmidtetal2002JVirol76:1088-1089；Tangetal2002JVirol78:11198-11207;Bernsteinetal2012PediatrInfectDis31:109-114;还见实施例I。这种称作rBHPIV3的病毒由如下的BPIV3组成，其中使用反求遗传学将F和HN基因用HPIV3的那些替换，组合灵长动物中的BPIV3的减毒表型与HPIV3的主要中和抗原（Schmidtetal2001JVirol75:4594-4603;Schmidtetal2002JVirol76:1088-1089；Tangetal2002JVirol78:11198-11207；Bernsteinetal2012PediatrInfectDis31:109-114〇rBHPIV3显示出有效表达RSVF和G基因。引导rBHPIV3RSV-F构建物作为RSV和HPIV3的二价疫苗在血清阴性儿童中的临床评估显示它是感染性的，耐受较好，且减毒的，但是针对RSVF的免疫原性比希望的要低Bernsteinetal2012PediatrInfectDis31:109-114。这看来是至少部分由于临床试验材料中使RSVF插入物的表达沉默的遗传不稳定性Yang，etal.2013.Vaccine31:2822-2827。然而，正在进行进一步的研究，通过表征和优化载体构建的各种参数稳定化RSVF插入物及获得升高的免疫原性Liang，etal.2014.Jvirology88:4237-4250APIVl是另一种有吸引力的用于表达RSVF抗原的载体。特别是，HPIVl在儿童中感染比RSV或HPIV3有点晚（Counihan，etal.2001.Pediatricinfectiousdiseasejournal20:646-653;Reed，etal.l997.JInfectDis175:807-813，因此HPIVl为载体的RSV疫苗可能在活减毒RSV或rBHPIV3为载体的疫苗之后用于加强针对RSV的免疫应答。[0611]在本研究中，评估了用于开发表达RSVF蛋白的HPIVl为载体的疫苗的两项参数图36和42:⑴比较两种不同减毒HPIVl主链，和（ii比较在HPIVl载体的第一，第二，和第三基因组位置处插入RSVF基因。第一项参数，减毒的水平，是重要的，因为它与安全性有联系且与免疫原性有相反的联系。具体而言，HPIVl载体必须足够减毒，从而是非致病性的且耐受较好的，但是必须足够好地复制和表达抗原，从而实现令人满意的免疫原性。将外来基因（诸如RSVF添加至HPIV载体也典型地赋予减毒且还能赋予温度敏感性（ts表型Liang，etal.2014Jvirology88:4237-4250，因此不得不测定插入物和具体减毒性突变的组合效果。本研究中使用的两种不同HPIVl主链各自含有在先前的研究（1，3,25中开发的单一减毒性突变CAmSLY942A。这些突变各自已经显示出在体内适度减毒Bartlett，etal.2006.Vaccine24:2674-2684；Bartlett,etal.2007.VirologyJ4:67；Newman,etal.2004.JVirol78:2017-2028突变不是温度敏感性的。它降低C蛋白抑制宿主I型干扰素应答和凋亡的能力（Bartlett,etal·2006·Vaccine24:2674-2684;Bartlett,etal.2008.Jvirology82:8965-8977;Newman,etal.2004.JVirol78:2017-2028，导致病毒减毒。减毒的机制具有提高构建物的内在免疫原性的潜力，因为C中的这种突变提高宿主干扰素应答和凋亡应答，二者均具有提高免疫原性的潜力98%噬斑表达RSVF。在所分析的30份样品中，29份具有100%且只有1份样品具有98%2%丧失PFU表达RSVF。这些数据提示表达RSVF的rHPIVlCM7载体在仓鼠模型中是相当稳定的，而且没有显示选择在体内复制后RSVF表达沉默至少5天的突变体的证据。[0646]免疫原性[0647]免疫接种表达RSVF的嵌合rHPIVl病毒诱导针对RSV和HPIVl的血清病毒中和性抗体NAb。为了测定表达RSVF的rHPIVl病毒的免疫原性，给多组6只仓鼠每种病毒鼻内接种IO5TCID5q每只动物。包括wtRSV，rHPIVlCA17°，rHPIVlLY942A，和rBHPIV3-F2作为对照。在感染后28天收集来自免疫接种仓鼠的血清并通过PRNT6q测定法测定针对RSV和HPIVl的NAb滴度（图45^HPIVlCM7-F1，-F2,和-F3以彼此没有统计学差异的滴度诱导RSV特异性Nab。这并不令人惊讶，因为三种病毒均显示相似水平的RSVF蛋白表达（图38A和38B。rHPIVlCAm-Fl和-F2具有比-F3病毒略微更高的RSVF表达但是这种差异不是统计学上显著的（图38B。同样，-Fl和-F2病毒还显示比-F3病毒相对更高的融合活性和合胞体形成，推测与感染期间合成的RSVF的量有关（图39A-39C。虽然统计学上不显著，但是Fl和F3病毒的NAb滴度看来与F2相比略微更高，这与它们的体内复制概况（图40A而非RSVF表达的量更加一致。由rHPIVlCA17Q-F1，-F2,和-F3诱导的RSVNAb滴度比由rBHPIV3-F2诱导的显著更低，该差异很可能源自这些病毒与rBHPIV3-F2相比显著降低的复制（图40A和40B。[0648]rHPIVlLY942A-F1，-F2,和-F3病毒未能诱导针对RSV的NAb应答。这是出乎意料的，因为在Vero细胞的体外感染上rHPIVlLy942a-FI显示与rHPIVlCa17q-FI，-F2,和-F3相似的RSVF表达（图38A。然而，重要的是要注意，19424突变是高减毒性的且赋予关闭温度为36°C的温度敏感性表型（图43。179424突变体病毒预期在仓鼠（体温：36.7-38.3°C;TheMerckManual中显示最低限度的复制或不显示可检测的复制。与主链表型一致，rHPIVlLy942a-Fl，-F2，和-F3也是温度敏感性的，关闭温度分别为35°C，35°C，和36°C，指示在Fl和F2位置处插入RSVF将关闭温度降低1°C，使得它们的温度敏感性甚至更高。因此，虽然rHPIVlLy942a-FI能够在允许性温度以与rHPIVlCA17-F1，-F2,和-F3病毒相当的水平表达RSVF图38A，但是它未能诱导RSVNAb，很可能是由于它的强温度敏感性表型和没有能力在体内复制。rHPIVlLY942A-F2和-F3病毒看来具有两项令人困惑的因素:它们显示相对较差的RSVF表达（图38A和38C，而且另外是温度敏感性的且在体内不复制（图40A和40B，导致缺少RSVNAb应答。因而，rHPIVlLy942a-FI，-F2，和-F3病毒没有免疫原性且不生成疫苗候选，因为它们过度削弱温度敏感性表型且在体内缺少复制和免疫原性。[0649]还通过PRNT6q测定法评估了仓鼠中的HPIVl特异性NAb应答（图45。总的说来，HPIVlNAb滴度的水平与RSVNAb滴度相比更低。