申请/专利权人：南方医科大学

申请日：2019-04-28

公开（公告）日：2019-07-19

公开（公告）号：CN110025618A

主分类号：A61K31/44(20060101)

分类号：A61K31/44(20060101);A61K31/357(20060101);A61K9/20(20060101);A61K9/19(20060101);A61K47/69(20170101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.12.02#发明专利申请公布后的驳回;2019.08.13#实质审查的生效;2019.07.19#公开

摘要：本发明公开了一种青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备治疗AKTc‑Myc激活的人肝癌Huh7细胞的药物中的应用。青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备治疗AKTc‑Myc激活的肝癌Huh7细胞的药物中的应用，所述青蒿琥酯能够降低p‑AKT、c‑Myc的蛋白水平，从而抑制肝癌Huh7细胞增殖，所述青蒿琥酯与索拉非尼组合通过降低p‑AKT、c‑Myc的蛋白水平，进一步更加抑制肝癌Huh7细胞生长。因此，青蒿琥酯和索拉非尼组合可作为抗人肝癌细胞增殖的候选药物进行研究和开发。

主权项：1.青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备AKTc-Myc激活的肝癌Huh7细胞药物的应用，其特征在于：所述青蒿琥酯降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，抑制肝癌Huh7细胞增殖，所述青蒿琥酯与索拉非尼组合通过降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，进一步抑制肝癌Huh7细胞生长。

