申请/专利权人：西南大学

申请日：2019-06-19

公开（公告）日：2019-11-05

公开（公告）号：CN110408615A

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/82(20060101);C12N5/10(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/46(20180101);A01H6/82(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.17#授权;2019.11.29#实质审查的生效;2019.11.05#公开

摘要：本发明提供蜡梅CpVIN3基因启动子及其应用。本发明通过染色体步移法从蜡梅基因组DNA中克隆获得CpVIN3pro启动子，序列如SEQIDNo.1所示。将该启动子连接GUS报告基因，转化拟南芥，在转基因拟南芥的不同发育时期的各组织中均能检测到GUS活性，表明克隆到的蜡梅CpVIN3基因启动子序列CpVIN3pro能够驱动GUS基因在不同发育时期及不同组织中组成型表达，在茎尖分生区、腋芽分生区、花芽分生区有较强的GUS活性，且伴随着花朵不断发育GUS活性加强。

主权项：1.一种分离的蜡梅CpVIN3基因启动子分子，其为：1由SEQIDNo.1的核酸序列所示的多核苷酸序列组成；或2由与SEQIDNo.1的核酸序列一致性在85％以上的多核苷酸序列组成，具有1中所有的启动子元件，具有启动子活性。

全文数据：蜡梅CpVIN3基因启动子及其用途技术领域本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅CpVIN3基因的启动子及其用途。背景技术蜡梅ChimonanthuspraecoxL.Link是一种我国特有的冬季开花多年生灌木，因其色如蜜蜡，芳香馥郁而声名远播，傲雪绽放的特性使它成为深受人们喜爱的园林观赏植物，在我国几千年的历史长河中，蜡梅在苗圃和盆景中的栽培和种植别具一格。除此之外，蜡梅是第四纪冰川孑遗植物，在古老的进化系统中占据重要地位[2]。数百年来，人们对蜡梅的研究主要集中在种质资源、品种类别和栽培种植等方面，近年，随着分子生物学的蓬勃发展，人们对蜡梅的认识也逐渐转入分子水平。近年来，对蜡梅基因的分子克隆发展迅速，研究领域集中在抗逆性及开花机制等方面。此外，眭顺照等人利用EST技术构建了第一个蜡梅花的cDNA文库，就此分析蜡梅开花过程中的基因表达，以此为基础先后克隆出蜡梅花发育相关的不同基因，并分析其表达特性：如蜡梅冷适应蛋白基因Cpcor413pm1，使烟草的耐寒性得到了极大提高；蜡梅胰蛋白酶抑制基因CpKTI，使植物抗虫性增强；与植物的极性生长、抗病抗逆性、激素信号传导、活性氧的产生以及细胞的凋亡等密切相关的基因CpRAC1；胚胎发育晚期富积蛋白基因CpLEA基因，主要在种子成熟和发育阶段表达，是一类低分子量蛋白，在花粉粒或干旱、高盐或低温情况下植物根、叶中，LEA蛋白表达量显著增加。蜡梅Patatin-like蛋白基因CpPLP植物防御病虫害的一种手段，而且还能提高植物应对干旱胁迫的能力。蜡梅CpEXP1基因的表达与蜡梅花蕾脱落存在一定的相关性。热激蛋白CpHSP70-1和CpHSP70-2基因在正常情况下与应激条件下都能发挥重要的生理功能。基于对上述蜡梅基因功能的初步了解，为蜡梅基因克隆及功能的研究奠定了一定基础。现有技术已经描述了大量在植物细胞中起作用的启动子。这些启动子包括根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂氨酸nos启动子和章鱼氨酸合酶ocs启动子以及花椰菜花叶病毒caulimovirus启动子，例如花椰菜花叶病毒CaMV19S或35S启动子、具有重复增强子的CaMV35S启动子以及玄参花叶病毒FMV35S启动子。这些启动子及众多其他启动子已经用于植物中转基因表达载体的构建。尽管以前的工作已经提供了许多用于在转基因植物中指导转录的启动子，但仍然需要具有有利的表达特征的新启动子。具体而言，需要能够指导外源基因在双子叶种子中表达的启动子。完全实现所选择的基因在转基因植物中表达的利益所需的表达模式或水平不能由许多以前鉴定的启动子提供。因此，在植物基因工程领域需要用于双子叶植物的新启动子。