正如方法中指出的，豚鼠补体包括在针对RSV的中和测定法中，但是排除在HPIVl中和测定法外，因为它中和HPIVl。缺少补体可能是HPIVlNAb滴度普遍降低的原因。rHPIVlCA17Q-F2和-F3病毒不诱导可检测水平的HPIVINAb。只有rHPIVlCaitq空载体和rHPIVlCmtq-FI诱导可检测的HPIVl特异性NAb应答，它们的滴度彼此没有统计学差异。这与预期相反，因为所有载体蛋白的表达对于rHPIVlCaito-FU^显著降低（图38A和38B。它还具有与F2或F3病毒相比要低1°C的关闭温度且它以与F3病毒相似的水平在体内复制。因而，rHPIVlCM7-F1预期诱导与-F3病毒相比相似或更弱的HPIVl特异性NAb应答。然而，CA17Q-F2较差的HPIVl免疫原性与它降低的F和HN蛋白表达（图38B和URT和LRT中较差的复制（图40—致。CA17Q-F3病毒缺少HPIVlNAb应答是出乎意料的。它以与空载体相似的水平表达所有HPIVl蛋白（图38A和38B，相似地复制，且具有与空载体相似的关闭温度，但是不显示可检测的NAb应答。[0650]所有rHPIVILy942a病毒，包括空载体，不诱导可检测水平的HPIV1特异性NAb。所有rHPIVlLy942a病毒在体外表达降低水平的HPIVl蛋白（图38A和38C且在体内显示较差的复制或不显示复制。与此一致，这些病毒还显示缺少针对RSV的免疫原性。它们较差的免疫原性很可能是它们强温度敏感性表型（图43和缺少体内复制（图40的结果。[0651]免疫接种表达RSVF的rHPIVl载体提供针对wtRSV攻击的保护。如上文所述给仓鼠免疫接种表达RSVF的rHPIVl并在免疫接种后第30天用IO6PFUwtRSV攻击。在攻击后第3天对仓鼠处以安乐死并通过Vero细胞上的噬斑测定法测定鼻甲和肺中的RSV滴度以评估针对攻击RSV复制的保护（图41A和41B。由疫苗候选提供的针对RSV感染和复制的保护与它们诱导RSV特异性血清NAb的能力有关。在URT中，与rHPIVlCmtq空载体相比，rHPIVlCmtq-Fl和-F3提供针对RSV复制的显著保护且显示显著降低的（分别为p〈0.0001和p〈0.05RSV滴度，而-F2病毒没有效果。在肺中，虽然所有三种rHPIVlCA17-F1，-F2，和-F3病毒均具有与rHPIVlCAm空载体相比降低的均值RSV滴度，但是只有-Fl病毒的RSV降低是统计学上显著的〈0.05。正如预期的，池即1¥342在1^1'屮〈0.0001和肺〈0.05中提供针对1«¥攻击的显著保护，与先前的报告Liang，etaL·2014.Jvirology88:4237-4250，和实施例1一致。[0652]rHPIVl疫苗候选与rBHPIV3-F2病毒的统计学比较显示在URT和肺二者中由rHPIVlCmtq-FI提供的保护与rBHPIV3-F2在统计学上相似。rHPIVlCmtq-FI在仓鼠中在感染后第3天复制至与rBHPIV3-F2相似的滴度，但是在感染后第5天展现显著降低的复制，提示rHPIVlCAm-Fl可能在体内充分减毒。这连同它与rBHPIV3-F2相似的针对RSV攻击提供保护的能力一起还指示rHPIVlCAm-Fl具有期望的减毒和免疫原性特征且应当作为活减毒RSV疫苗候选进一步开发。[0653]rHPIVlLy942a-FI，-F2,和-F3病毒在URT和肺中不提供针对RSV攻击的保护且显示与rHPIVlLy942a空载体相似的攻击RSV载荷。这与它们缺少体内复制和针对RSV的免疫原性一致。[0654]讨论[0655]先前开发了在啮齿动物和或非人灵长动物中免疫原性的多种减毒型式的携带减毒性和或温度敏感性突变的rHPIVl。测定了含有分别涉及删除6个核苷酸和替代3个核苷酸的^17°或1_突变的两种减毒rHPIVl主链。在每种主链的第一，第二，或第三基因组位置处插入RSVF，目的是鉴定适当减毒且仍然具有足够免疫原性且针对wtRSV攻击提供保护的构建物。通过反求遗传学成功挽救了所有表达RSVF的rHPIVl病毒。Vero和LLC-MK2细胞中的生长动力学指示所有病毒生长至非常相似的且统计学上无法区分的在感染后7天测定的最终滴度（图37。然而，在这两种细胞系中在第2天观察到复制的显著差异。至少在Vero细胞中，LY942A突变看来具有比："17°突变更强的减毒效果。与预期相反，rHPIVlCA17°病毒在I型干扰素（IFN-I胜任性LLC-MK2中与IFN-I缺陷性Vero细胞相比没有减毒。在表达RSVF的rHPIVlCAm病毒中，对Vero中的-Fl和-F2病毒（图37A和LLC-MK2细胞中的-Fl病毒（图37B观察到与wtHPIVl相比的显著减毒，而-F3复制与空载体和wtHPIVl相似。这些数据提示-Fl或-F2病毒中在更接近3’近端位置插入RSVF可能是减毒性的，但是这种效果是瞬时的且所有病毒生长至相似的最终滴度（图37A和37B。所有rHPIVl19424主链载体包括-Fl，-F2和-F3在第7天生长至相似的最终滴度。然而，它们还在第2，3，和4天在Vero和LLC-MK2细胞二者中展现降低的复制，但是在5-7天之间与wtHPIVl相似。关于RSVF插入物诱导的减毒，rHPIVl19424的程度与rHPIVlCA17Q载体相比高得多（图37D，指示RSVF插入对早就显著减毒的主链具有更强的减毒效果。[0656]通过于允许性温度32°C温育的感染Vero细胞的Western印迹分析对所有病毒检查它们表达RSVF蛋白的能力。还评估HPIV1N，P，F，和HN蛋白的表达以测定各个位置处的RSVF插入对载体蛋白表达的影响。出乎意料地，对rHPIVlCAm载体没有观察到RSVF表达的极性梯度。rHPIVlCAm-Fl展现所测试的所有载体蛋白的表达均显著降低。相似地，除N蛋白以外，rHPIVlCA17Q-F2还显示降低的P，F，和HN蛋白表达（图38A和38B。与此一致，-Fl和-F2病毒二者在Vero细胞中在感染期间早期均显示降低的复制（图37A。这些数据提示对于Fl和F2病毒，载体蛋白合成降低和因此复制削弱的组合效果可能引起RSVF表达降低及其极性梯度缺失。rHPIVlCAm-F3显示RSVF表达与Fl和F2相比适度降低，很可能是由于它的远端基因组位置。对于展现表达的强极性梯度的rHPIVlLy942a载体（图38A和38C与显示与F2和F3相比显著更高的RSVF表达的Fl病毒，RSVF表达概况非常不同。正如预期的，在第一位置中插入RSVF对于Fl载体显著降低N蛋白表达，而P，F和HN蛋白不受影响且具有与它们的空载体对应物相似的表达（图38A和38C^HPIVlLY942A-F2显示很差的RSVF以及所有载体蛋白的表达（图38A和38C。如上所述，由于它的高度减毒表型和挽救期间突变的积累，这种病毒最难以挽救。然而，通过基因组测序确认，实验中最终使用的病毒没有偶然突变。因此，看来在rHPIVl19424主链中的F2位置处插入RSVF似乎相当有害，病毒显示所测试的所有载体蛋白的剧烈的显著降低，包括RSVF。这一结果的一种非限制性解释是，这是插入物位置和高度减毒主链的组合效果，因为对rHPIVlCAm-F2没有观察到此类效果。