全文数据：青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备AKTc-Myc激活的肝癌Huh7细胞药物的应用技术领域本发明涉及一种肝癌治疗药物，属于生物制药技术领域，具体涉及青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备治疗AKTc-Myc激活的Huh7细胞的药物中的应用。背景技术肝细胞肝癌Hepatocellularcarcinoma，HCC是肝脏最常见的恶性肿瘤之一，是死亡率世界第二的重大癌症。肝癌起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，不易被发现，仅40％病人能在早期被发现。大多数患者确诊时已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，严重威胁着人们健康。青蒿琥酯是我国经典的抗疟药物，是青蒿素的一种衍生物，其英文名称为Artesunate，分子式为C19H28O8，分子量384.42，化学结构式如式I，无色，味苦。研究显示，青蒿琥酯还具有抗肿瘤的特性。索拉非尼Sorafenib是目前临床针对晚期肝癌患者的唯一靶向药物。索拉非尼是第一个也是唯一被美国食品与药品监督管理局和欧洲药品管理局批准并被用来治疗晚期肝癌的一线药物。两药联合应用在肝癌治疗方面。国内、外报道较少。探索疗效好、安全性高，更适合晚期肝细胞癌患者的全身治疗方案具有重要的临床指导意义。索拉非尼英文名称为sorafenib，分子式为：C21H16ClF3N4O3，分子量464.825，化学结构式如式Ⅱ。发明内容为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种青蒿琥酯与索拉非尼组合在AKTc-Myc激活的Huh7细胞药物中的应用，是一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备抗肿瘤中的应用。本发明是通过如下技术方案实现的：青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备治疗AKTc-Myc激活的Huh7细胞的药物中的应用，所述青蒿琥酯能够降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，从而抑制肝癌Huh7细胞增殖，所述青蒿琥酯与索拉非尼组合通过降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，进一步更加抑制肝癌Huh7细胞生长。本发明所述的应用，所述青蒿琥酯是从菊科植物黄花蒿Artemisiaannual中提取，分子式为C19H28O8，为二氢青蒿素-10α-丁二酸单酯，按无水物计算，含C19H28O8应为98.0％～102.0％，属于白色结晶性粉末，无臭味苦，在乙醇、丙酮或二氯甲烷中易溶，加二氯甲烷使溶解并定量稀释制成每1ml中含25mg的溶液，依法测定，比旋度为+4.5°至+6.5°，pH值为3.5～4.5，其制备熔点为1290℃～1400℃，现在广泛用于治疗疟疾，毒性较小。本发明所述的应用，所述索拉非尼又称Raf抑制剂，2005年12月经美国食品药品局FDA批准作为治疗肿瘤的一线药物上市。为白色至灰色固体，分子式为C21H16ClF3N4O3，热稳定性良好，不吸水，略溶于乙醇，溶于聚乙烯甘油400，熔点为202℃-204℃。本发明所述的应用，所述青蒿琥酯与索拉非尼组合，青蒿琥酯的浓度≥12.5μmol·L-1，索拉非尼的浓度≥2.5μmol·L-1，所述组合药物可制成片剂，其制备方法为：1称取青蒿琥酯12.5g、索拉非尼2.5g，淀粉8.0g、糊精12.0g，加入研钵中研磨混匀；2将0.4g的酒石酸溶于50％乙醇中，按适宜量多次加入混合粉末中，加入时分散面要大，混合均匀，制成软材；3通过18～20目尼龙筛制成湿粒，60℃以下干燥，近干时可升至70℃以下，加速干燥，干粒水份控制在1.5％以下；4通过20目筛出整粒，与0.4g过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，计算含量，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿琥酯索拉非尼片。本发明所述的应用，所述组合药物可制成冻干粉针剂，其制备方法为：1溶胀羟丙基倍他环糊精：称取180g羟丙基倍他环糊精，置于1L烧杯中，加入400ml注射用水，于50℃水浴中磁力搅拌转速500rpm3h，溶胀，备用。2制备包合物：称取2.5g索拉非尼与12.5g青蒿琥酯，置于2L烧杯中，加入溶胀好的羟丙基倍他环糊精溶液，800rpm搅拌10min直至溶解。3调节pH加入72g甘露醇，继续搅拌至溶解后，以1molL盐酸调节溶液的pH值到10.1，用注射用水将溶液定容至900ml。4除热原加入900mg活性炭，500rpm磁力搅拌吸附30min后，0.22μm微孔滤膜过滤。5灌装，冻干，轧盖，即得青蒿琥酯索拉非尼冻干粉针剂。本发明具有如下优点和有益技术效果：1本发明发现青蒿琥酯对人肝癌Huh7细胞具有抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性，细胞活力实验结果显示，在同一作用时间的青蒿琥酯浓度越高，对细胞的增殖抑制率越高；细胞克隆形成实验结果显示：青蒿琥酯对人肝癌Huh7细胞增殖具有明显的抑制作用，当青蒿琥酯浓度为6.25μM时，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着青蒿琥酯浓度增大，抑制效果越好。2本发明发现青蒿琥酯能够通过降低P-AKT、c-Myc的表达，进而抑制人肝癌Huh7细胞增殖。3本发明发现青蒿琥酯与索拉非尼组合能够更加抑制人肝癌Huh7细胞增殖，细胞克隆形成实验结果显示：当青蒿琥酯12.5μM、索拉非尼2.5μM时，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着索拉非尼浓度的增大，抑制效果越好。4本发明发现青蒿琥酯与索拉非尼组合能够通过降低P-AKT、c-Myc的蛋白表达，进而抑制人肝癌Huh7细胞增殖，增加索拉非尼的敏感度。