申请/专利权人：贵州大学

申请日：2019-08-31

公开（公告）日：2019-10-25

公开（公告）号：CN110373482A

主分类号：C12Q1/6888(20180101)

分类号：C12Q1/6888(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2024.01.12#发明专利申请公布后的驳回;2019.11.19#实质审查的生效;2019.10.25#公开

摘要：本发明公开了“一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记”，其特征在于：结构变异SV426位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chr8：12879574‑12879999，缺失片段长度为426bp，处于LCORL基因内含子4中，结构变异SV426的缺失基因型定义为D，正常不缺失的基因型定义为I，大白猪I基因的频率显著高于贵州地方猪品种，可作为鉴别大白猪和贵州地方猪品种的分子标记。

主权项：1.一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记，其特征在于：该结构变异中所述的缺失片段长度为426bp，序列是SEQIDNo.3，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chr8：12879574-12879999，在配体依赖性核受体抑制因子样基因内含子4中；将结构变异SV426存在的两种基因命名为I或D，分别对应II、ID和DD基因型。

全文数据：一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记技术领域本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种鉴别大白猪和贵州地方猪种的结构变异分子标记技术。背景技术家猪起源于野猪，在长期的驯化过程中，由于自然环境、地理位置以及社会需求等因素，品种之间产生丰富的差异。据《中国畜禽遗传资源志-猪志》2011年记载，中国地方猪品种共有76个，依据体型外貌、生长性能、繁殖性能以及起源分布等特点，可以划分为6种类型，包括华北型、华中型、华南型、西南型、江海型和高原型。贵州地方猪种属于西南型猪种，包括香猪、柯乐猪、黔北黑猪、江口萝卜猪等，这些品种经过漫长的驯化培育，形成各具特色的贵州地方猪品种。与欧洲猪品种如大白猪相比，中国地方猪种在表型上存在较大的差异Rubinetal.,2012，欧洲猪种生长速度较快、瘦肉率较高，而中国地方猪种生长速度缓慢、瘦肉率低，但其繁殖能力高、抗逆性较强、肉质好，具有重要的经济价值。贵州地方猪种与欧洲猪种各具特色的性状，是人们选育新品系猪的基础。如何区分地方猪品种和欧洲商品猪，特别是在地方猪群体中甄别有没有欧洲猪血统的掺入，当前缺乏准确的检测技术。猪在长期的进化和选择过程中，基因组中也产生了丰富的遗传变异，遗传变异可分为序列多态性和结构变异两种类型。序列多态性主要指单核苷酸多态性、小片段的插入、缺失变异以及简单序列重复和转座子序列等。结构变异structuralvariations，SVs是由于序列产生大量的核酸变异，导致基因组重新排列，有助于生物个体适应性产生Nooretal.,2001；Rieseberg2001。基因组结构变异的数量虽然少于单核苷酸多态性，但其影响的碱基总数比单核苷酸要多，对整个基因组的影响更大。基因发生结构变异的区域，可能影响基因的表达，从而影响猪的表型。如猪8号染色体上KIT基因，KIT基因发生结构变异与猪的毛色有着密切的关系，白色毛的猪主要是由于KIT基因两处结构变异引起的，一处变异是KIT整个基因发生串联重复，另外一处是第17外显子发生缺失Seoetal.,2007；Rubinetal.,2012；公猪TEX14序列中51bp的插入缺失能够引起公猪不育SironenAetal.,2011。利用二代测序对13头猪进行测序，发现中国猪种的X染色体上存在一个结构变异的热点区域，此区域包含与生长、繁殖和免疫相关的基因，可能是欧亚猪种之间表型差异的原因Zhaoetal.,2016。我们通过对香猪基因组进行重测序，并与猪参考基因组Sscrofa11.1进行比较从中发现了一个结构变异SV426。本发明所述的结构变异SV426位于LCORL基因内含子4中，区间为chr8：12879574-12879999。LCORL基因编码产生一种转录因子，会影响骨骼的框架大小，在马和牛等动物的研究中将其作为影响体尺的候选基因Tetensetal.,2013；Pryceetal.,2011。LCORL基因高表达于哺乳动物的睾丸组织中，尤其在细精管和精母细胞中，可能在精子的发生过程中起作用范家萌，2015。发明内容本发明要解决的技术问题是：提供一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的结构变异SV426分子标记。本发明的技术方案是：一种在大白猪中以正常不缺I为主的结构变异SV426，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chr8：12879574-12879999，LCORL基因内含子4中，将结构变异SV426存在的两种等位基因命名为I或D，分别对应II、ID和DD三种基因型。本发明还提供用于检测结构变异SV426的一对引物，所述的引物分别为：上游引物LCORL-F：5’-CCAAGCATTGTGAAATCTGTGAG-3’，下游引物LCORL-R：5’-GTGCATAAAGAGTGCTTACCCTGTA-3’，该引物扩增获得两种序列，分别是SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。本发明还提供所述结构变异SV426在不同猪品种群体中的检测方法。