提到它的生长动力学（图37C-37D，rHPIVlLY942A-F2是所有rHPIVl19424载体中减毒最多的。因而，看来载体蛋白合成的总体降低显著降低它的复制，导致RSVF表达降低。rHPIVlLY942A-F3病毒以与空载体相似的水平表达载体蛋白，但是显示RSVF表达与Fl相比降低10倍（图38A和38C。这指示第三基因组位置处的RSVF插入对载体蛋白表达没有负面影响（图38A和38C但展现较差的RSVF表达，很可能是由于它在极性转录梯度中的远端位置。[0657]天然RSVF引起相邻感染细胞的质膜融合，导致合胞体形成。HPIVl载体F蛋白不引起合胞体形成，因此能用作RSVF功能性和天然形式以及表达数量的指标。在Vero和LLC-MK2细胞中评估了自rHPIVlCmtqSLy942a载体表达的RSVF引起的合胞体形成。对rHPIVlCA17Q-F1和-F2以及rHPIVlLy942a-FI观察到广泛合胞体形成，显示单层中的大多数细胞融合图39，提示重组RSVF蛋白是功能性的且大概处于天然构象。rHPIVlCA17-F3*LY942A-F2和-F3不显示显而易见的合胞体形成。合胞体形成的程度与通过Western印迹检测的RSVF表达的水平一致（图38A-38C。[0658]既然温度敏感性表型在体内病毒复制中发挥重要作用且可能决定免疫原性，那么评估了表达RSVF的载体的温度敏感性表型。与甚至在40°C都不是温度敏感性的wtHPIVl形成对比，rHPIVlCa17Iply942a主链分别在40°C和36°C是温度敏感性的（图43。重要的是要注意，在rHPIVlCmtq中在Fl处和在rHPIVlLy942a中在Fl或F2位置处插入RSVF将关闭温度降低1°C，因而使得它们的温度敏感性略微更高。这种效果可能不是HPIVl独特的，因为在一些先前的研究（Liang，etal.2014.Jvirology88:4237-4250中对RSVF插入rBHPIV3载体观察到相似的效果。对rHPIVlLY942A-F2而非rHPIVlCAm-F2观察到温度敏感性表型的增强，指示插入外来基因可能增强早就显著是温度敏感性的病毒的温度敏感性表型。[0659]在仓鼠中评估rHPIVl载体以评价它们的复制和免疫原性。rHPIVl19424病毒均是过减毒的且大多数动物的URT和肺中的病毒复制是不可检测的。这与它们关闭温度为35-36°C的高度温度敏感性表型一致。不能复制看来不是由于RSVF插入，而很可能是它们的温度敏感性表型的效果，因为甚至空载体也在肺中不复制且在URT中具有较差的复制。rHPIVlC△17Q-F1，-F2,和-F3总的说来在肺中高度受限制且不可检测，而空rHPIVlCAm载体确实显示比WtHPIVl显著更低的低水平复制，提示RSVF插入物的存在在肺中对早就减毒的rHPIVlCA1™主链具有另外的减毒效果。与肺形成对比，所有rHPIVlCAm在所有动物的URT中载体复制较好。Fl和F2病毒而非F3与wtHPIVl相比显著减毒，F2比Fl减毒更多。这是出乎意料的，因为一般而言更接近基因组的3’末端的插入导致更高的减毒。这也与在体外Fl和F2而非F3相对更慢的早期生长一致（图37，指示在Fl中和特别是在F2位置处插入RSVF具有叠加性减毒效果。Fl病毒表现出具有期望程度的减毒，而F2和F3病毒分别是减毒过度或不足的。[0660]达到减毒和免疫原性之间的最佳平衡对于活减毒疫苗是一项挑战。为了评估减毒rHPIVl载体是否充分减毒，与rBHPIV3-F2,自第二基因组位置表达RSVF的先导RSV疫苗载体Liang，etal.2014.Jvirology88:4237-4250比较它们的复制。在第3和5天在URT和肺二者中rHPIVlCAm-Fl，-F2,或-F3复制与rBHPIV3-F2相比或是统计学上相似的或是显著更低的。这提示^17突变与RSVF插入一起看来至少在这种动物模型中实现了期望水平的减毒，使得所有三种载体在肺中高度受限制但确实在URT中展现免疫原性会需要的与rBHPIV3-F2相似的削弱的复制。[0661]RNA病毒为载体的疫苗遭遇的一项困难是在体内外来抗原基因的不稳定性Yang，etal.2013.Vaccine31:2822-2827。突变由于易错聚合酶及缺少维持插入物表达的需要而发生。可以正选择外来抗原中由于RNA依赖性RNA聚合酶的失真而获取的任何突变，因为它们提供选择优势。为了测定在体内免疫接种后RSVF表达的稳定性，通过荧光双重染色噬斑测定法分析自仓鼠的呼吸组织回收的病毒。这只能对在URT中显示可检测复制的HPIVlCA17Q-F1，-F2,和F3病毒实施（图44。对于大多数样品，对所有三种病毒观察到稳定的RSVF表达，除了1份HPIVlCmtq-FI样品对其98%噬斑检测到RSVF表达。这些数据指示rHPIVlC载体在体内复制期间维持稳定的RSVF表达。[0662]通过实施PRNT6q测定法评估了rHPIVl载体的免疫原性。在豚鼠补体存在下实施了针对RSV的测定法，豚鼠补体排除在HPIVl中和测定法之外，因为补体独自直接中和HPIVl。rHPIVlCa17q-FI，-F2，和-F3分别以7·3，4·7，和6·7的PRNT6qIog2滴度诱导RSV中和性抗体图45。虽然Fl展现最高的抗体滴度，但是它与F2和F3诱导的在统计学上相似。这些滴度比rBHPIV3-F2或wtRSV对照诱导的显著更低，这可能是它们总的说来在URT和肺二者中相对降低的复制的结果。rHPIVlLy942a-FI，F2,和F3病毒不诱导可检测的RSV或HPIVl中和性抗体应答，这与它们缺少体内复制一致。只有rHPIVlCAm-Fl而非F2或F3诱导可检测的HPIVl中和性抗体。这是出乎意料的，因为F2和F3确实在仓鼠中显示复制（图40且诱导RSVNAb。正如上文指出的，已知增强PRNT6q读出的豚鼠补体不能包括在HPIV1中和测定法中。甚至对于在仓鼠中复制的病毒而言，总体较低的HPIVl抗体滴度和缺少可检测应答可能是由于缺少补体的测定法的灵敏度更弱。[0663]为了测定载体针对RSV感染的保护功效，在免疫接种后30天时用一剂高（IO6PfuwtRSV每只动物鼻内攻击所有免疫接种仓鼠。通过测定鼻甲和肺中的RSV复制来评估针对攻击的保护（图41A和41B。保护与免疫原性直接相关（图45。与RSVNAb滴度高度一致，rHPIVlCA17-F1的保护性比F3更高且F2不提供保护。Fl在URT和肺二者中的保护是统计学上显著的而F3只在URT中是显著的。重要的是，rHPIVlCmtq-FI在URT和肺中提供与rBHPIV3-F2在统计学上无法区分的保护。这有点出乎意料，因为rHPIVlCa17q-FI诱导比rBHPIV3-F2显著更低的RSVNAb滴度，提示相对更低的NAb滴度足以实现相似的保护。这种解释得到如下证据的支持，即棉鼠的呼吸道中的RSV复制在血清NAb滴度为1:1OO或更大时能降低Prince,etal.1985JVirol55:517-520。再次，与它们缺少血清转化一致，rHPIVlLy942a-FI，F2,和F3不提供针对攻击的任何保护且具有与空载体相似的RSV载荷。