5本发明为研制新的抗肿瘤候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：图1为实施例1中细胞活力实验检测不同浓度的青蒿琥酯在不同时间下对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用图；图2为实施例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的青蒿琥酯对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用图；图3为实施例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的青蒿琥酯对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用定量图；图4为实施例2中Westernblot检测青蒿琥酯对AKTc-Myc蛋白水平的影响图。图5为实施例2中Westernblot检测青蒿琥酯对AKTc-Myc蛋白水平的影响定量图。图6为实施例3中细胞活力实验检测不同浓度的索拉非尼与青蒿琥酯组合对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用图。图7为实施例3中细胞克隆形成实验检测青蒿琥酯与索拉非尼药物组合对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用图。图8为实施例3中细胞克隆形成实验检测青蒿琥酯与索拉非尼药物组合对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用定量图。图9为实施例4中Westernblot检测青蒿琥酯与索拉非尼组合对AKTc-Myc蛋白表达水平的影响图。图10为实施例4中Westernblot检测青蒿琥酯与索拉非尼组合对AKTc-Myc蛋白表达水平的影响定量图。具体实施方式下面结合具体实施列和图表详细说明本发明的技术方案，但本发明并不仅限于以下的实施例。青蒿琥酯现在已经广泛用于治疗疟疾，具有广泛的生物药理活性，其中抗肿瘤活性受到许多研究者的关注。索拉非尼为晚期治疗肝癌的唯一靶向药物，但由于先天获得性耐药，延长患者生命有限，青蒿琥酯发挥特定抗癌活性的机制仍不清楚，这可能与索拉非尼组合成为新的抗肝癌候选药物。本发明探索了青蒿琥酯对肝癌细胞Huh7的抑制作用，及发现抗肝癌作用机制，为增加索拉非尼肝癌药物敏感度提供基础，为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为青蒿琥酯在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。本发明提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备抗肿瘤中的应用。具体涉及青蒿琥酯与索拉非尼组合降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，从而抑制肝癌Huh7细胞增殖。本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、Westernblot实验研究青蒿琥酯与索拉非尼组合对人肝癌Huh7抑制作用。各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。其中，青蒿琥酯购买于美国sigma公司，产品型号为A3731，青蒿琥酯含量为98％，索拉非尼购买于美国sigma公司，产品型号为A7397，索拉非尼含量为98％，体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞Huh7，来源于美国ATCC细胞库。实施例1将青蒿琥酯与索拉非尼组合的药物制成片剂，其制备方法为：1称取青蒿琥酯12.5g、索拉非尼2.5g，淀粉8.0g、糊精12.0g，加入研钵中研磨混匀。2将0.4g的酒石酸溶于50％乙醇中，按适宜量多次加入混合粉末中，加入时分散面要大，混合均匀，制成软材。3通过18～20目尼龙筛制成湿粒，60℃以下干燥，近干时可升至70℃以下，加速干燥，干粒水份控制在1.5％以下。4通过20目筛出整粒，与0.4g过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，计算含量，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿琥酯索拉非尼片。给药方式：成人常用量：口服给药，一次4～6片，一日2次。注意事项：妊娠早期慎用。实施例2将青蒿琥酯与索拉非尼组合的药物制成冻干粉针剂，其制备方法为：1溶胀羟丙基倍他环糊精称取180g羟丙基倍他环糊精，置于1L烧杯中，加入400ml注射用水，于50℃水浴中磁力搅拌转速500rpm3h，溶胀，备用；2制备包合物称取2.5g索拉非尼与12.5g青蒿琥酯置于2L烧杯中，加入溶胀好的羟丙基倍他环糊精溶液，800rpm搅拌10min直至溶解；3调节pH加入72g甘露醇，继续搅拌至溶解后，以1molL盐酸调节溶液的pH值到10.1，用注射用水将溶液定容至900ml；4除热原加入900mg活性炭，500rpm磁力搅拌吸附30min后，0.22μm微孔滤膜过滤；5灌装，冻干，轧盖，即得青蒿琥酯索拉非尼冻干粉针剂；给药方法：静脉注射，每天注射100mg，连续注射3日。注意事项：妊娠早期慎用。效果试验例1检测不同浓度的青蒿琥酯在不同时间下对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用。一CellViabilityAssay法测定细胞增殖将Huh7细胞从培养箱取出，消化，离心，计数，以3000个细胞接种于96孔板中，每孔100μl培养基。培养24h后，加入相应的药物，青蒿琥酯浓度分别为0、12.5、25、50、100μmolL，每组设5个复孔，继续培养24h、48h、72h后，在相应的时间取出，加入活性试剂CellTiter-LuminescentAssay，用酶标仪进行Luminescent细胞活性检测。计算细胞的存活率。细胞的存活率＝A加药组A空白对照组；细胞活力实验结果显示：由图1可见，不同浓度的青蒿琥酯0、12.5、25、50、100μM处理人肝癌Huh7细胞株，用CellTiter-LuminescentCellViabilityAssay检测了青蒿琥酯作用24h、48h、72h后细胞存活率。