该方法包括以下步骤：1提取待测猪品种的基因组DNA；2以待测样品基因组DNA为模板，利用引物LCORL-F和LCORL-R进行PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以凝胶成像系统分析判断待测样品的基因型。步骤2中进行PCR扩增的体系为20μL：2×TaqPCRMasterMix10μL，10μmoLL上游和下游引物LCORL-F和LCORL-R各0.2μL，ddH2O8.6μL，10ngμL基因组DNA1μL；PCR反应条件：4.95.0℃5min；2扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：60℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min，4℃保存。本发明进一步提供所述结构变异SV426鉴别大白猪和贵州地方猪品种群体的分子标记的应用技术。前述的应用包括以下步骤：1应用PCR技术检测结构变异SV426在大白猪和4个贵州地方猪种中的基因型分布情况。2采用SPSSv20.0进行基因频率的差异显著性检验分析，分析结构变异SV426在大白猪和4个贵州地方猪品种之间的差异。3根据结构变异SV426的基因型辅助鉴别大白猪和4个贵州地方猪品种。本发明的有益效果：1本发明所述的结构变异SV426不受猪品种的年龄、性别、饲养条件等因素的限制。2本发明建立的区分大白猪和贵州地方猪品种结构变异SV426的方法准确可靠，操作简便。3结构变异SV426分子标记，可为大白猪和贵州地方猪品种的分子标记辅助选育技术奠定技术基础。附图说明图1为本发明实施例1中结构变异SV426的基因分型结果,M:DL2000DNAMarker；1-2:II型；3-4:ID型；5-6:DD；图2为本发明实施例2中大白猪与4个贵州地方猪品种结构变异SV426基因频率。具体实施方式以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。实施例1猪结构变异SV426的检测技术，步骤如下：1、基因组DNA的提取本发明采用天根生化科技北京有限公司生产的血液细胞组织基因组DNA提取试剂盒离心柱型提取基因组DNA，具体方法如下：1血液基因组DNA提取操作步骤：1取300μL猪的血液放置1.5mL离心管中，向其中加入900μL1×ERL溶液，上下颠倒数次，室温放置5min，以裂解红细胞。212000rpm，离心1min，弃上清，留100μL残余液，加入两倍体积的1×ERL溶液。如果样品被冰冻，且红细胞裂解效果不佳，可反复操作1-2次，直到沉淀为白色为止。3在震荡器上剧烈震动，或用加样器反复吹打，充分的悬浮白细胞。4在向其中加入300μLWTL溶液，使用加样器反复吹打，以裂解白细胞，混均匀后，37℃恒温水浴放置15-30min，直至细胞完全溶解。5在细胞裂解液中加入1.5μLRNaseA溶液，上下翻转20-25次，混均匀后，37℃恒温水浴放置30min。6放至室温，向离心管中加入100μLPCPbuffer，沉淀蛋白。7高速震荡30s混匀，这时一些蛋白絮状沉淀可见，上下翻转数次，置于冰上5-10min。812000rpm，高速离心2min，蛋白质沉淀于管底。9将上清液移至新的1.5mL离心管，加入300μL异丙醇，温和的上下翻转30次，使DNA沉淀。1012000rpm离心1min，倒掉上清液，加入100μL70％乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心2min，室温小心的弃上清，防止DNA被倒掉。11把1.5mL离心管倒置于干净的吸水纸上，使乙醇挥发12加入80μLBufferEB65℃预热10min，37℃溶解过夜。-20℃保存。2耳组织基因提取1从组织保存液取出耳，并用吸水纸干分，剪碎放入研钵。倒入液氮，碾磨成粉末，转入到1.5mL离心管，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。向上述1.5mL离心管加入4μLRNaseA100mgmL溶液，混匀后振荡15s，室温放置5min。2加20mgmL蛋白酶K，55℃水浴消化12h，间歇震荡数次。3经蛋白酶K消化后，向其中加入200μL缓冲液GB，充分颠倒数次，使其混合均匀，70℃放置10min。4在加入200μL无水乙醇，迅速振荡，避免出现絮状沉淀混匀15s。5将经过无水乙醇洗涤后的溶液倒入吸附柱CB3中，12000rpm的转速离心1min，将收集管中的废液倒掉，重新将吸附柱CB3放回收集管中。6加入500μL缓冲液GD到吸附柱CB3中，12000rpm的转速离心1min，将收集管中的废液倒掉，重新将吸附柱CB3放回收集管中。7加入600μL漂洗液PW到吸附柱CB3中，12000rpm的转速离心1min，将收集管中的废液倒掉，重新将吸附柱CB3放回收集管中。8重复操作步骤7。912000rpm的速度离心2min，将收集管中的废液倒掉，室温使吸附柱CB3中的残余液充分挥发。10将挥发完全的吸附柱CB3放入灭菌过的离心管中，将80μL洗脱缓冲液TE加入吸附膜的中间部位，在室温下放置2-5min，12000rpm的速度离心2min。11-20℃保存，用于后续目的序列扩增。2、目标序列的扩增本发明所述的结构变异SV426位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chr8：12879574-12879999，参考NCBIGenbank收录的相应序列，使用PrimerPremier5.0软件设计两条引物，上游引物LCORL-F：5’-CCAAGCATTGTGAAATCTGTGAG-3’下游引物LCORL-R：5’-GTGCATAAAGAGTGCTTACCCTGTA-3’，目的片段分别为776bp和350bp，测序后得出目的序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。