这些数据清楚显示rHPIVl19424载体由于它们的温度敏感性表型是过减毒的，而且在仓鼠中不复制，导致缺少针对RSV和HPIVl二者的免疫原性。与之对比，rHPIVlCAm载体，虽然在肺中高度受限制，但是确实在URT中复制。在这项研究中测试的载体中，rHPIVlCA17-F1表现为充分减毒且仍然具有足够的针对RSV的免疫原性。认识到在仓鼠中表现为过减毒的构建物当在更加允许性的灵长动物宿主中时评估可能性能更加合适。[0664]总而言之，这个实施例将rHPIVlCAm鉴定为有希望的减毒主链，适合于自插入基因表达RSVF抗原。还系统性确定了rHPIVlCAm载体的FlN前基因组位置在为了插入RSVF而测试的位置中是优选的。这项研究还证明rHPIVlCAm-Fl是一种有希望的疫苗候选且拥有数项期望特征：（i它基于一种在非人灵长动物3中较好表征了减毒的主链，（ii它在Vero细胞中复制至与wtHPIVl相似的最终滴度，这是疫苗制造的一项必需特征，（iii插入RSVF使其减毒比空CAm主链略微更多至与rBHPIV3-F2相似的水平，（iv构建物在体内复制后是稳定的且维持RSVF表达，和V它是免疫原性最高的HPIVl载体，诱导最高的RSV和HPIVl中和性抗体滴度，而且还是针对wtRSV攻击的保护性最高的。[0665]上述发现指示有可能使用表达RSVF的HPIVl载体作为用于针对RSV和HPIVl的粘膜免疫接种的二价疫苗。HPIVl为载体的RSV疫苗可以用作首要RSV疫苗或用于加强主要由活减毒RSV诱导的免疫。HPIVl为载体的RSV疫苗办法会规避与开发减毒RSV株相关的内在问题，而且可能推动RSV免疫接种程序，甚至在资源受限的设置中。[0666]实施例3:[0667]表达优化型式的RSVF蛋白的rHPIVl_CAm载体的开发[0668]这个实施例呈现测定法，显示可以将编码已修饰RSVF外域的基因插入HPIVl载体主链以生成在它的包膜上表达RSVF外域的重组病毒，它是减毒的，感染性的，且能诱导保护性抗体应答。F2位置也鉴定为有效插入位点。这些发现指示：[0669]1.已经鉴定了HPIVlFTMCT域的操作边界（图60。[0670]2.可以将HPIVlFTMCT域添加至重组RSVF外域（例如HEKGS-optDS-Cavl以实现在细胞表面处有效表达且与抗RSV-F抗体反应性的蛋白。[0671]3.含有HPIVlFTMCT的RSVFHEKGS-〇ptDS-CavlHlTMCT有效包装入HPIVl载体颗粒（即以比RSV更高的水平每yg病毒粒体蛋白，图64。这与基于先前用仙台病毒HPIV1的鼠亲戚，因而假定是紧密的预测模型进行的研究的预期完全相反，其中含有仙台病毒CT或TMCT的RSVF只在内源仙台病毒F蛋白删除的情况中有效包装入颗粒（Zimmeretal2005JVirol79:10467-10477〇[0672]3·可以将HEKGS-optDS-Cavl和HEKGS-optDS-CavlHITMCT形式的RSVF蛋白插入第一或第二基因位置以产生稳定表达RSVF，在体外有效复制（图63，且有效掺入载体颗粒当HPIVlFTMCT存在时，图64的载体构建物。[0673]4.出乎意料地，虽然Fl或F2位置任一有效表达融合原性的RSVF蛋白（例如HEKGA-opt，实施例2，但是F2位置对于非融合原性的RSVF例如HEKGS-optDS-Cavl的细胞内表达特别有效。[0674]5.rHPIVl-CA17〇-F2HEKGS-〇ptDS-Cav0PrHPIVl-CA17-F2HEKGS-〇ptDS-CavlHITMCT构建物鉴定为有效表达RSVF蛋白，而且，特别是在后一种情况中，将RSVF有效掺入载体颗粒。[0675]HEKGS-optDS-Cavl。在本实施例中，使用rHPIVl_CA17Q载体来表达进一步修饰型式的RSVF蛋白。所有插入物含有为了人表达由Genecript密码子优化GS-opt且具有两处HEK氨基酸指派（即残基66和101处的Glu和Pro的RSVF。另外，HEKGS-optRSVF蛋白含有稳定化融合前突变DSS155C和S290C和CavlS190F，和V207L以稳定化已经显示负责RSV中和性抗体的优势的RSVF融合前头和抗原性位点0:McLellanetal2013Science342:592-598。[0676]HPIVlTMCT。另外，生成HEKGS-optDS-CavlRSVF蛋白的一种型式，其中它的TMCT域用HPIVlF蛋白的替换。HPIV1TM和CT域的构成先前尚未测定。图60指示RSVF蛋白（顶部的线和HPIVlF蛋白（第二条线）的TM和CT域，并显示RSVF蛋白的预测外域附着至HPIVlF蛋白的预测TMCT域的嵌合物。这样做的目的是提高RSVF蛋白掺入HPIVl载体，前提是HPIVlF特异性TMCT域在病毒装配期间会更加有效地与其它载体蛋白相互作用，而且会推动嵌合RSVF蛋白的掺入。[0677]rHPIVl-CA17Q载体构建物。图61和62显示使用来自实施例2的rHPIVl-CA17Q载体来接受放置在第一基因位置Fl处的两种插入物任一的构建物:表达RSVFHEKGS-optDS-Cavl，产生rHPIVl-CA17Q-FlHEKGS-〇ptDS-Cavl图61和62,顶部构建物）；或RSVFHEKGS-optDS-CavlHITMCT，产生rHPIVl-CA17Q-FlHEKGS-〇ptDS-CavlHlTMCT底部构建物）。注意，这两种构建物区别仅在于第二构建物中的RSVF具有来自HPIVlF蛋白的TMCT。图62显示插入物任一放置在rHPIVl-CAm载体的第二基因位置F2的两种平行构建物。所有病毒设计成保持六聚物基因组核苷酸长度六法则）（Kolakofskyetal1998JVirol72:891-899。每一种载体基因维持它的野生型六聚物定相phasing;Fl和F2插入物分别具有N和P基因的六聚物定相。[0678]病毒回收。通过用全长反基因组质粒和三种表达HPIV1N，P，和L蛋白的表达质粒中的每一种共转染BHKBSRT75细胞（组成性表达T7RNA聚合酶的幼仓鼠肾细胞Buchholzetal1999JVirol73:251-259来挽救4种构建物。实施检测HPIVl和RSVF蛋白共表达的双重染色噬斑测定法来测定RSVF表达的稳定性。绝大多数噬斑有效表达RSVF蛋白。将这些相同的4种制备物提交通过自动化测序进行的共有序列分析完整分析每一个基因组，除了被引物遮蔽的分别在3’和5’末端的22和26个核苷酸）。发现病毒没有通过这种方法可检测的偶然突变。[0679]体外多周期复制。如下对4种所回收的病毒（即在Fl或F2位置中有或无HlTMCT的HEKGS-optDS-Cavl评估体外多周期复制，即一式三份以MOI=0.OITCID5q每个细胞用每一种病毒感染Vero细胞并每24小时收集培养物上清液达7天。通过在LLC-MK2细胞上的连续稀释和血细胞吸附测定法来测定所收集的样品中的病毒滴度。所有具有RSVF插入物的载体与wtHPIVl和rHPIVl-CA17Q相比是相对减毒的且生长至7.0TCID5QmL左右的终滴度（图63DFlDS-Cavl和FlDS-CavlHITMCT注意，为了简要，名称中的“HEKGS-opt”部分在正文和图中可以省略在感染后p.i.