结果表明，青蒿琥酯对人肝癌Huh7细胞株存活率呈时间和浓度依赖性。二细胞克隆形成实验1当细胞生长到对数期，用胰酶消化后，用细胞计数仪测出细胞的数量；2准备干净的6孔板，每孔铺细胞数为5000个；3培养24h后，加入青蒿琥酯药物，浓度为0、12.5、25、50、100μmol·L-1，在37℃、5％CO2的培养箱中培养一周7天，取出用结晶紫染色，每孔加入500μL结晶紫染料，置于摇床上30分钟进行染色；4用PBS清洗3次，每次五分钟，晾干，观察后拍照；5每孔加入1mL10％冰醋酸，置于摇床上30分钟进行脱色；6每孔取100μL置于96孔板中，酶标仪测量550nm下的吸光度；7数据统计：细胞克隆形成率＝A加药组A空白组。细胞克隆结果显示：由图2和图3可见，与空白对照组相比较，肝癌细胞Huh7经过青蒿琥酯处理一周，观察细胞克隆的形成情况，随着浓度的增加，形成的克隆数量减少。在Huh7细胞12.5μmol·L-1的时候细胞明显抑制了，只有少数的克隆形成。效果试验例2Westernblot检测青蒿琥酯对AKT信号通路蛋白表达的变化。考察的相关蛋白有：P-AKT、AKT、c-Myc。Huh7细胞经不同浓度的青蒿琥酯处理后，用冰的PBS洗涤3次，加入200μl的RIPA细胞裂解液含有蛋白酶抑制剂，用细胞刮将细胞刮下，收集至1.5mlEP管中，插入冰里裂解1h，期间颠倒几次使细胞裂解充分。裂解后的细胞离心12000rpm，20min，4℃后取上清用BCA测定其蛋白浓度，与上样缓冲液混合，97℃煮沸10min，使蛋白变性。取样20μl，SDS-聚丙烯酰胺恒压100v电泳分离蛋白，随后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，洗涤4遍，每次10min，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤4次后加入二抗1：3000-1：5000室温孵育60min，TBST洗涤4次，加入ECL发光液曝光。显影液1：1现用现配，使用时滴在膜上覆盖住膜即可，暗室压片，自动洗片机显影、定影。以上实验重复三次。蛋白结果显示：如图4和图5可见，与空白对照组相比较，加入青蒿琥酯后，Huh7细胞内的p-AKT、c-Myc的蛋白水平下调，差异具有统计学意义P＜0.05，从而抑制人肝癌细胞Huh7细胞增殖。效果试验例3检测不同浓度的索拉非尼与青蒿琥酯组合对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用。一CellTiter-LuminescentAssay细胞活力检测将Huh7细胞从培养箱取出，消化，离心，计数，以3000个细胞接种于96孔板中，每孔100μl培养基。培养24h后，加入相应的药物，索拉非尼浓度为0、0.5、1、2.5、5μmolL，青蒿琥酯12.5μmolL与索拉非尼0、0.5、1、2.5、5μmolL联合使用，每组设5个复孔，继续培养24h、48h、72h后，在相应的时间取出，加入活性试剂CellTiter-LuminescentAssay，用酶标仪进行Luminescent细胞活性检测。计算细胞的存活率。细胞存活率＝A药物A对照；细胞活力结果显示：使用不同浓度的索拉非尼，浓度为0、0.5、1、2.5、5μM，根据前面试验例1的青蒿琥酯的活性结果我们选择了青蒿琥酯的浓度12.5μM，处理48h之后，用LuminescentCellViabilityAssay检测细胞活性，与索拉非尼单独处理相比较，青蒿琥酯和索拉非尼联合使用时细胞的活性被更加显著性抑制，呈现出一定的浓度依赖性如图6所示。当青蒿琥酯12.5μM，索拉非尼2.5μM时，细胞抑制率达到50％以上，实验表明青蒿琥酯能够有效的联合索拉非尼抑制肝癌细胞的生长，接下来试验将选用青蒿琥酯12.5μM与索拉非尼2.5μM组合。二细胞克隆形成实验当细胞生长到对数期，用胰酶消化后，用细胞计数仪测出细胞的数量，准备干净的6孔板，每孔铺细胞数为5000个。培养24h后，加入相应的药物，分别为青蒿琥酯12.5μM、索拉非尼2.5μM、青蒿琥酯与索拉非尼组合12.5μM+2.5μM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养一周7天，取出用结晶紫染色，每孔加入500μL结晶紫染料，置于摇床上30分钟进行染色，用PBS清洗3次，每次五分钟，晾干，观察后拍照，每孔加入1mL10％冰醋酸，置于摇床上30分钟进行脱色，每孔取100μL置于96孔板中，酶标仪测量550nm下的吸光度。数据统计：细胞克隆形成率＝A加药组A对照组；细胞克隆结果显示：细胞培养一周，见图7和图8可见，与空白对照组、单用青蒿琥酯和单用索拉非尼组比较，青蒿琥酯与索拉非尼组合后作用于人肝癌细胞Huh7显著受到抑制。效果试验例4Westernblot检测青蒿琥酯与索拉非尼组合对AKTc-Myc蛋白表达的变化。Huh7细胞经不同浓度的索拉非尼和青蒿琥酯处理后，用冰的PBS洗涤3次，加入200μl的RIPA细胞裂解液含有蛋白酶抑制剂，用细胞刮将细胞刮下，收集至1.5mlEP管中，插入冰里裂解1h，期间颠倒几次使细胞裂解充分。裂解后的细胞离心12000rpm，20min，4℃后取上清用BCA测定其蛋白浓度，与上样缓冲液混合，97℃煮沸10min，使蛋白变性。取样20μl，SDS-聚丙烯酰胺恒压100v电泳分离蛋白，随后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，洗涤4遍，每次10min，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤4次后加入二抗1：3000-1：5000室温孵育60min，TBST洗涤4次，加入ECL发光液曝光。显影液1：1现用现配，使用时滴在膜上覆盖住膜即可，暗室压片，自动洗片机显影、定影。蛋白结果显示：对Huh7细胞单独作用和联用，分别为索拉非尼2.5μM，青蒿琥酯12.5μM和青蒿琥酯与索拉非尼组合处理48h之后，通过westernblot显影检测如图9和图10所示。由图9和图10结果显示，与单独使用相比，两种药物联合使用后p-AKT和c-Myc的表达量显著降低。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