PCR扩增体系为20μL：2×TaqPCRMasterMix10μL，10μmoLL上游和下游引物LCORL-F和LCORL-R各0.2μL，ddH2O8.6μL，10ngμL基因组DNA1μL；PCR的反应条件：1预变性：95.0℃5min；2扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：60℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min，4℃保存。3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断PCR扩增结束后，取5μLPCR产物经1.5％的琼脂糖电泳检测，凝胶成像系统记录条带。每个样品，若只扩增出350bp的单条带，将基因型定义为DD型；若扩增出350bp和776bp的双条带，将基因型定义为ID型；若只扩增出776bp的单条带，将基因型定义为II型图1。实施例2结构变异SV426基因型在各猪品种中的分布及检测应用按照实施例1的方法，试验材料如表1所示，以chr8：12879574-12879999为候选结构变异，命名为SV426，利用PCR技术检测5个猪品种中结构变异SV426的基因型表2和图2，应用SPSSv20.0软件中的χ2检验，分析结构变异SV426的基因频率。结果显示，大白猪中仅有II型和ID型，不存在DD型，其余4个猪种中3种基因型均检测出来。其中江口萝卜猪以DD型为主，以ID型为主的有黔北黑猪、香猪和柯乐猪，大白猪以II型为主。大白猪D等位基因频率明显低于其余4个猪种P0.05。江口萝卜猪和柯乐猪SV426位点分布不处于遗传平衡状态，黔北黑猪、香猪和大白猪处于分布平衡状态。表1试验材料及来源统计表猪品种样本数血液组织样品来源香猪147贵州省从江县柯乐猪26贵州省毕节市江口萝卜猪41贵州省铜仁市江口县黔北黑猪55贵州省遵义大白猪42贵州省毕节市表2结构变异SV426的基因型和基因频率序列表SEQIDNo.1：贵州大学一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记1776DNA结构变异SV200的II型扩增序列1CCAAGCATTGTGAAATCTGTGAGCATTGTAAACATTTGCGTGAGTTTACTCAAAATTTTT60TAAAAACTGACTGCATCCTGTGCCATTAAGAAATTACCAACAAGTAAAAACTGAGAGTAT120ACACATTTTATTTCTTGATATAATTCAGTTAAGATGGTAATAAAAAGATAACTTTAAATA180AATTTATGCAGATGGAAAGTTTATGACATTCTAAGTAATTTATGGGCTAAACAAGAAATT240CTGATGTCTATCAGAATGTATTTGGCACTGAATGATATTAAAAATACATTTAAAAATTTA300TAGAACTTAATTAGTATTTGATCAAAGGAAATTTTTATATTACTTAAAAAAAAGATTGGA360AATTTAACAAGTAAGTGAAGCATATAACTGAAGGAGTATTTTTTTTTTTTTAAGTAACCC420TAAATAAGGAGAAAGGCAAACAGAGAAGATAAGAACAAAACTTTTGAAATAAAATGCAAA480GGCAAAATAGGAGAGACAAAGTTAAATGGCTGATTTTTTTATTGGCTTTTAAAGTGTCAC540AATATGCTTGTATCTGAAATTTTACATTCTAAATTCTAGGAATTTAATGCTTCAAGGAGT600TTTCTCATTTTAAAAGCTTTTTTTCTAGATAGACTTCCCAAATTACTGTCTTTGATTTTT660TTTCCTCCTGATAAAGATTGTTTAAAAAAATAATTGCACTGTATAAAAATTAAATACTTA720GGCTCTTGCTTTTTGAGGACTATGTGATAGGTACAGGGTAAGCACTCTTTATGCAC776SEQIDNo.2：2350DNA结构变异SV426的DD型扩增序列2CCAAGCATTGTGAAATCTGTGAGCATTGTAAACATTTGCGTGAGTTTACTCAAAATTTTT60TAAAAACTGACTGCATCCTGTGGCTGATTTTTTTATTGGCTTTTAAAGTGTCACAATATG120CTTGTATCTGAAATTTTACATTCTAAATTCTAGGAATTTAATGCTTCAAGGAGTTTTCTC180ATTTTAAAAGCTTTTTTTCTAGATAGACTTCCCAAATTACTGTCTTTGATTTTTTTTCCT240CCTGATAAAGATTGTTTAAAAAAATAATTGCACTGTATAAAAATTAAATACTTAGGCTCT300TGCTTTTTGAGGACTATGTGATAGGTACAGGGTAAGCACTCTTTATGCAC350SEQIDNo.3：3426DNASV426位点缺失序列3TGCCATTAAGAAATTACCAACAAGTAAAAACTGAGAGTATACACATTTTATTTCTTGATA60TAATTCAGTTAAGATGGTAATAAAAAGATAACTTTAAATAAATTTATGCAGATGGAAAGT120TTATGACATTCTAAGTAATTTATGGGCTAAACAAGAAATTCTGATGTCTATCAGAATGTA180TTTGGCACTGAATGATATTAAAAATACATTTAAAAATTTATAGAACTTAATTAGTATTTG240ATCAAAGGAAATTTTTATATTACTTAAAAAAAAGATTGGAAATTTAACAAGTAAGTGAAG300CATATAACTGAAGGAGTATTTTTTTTTTTTTAAGTAACCCTAAATAAGGAGAAAGGCAAA360CAGAGAAGATAAGAACAAAACTTTTGAAATAAAATGCAAAGGCAAAATAGGAGAGACAAA420GTTAAA426