第1和2天比F2DS-Cavl和F2DS-CavlHlTMCT复制更慢指数式复制期期间）但到第7天收获日）达到与F2DS-Cavl和F2DS-CavlHlTMCT相似的高滴度。因而，所有构建物生长至符合Vero细胞中的疫苗制造的较高的最终滴度。[0680]蛋白掺入病毒粒体。使那组4种构建物连同wtHPIV1，和rHPIVl-CM7Q空载体在LLC-MK2细胞中生长并通过蔗糖梯度离心来纯化。使wtRSV在Vero细胞中繁殖，接着是蔗糖梯度纯化，作为对照包括在内。在RIPA缓冲液中裂解大约Iyg每一种蔗糖纯化的病毒，还原，变性并提交SDS-PAGE和Western印迹分析。如在先所述（实施例2;Mackowetal2015JVirol89:10319-10332，分别用小鼠单克隆Abeam和家兔多克隆肽特异性抗体见实施例2，连同它们对应的红外染料缀合的二抗检测RSVF蛋白和HPIVl蛋白（N，F，和HN图64。对分别表达来自第1和第2位置的全长RSVF的FlDS-Cavl和F2DS-Cavl纯化病毒粒体的分析没有显示HPIVl载体病毒粒体中RSVF的可检测包装（图64,顶部小图，3和5道）。相反，FlDSCavl-HlTMCT和F2DSCavl-HlTMCT病毒粒体（图64,4和6道二者显示可观的掺入，FlDSCavl-HlTMCT比F2DSCavl-HlTMCT更高。有趣的是，两种HlTMCT型式均显示与wtRSV相比病毒粒体中包装更大量的RSVF图64,7道每yg病毒粒体蛋白。[0681]在相同实验中，还评估HPIV1N，HN，和F蛋白在HPIVl载体病毒粒体中的掺入（图64dPIVlN蛋白的病毒粒体掺入受到任何插入物表达的很小影响（图64,自顶部起第二幅小图）250的倒数滴度。另外，两种作用DS-Cavl和TMCT在一定程度上是叠加的。[0704]显而易见的是，可以在不背离所描述的实施方案的精神的情况下改变或更改所描述的方法或组合物的精确细节。我们请求保护落在所附权利要求的范围和精神内的所有此类更改和改变。

权利要求：1.一种重组副粘病毒，其包含：包含编码I型膜蛋白的异源基因的病毒基因组，该I型膜蛋白包含与副粘病毒的F蛋白的胞质尾CT，或跨膜域TM和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSVF外域;且其中该重组副粘病毒是重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒1HPIVl，重组人副流感病毒2HPIV2，重组人副流感病毒3HPIV3，或重组牛副流感病毒3BPIV3〇2.权利要求1的重组副粘病毒，其包含与副粘病毒的F蛋白的TM和CT连接的RSVF外域。3.权利要求1的重组副粘病毒，其包含与副粘病毒的F蛋白的CT连接的RSVF外域，其中该RSVF外域是经RSVF跨膜域与副粘病毒的F蛋白的CT连接的。4.权利要求1-3任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域来自人A亚型RSV或人B亚型RSV05.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域通过与天然RSVF蛋白序列相比的一处或多处氨基酸替代而稳定化于RSVF融合前构象。6.权利要求5的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含下列氨基酸：a66E；b10IP；c155C和290C;d190F；e207L;或fa和b;a和（c;a和d;a和（e;a，（d，和（e;a，（c，（d，和（e;a，（b，和c;a，（b，和d;a，（b，和e;a，（b，（e，和d;a，（b，（c，（d，和e;c和d;或c和e;或（c，（d，和e的组合，其中氨基酸编号方式对应于SEQIDNO:1所列RSVF蛋白序列。7.权利要求6的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含下列氨基酸替代：aK66E；bQ101P；cS155C和S290C;dS190F；eV207L;或fa和b;a和（c;a和d;a和（e;a，（d，和（e;a，（c，（d，和（e;a，（b，和c;a，（b，和d;a，（b，和e;a，（b，（e，和d;a，（b，（c，（d，和e;c和d;或c和e;或c，（d，和e的组合。8.权利要求6或权利要求7的重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L。9.权利要求1-5任一项重组副粘病毒，其中该RSVF外域包含SEQIDN0:1WTRSVFA，2WTRSVFB，12A2HEK，14A2HEKDS，或21A2HEKDS-Cavl之一，或与SEQIDNO:I，2，12，14，或21之一的RSV外域至少90%同一的氨基酸序列的RSV外域或由其组成。10.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其包含：a重组HPIVl，其中RSVF外域是与HPIVlF蛋白的CT连接的；b重组HPIV2，其中RSVF外域是与HPIV2F蛋白的CT连接的；c重组HPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；d重组HPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的；e重组BPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；f重组BPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的；h重组BHPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的CT连接的；或g重组BHPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的CT连接的。11.