权利要求：1.青蒿琥酯与索拉非尼组合在制备AKTc-Myc激活的肝癌Huh7细胞药物的应用，其特征在于：所述青蒿琥酯降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，抑制肝癌Huh7细胞增殖，所述青蒿琥酯与索拉非尼组合通过降低p-AKT、c-Myc的蛋白水平，进一步抑制肝癌Huh7细胞生长。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿琥酯是从菊科植物黄花蒿Artemisiaannual中提取，分子式为C19H28O8，为二氢青蒿素-10α-丁二酸单酯，按无水物计算，含C19H28O8应为98.0％～102.0％，属于白色结晶性粉末，无臭味苦，在乙醇、丙酮或二氯甲烷中易溶，加二氯甲烷使溶解并定量稀释制成每1ml中含25mg的溶液，依法测定，比旋度为+4.5°至+6.5°，pH值为3.5～4.5，其制备熔点为1290℃～1400℃。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述索拉非尼又称Raf抑制剂，为白色至灰色固体，分子式为C21H16ClF3N4O3，略溶于乙醇，溶于聚乙烯甘油400，制备熔点为202℃～204℃。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿琥酯与索拉非尼组合，青蒿琥酯的浓度≥12.5μmol·L-1，索拉非尼的浓度≥2.5μmol·L-1。5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述组合药物可制成片剂，其制备方法为：1称取青蒿琥酯12.5g、索拉非尼2.5g，淀粉8.0g、糊精12.0g，加入研钵中研磨混匀；2将0.4g的酒石酸溶于50％乙醇中，按适宜量多次加入混合粉末中，加入时分散面要大，混合均匀，制成软材；3通过18～20目尼龙筛制成湿粒，60℃以下干燥，近干时可升至70℃以下，加速干燥，干粒水份控制在1.5％以下；4通过20目筛出整粒，与0.4g过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，计算含量，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿琥酯索拉非尼片。6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述组合药物可制成冻干粉针剂，其制备方法为：1溶胀羟丙基倍他环糊：精称取180g羟丙基倍他环糊精，置于1L烧杯中，加入400ml注射用水，于50℃水浴中磁力搅拌转速500rpm3h，溶胀，备用；2制备包合物称取2.5g索拉非尼与12.5g青蒿琥酯，置于2L烧杯中，加入溶胀好的羟丙基倍他环糊精溶液，800rpm搅拌10min直至溶解；3调节pH加入72g甘露醇，继续搅拌至溶解后，以1molL盐酸调节溶液的pH值到10.1，用注射用水将溶液定容至900ml；4除热原加入900mg活性炭，500rpm磁力搅拌吸附30min后，0.22μm微孔滤膜过滤；5灌装，冻干，轧盖，即得青蒿琥酯索拉非尼冻干粉针剂。

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