权利要求：1.一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记，其特征在于：该结构变异中所述的缺失片段长度为426bp，序列是SEQIDNo.3，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的chr8：12879574-12879999，在配体依赖性核受体抑制因子样基因内含子4中；将结构变异SV426存在的两种基因命名为I或D，分别对应II、ID和DD基因型。2.根据权利要求1所述的一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的结构变异SV426分子标记，其特征在于：所述的SV426分子标记的引物分别为：上游引物LCORL-F：5’-CCAAGCATTGTGAAATCTGTGAG-3’，下游引物LCORL-R：5’-GTGCATAAAGAGTGCTTACCCTGTA-3’。3.如权利要求1和2之一所述的一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的结构变异SV426分子标记的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1提取待测样品的基因组DNA；2以待测基因组DNA为模板，利用引物LCORL-F和LCORL-R进行PCR扩增；31.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统检测电泳条带并判断基因型；4根据个体基因型和SV426的等位基因频率区分大白猪和贵州地方猪品种。4.根据权利要求3所述的一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的结构变异SV426分子标记的检测方法，其特征在于：步骤2中进行PCR扩增的体系为20μL：2×TaqPCRMasterMix10μL，10μmoLL上游和下游引物LCORL-F和LCORL-R各0.2μL，ddH2O8.6μL，10ngμL基因组DNA1μL；进行PCR反应采用的条件：1预变性：95.0℃5min；2扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：60℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min，4℃保存。5.如权利要求1或2所述的一种鉴别大白猪和贵州地方猪品种的LCORL基因中结构变异SV426分子标记在鉴别大白猪和贵州地方猪品种中的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：1采用PCR技术检测该结构变异在大白猪和贵州地方猪品种群体中的分布情况；2根据判断结构变异SV426的基因型辅助鉴别大白猪和贵州地方猪品种。

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