权利要求10的重组副粘病毒，其包含：a，且其中与RSVF外域连接的HPIVlF蛋白的CT包含SEQIDNO:31残基24-59所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:31残基24-59至少90%同一的氨基酸序列；b，且其中与RSVF外域连接的HPIV2F蛋白的CT包含SEQIDN0:39残基29-66所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:39残基29-66至少90%同一的氨基酸序列；c，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46残基24-46至少90%同一的氨基酸序列；d，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:53残基22-57至少90%同一的氨基酸序列；e，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46残基24-46至少90%同一的氨基酸序列；f，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:53残基22-57至少90%同一的氨基酸序列；g，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:46残基24-46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46残基24-46至少90%同一的氨基酸序列；或h，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的CT包含SEQIDN0:53残基22-57所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:53残基22-57至少90%同一的氨基酸序列。12.权利要求10的重组副粘病毒，其包含：a，且其中与HPIVlFCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:133所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；c，且其中与HPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:8所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；d，且其中与BPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:16所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；e，且其中与HPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:8所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；f，且其中与BPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:16所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；g，且其中与HPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:8所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列;或h，且其中与BPIV3FCT连接的RSVF外域包含SEQIDNO:16所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列。13.权利要求1-9任一项重组副粘病毒，其包含：a重组HPIVl，其中RSVF外域是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的；b重组HPIV2，其中RSVF外域是与HPIV2F蛋白的TM和CT连接的；c重组HPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；d重组HPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；e重组BPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；f重组BPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；g重组BHPIV3，其中RSVF外域是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；或h重组BHPIV3，其中RSVF外域是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的。14.权利要求13的重组副粘病毒，其包含：a，且其中与RSVF外域连接的HPIVlF蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:31所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:31至少90%同一的氨基酸序列；b，且其中与RSVF外域连接的HPIV2F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:39所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:39至少90%同一的氨基酸序列；c，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46至少90%同一的氨基酸序列；d，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:53所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:53至少90%同一的氨基酸序列；e，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46至少90%同一的氨基酸序列；f，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:53所列氨基酸序列，或与SEQIDNO:53至少90%同一的氨基酸序列；g，且其中与RSVF外域连接的HPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:46所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:46至少90%同一的氨基酸序列；或h，且其中与RSVF外域连接的BPIV3F蛋白的TM和CT包含SEQIDN0:53所列氨基酸序列，或与SEQIDN0:53至少90%同一的氨基酸序列。15.权利要求13的重组副粘病毒，其包含：a，且其中与HPIVlFTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:135所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；c，且其中与HPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDNO:10所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；d，且其中与BPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:21所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列。e，且其中与HPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDNO:10所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；f，且其中与BPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:21所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列；g，且其中与HPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDNO:10所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列;或h，且其中与BPIV3FTM和CT连接的RSVF外域包含SEQIDN0:21所列氨基酸序列，或与其至少90%同一的氨基酸序列。16.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其包含：重组HPIV1，其中病毒基因组包含编码HPIV1N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自HPIVlF蛋白；重组HPIV2,其中病毒基因组包含编码HPIV2N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV2F蛋白；重组HPIV3,其中病毒基因组包含编码HPIV3N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3F蛋白；重组HPIV3,其中病毒基因组包含编码HPIV3N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自BPIV3F蛋白；重组BPIV3,其中病毒基因组包含编码BPIV3N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3F蛋白；重组BPIV3,其中病毒基因组包含编码BPIV3N，P，V，M，F，HN，和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自BPIV3F蛋白；重组BHPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，V，M，和L蛋白的基因，且与RSVF外域连接的CT，或TM和CT来自HPIV3F蛋白；或重组BHPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3F和HN蛋白和BPIV3N，P，V，M，和L蛋白的基因，且其中与RSVF外域连接的TM和CT来自BPIV3F蛋白。17.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该编码重组RSVF外域的异源基因是病毒基因组的基因组启动子下游的第一或第二基因。18.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中该病毒基因组包含编码副流感病毒F蛋白的基因，特别是其中该副流感病毒F蛋白是重组副粘病毒的F蛋白。19.权利要求16-18任一项重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒包含重组HPIVl，其中病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是编码HPIV1N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；重组HPIV2,其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV2基因组启动子，接着是编码HPIV2N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；重组HPIV3,其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是编码HPIV3N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；重组BPIV3,其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是编码BPIV3N，P，M，F，HN，和L蛋白的基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间；或重组BHPIV3,其中毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是编码BPIV3N，P，和M蛋白，HPIV3F和HN蛋白，和BPIV3L蛋白的基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间或编码N和P蛋白的基因之间。20.权利要求16-19任一项重组副粘病毒，其包含重组BHPIV3，其中HPIV3F和HN基因和BPIV3N，P，M，和L蛋白分别包含SEQIDN0:43，101，47,48,49,52所列氨基酸序列，或分别与SEQID恥:43，101，47,48,49,52至少90%同一的序列。21.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其包含重组BHPIV3或重组HPIV3，其中病毒基因组包含编码HPIV3HN蛋白的基因，且其中该HPIV3HN蛋白分别在残基263和307处包含苏氨酸和脯氨酸。22.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中该编码RSVF外域的异源基因为了人细胞中的表达而密码子优化的。23.权利要求22的重组副粘病毒，其包含：重组HPIV3,其中该异源基因包含SEQIDNO:lUGSRSVF_HEK_DS-Cavl_H3TMCT所列核苷酸序列；重组BHPIV3,其中该异源基因包含SEQIDNO:llGSRSVF_HEK_DS-Cavl_H3TMCT所列核苷酸序列;或重组BHPIV3,其中该异源基因包含SEQIDNO:22GARSVF_HEK_DS-Cavl_B3TMCT或SEQIDNO:23®SRSVF_HEK_DS-Cavl_B3TMCT所列核苷酸序列；重组BHPIV3,其中该异源基因包含SEQIDN0:20GARSVF_HEK_DS_B3TMCT或SEQIDNO:137®SRSVF_HEK_DS_B3TMCT所列核苷酸序列。24.权利要求1的重组副粘病毒，其包含：重组HPIVl，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的；重组HPIVl，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIVlF蛋白的TM和CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190FjP207L替代且是与BPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的TM和CT连接的；重组HPIVl，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIVlF蛋白的CT连接的；重组HPIVl，且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIVl基因组启动子，接着是HPIV1N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV1F蛋白的CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组HPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含HPIV3基因组启动子，接着是HPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组BPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组BPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，M，F，HN，和L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与BPIV3F蛋白的CT连接的；重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于基因组启动子和编码N蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的；或重组BHPIV3,且其中病毒基因组从上游到下游包含BPIV3基因组启动子，接着是BPIV3N，P，和M基因，HPIV3F和HN基因，和BPIV3L基因，且其中该编码重组RSVF外域的异源基因位于编码N和P蛋白的基因之间，且其中该RSVF外域包含66E，101P，155C，290C，190F，和207L替代且是与HPIV3F蛋白的CT连接的。25.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中：该HPIVl包含Ca17q或LY942a减毒突变；该HPIV3是HPIV3JS株；该HPIV3包含HN蛋白中的I263T和T370P替代;或该BHPIV3包含HN蛋白中的I263T和T370P替代。26.在前权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该重组RSVF外域包含RSVF位置1-529；特别是，其中该重组RSVF外域包含与SEQIDN0:21残基1-529至少90%同一的氨基酸序列；特别是，其中该重组RSVF外域包含与SEQIDNO:21残基1-529至少95%同一的氨基酸序列;和特别是，其中该重组RSVF外域包含SEQIDNO:21残基1-529的氨基酸序列。27.权利要求1的重组副粘病毒，其包含rBHPIV3-F2-HEKGS-〇ptDS-CavlB3TMCT，进一步包含HN蛋白中的I263T和T370P替代。28.—种重组副粘病毒，其包含a包含异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的跨膜域TM和胞质尾CT连接的异源病毒的I型跨膜蛋白的外域;或b包含异源基因的病毒基因组，该异源基因编码与副粘病毒的HN蛋白的TM和CT连接的异源病毒的Π型跨膜蛋白的外域。29.权利要求28的重组副粘病毒，其中：该异源基因编码与副粘病毒的F蛋白的胞质尾CT，或跨膜域TM和CT连接的重组呼吸道合胞病毒RSVF外域，且其中该重组副粘病毒是重组人牛副流感病毒3BHPIV3，重组人副流感病毒1HPIVl，重组人副流感病毒2HPIV2，重组人副流感病毒3HPIV3，重组牛副流感病毒3BPIV3，重组PIV5，重组仙台病毒，或重组新城疫病毒。30.在前权利要求任一项重组副粘病毒，其中由感染有该重组副粘病毒或病毒载体的宿主细胞生成的病毒颗粒至少90%包含包含由该异源基因编码的外域的病毒包膜。31.在先权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该重组副粘病毒是感染性，减毒，和自我复制性病毒。32.在先权利要求任一项的重组副粘病毒，其中该RSVF外域是存在于副粘病毒的病毒包膜上。33.—种免疫原性组合物，其包含在前权利要求任一项重组副粘病毒和药学可接受载剂。34.权利要求33的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。35.—种在受试者中引发针对RSVF蛋白的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的权利要求33或权利要求34的免疫原性组合物。36.—种在受试者中引发针对呼吸道合胞病毒和副流感病毒的免疫应答的方法，其包含对该受试者施用治疗有效量的权利要求33或权利要求34的免疫原性组合物。37.权利要求35或权利要求36的方法，其中该免疫应答是保护性免疫应答。38.权利要求35-37任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的初始-加强施用。39.权利要求35-38任一项的方法，其包含该免疫原性组合物的鼻内或胃肠外施用。40.权利要求35-39任一项的方法，其中该受试者是人或兽医受试者。41.权利要求35-40任一项的方法，其中该受试者具有RSV或PIV感染或处于其风险。42.权利要求35-41任一项的方法，其中该受试者小于1岁龄。43.权利要求35-41任一项的方法，其中该受试者是免疫受损的或是年老的。44.一种核酸分子，其包含权利要求1-32任一项的重组副粘病毒的基因组。45.—种重组RSVF外域，其包含K66E和QlOlP氨基酸替代，且任选进一步包含a-d之一：aS155C和S290C;bS190F；cV207L;或da和b;a和c;b和c;或a，（b，和c的组合。46.一种核酸分子，其编码权利要求44的重组RSVF外域。47.权利要求1-32任一项的重组副粘病毒在受试者中引发针对RSV，或RSV和PIV的免疫应答的用途。

百度查询： 美利坚合众国，由健康及人类服务部部长代表 表达嵌合RSV/BPIV3F蛋白的重组人/牛副流感病毒3(B/HPIV3)及其用途

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