拟南芥VIN3基因报道在其春化诱导过程中起着重要作用，蜡梅作为少有的冬季开花的香花植物，在低温积累打破休眠的条件下、已经完成花芽分化的花蕾才能正常膨大开放，因此研究蜡梅CpVIN3的启动子表达特性及功能，有助于解析蜡梅低温打破休眠导致冬季开花的分子机理，蜡梅CpVIN3启动子也可作为春化型植物打破休眠的新启动子资源，为其在基因工程领域中应用提供可能。发明内容本发明的目的是提供一种蜡梅CpVIN3基因启动及其应用。首先，本发明提供了一种分离的蜡梅CpVIN3基因启动子分子，其为：1由SEQIDNo.1的核酸序列所示的多核苷酸序列组成；或者其任何片段和变体，其能够调节可操作地连接的多核苷酸分子的转录，例如，具有启动子活性。在特定实施方案中，本申请提供的启动子分子由与SEQIDNo.1的核酸序列一致性在70％以上，优选80％以上，更优选85％以上的多核苷酸序列组成，具有1中所有的启动子元件，具有启动子活性。本发明还提供一种核酸构建体，其包含可操作性地连接到异源的可转录的多核苷酸分子的所述的启动子。在特定的实施方案中，所述的可转录的多核苷酸分子可操作地连接到3’转录终止多核苷酸分子。其中，所述可转录的多核苷酸分子是具有农学重要性的基因。其中，所述可转录的多核苷酸分子是标记基因。本发明还提供含有所述的构建体稳定转化的转基因植物细胞。在特定的实施方案中，该转基因植物是双子叶植物，优选地，所述双子叶植物选自拟南芥、蜡梅、烟草、梅花、向日葵、牡丹、芍药、茶梅和山茶等。本发明还提供一种指导可转录的多核苷酸序列在植物细胞中表达的方法，其包括将所述启动子可操作地连接到所述多核苷酸序列并用可操作地连接到该多核苷酸序列的启动子转化植物细胞。在特定的实施方案中，该方法还可进一步包括从植物细胞再生植物。本发明通过染色体步移法从蜡梅基因组DNA中克隆获得CpVIN3pro启动子，将该启动子连接GUS报告基因，转化拟南芥，在转基因拟南芥的不同发育时期的各组织中均能检测到GUS活性，表明克隆到的蜡梅CpVIN3基因启动子序列CpVIN3pro能够驱动GUS基因在不同发育时期及不同组织中组成型表达，在茎尖分生区、腋芽分生区、花芽分生区有较强的GUS活性，且伴随着花朵不断发育GUS活性加强。表明CpVIN3可能参与植物成花诱导，CpVIN3pro能为需要春化诱导开花的植物提供新的启动子资源。附图说明图1所示为CpVIN3pro的序列分析。图2所示为CpVIN3基因启动子序列克隆。M:DNAMarkerDL2000；1-4:CpVIN3DNA扩增产物。图3所示为重组载体检测。M:DNAmarkerDL20001-5：重组载体6：阴性对照。图4所示为表达载体pBI121-CpVIN3pro::GUSHindIII和BamHI的双酶切验证。M:MarkerDL2000；1-2表达载体质粒pBI121-CpVIN3pro::GUS。图5所示为电转农杆菌的PCR鉴定。M：DNAmarkerDL20001-10：阳性菌落。图6所示为烟草叶片GUS瞬时表达检测。图7所示为CpVIN3基因启动子T2代转基因拟南芥GUS组织化学染色。A:六叶期植株；B:抽葶约1cm植株；C:开花后植株；D:花；E:雌雄蕊；F:果荚；G:开花后-茎；H:开花后-根；I:抽葶约1cm时花序；J:开花后花序；K:雌雄蕊。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1染色体步移法扩增CpVIN3基因上游启动子序列1根据克隆得到的蜡梅CpVIN3序列，对序列片段进行比对分析，通过Editseq寻找确定ORF框再次进行BLAST，获得目标启动子，并初步确认其功能属性。2酶切基因组DNA与衔接头的连接用4种不同限制性内切酶消化蜡梅基因组DNA，将酶切处理并纯化的基因组DNA与试剂盒的上、下游基因组步移衔接头在T4DNA连接酶催化下，在16℃水浴中进行连接反应，4种不同限制性内切酶消化的基因组DNA及与衔接头连接后的产物即为蜡梅基因组DNA的DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ酶切亚文库。以GSP1GACCCGTCACTACCCGAGAGTCTAAAAC和针对衔接头序列的引物AP1GTAATACGACTCACTATAGGGC进行PCR扩增，所用试剂盒为UniversalGenomeWalkerTM2.0试剂盒Clontech公司，Cat.No.636405040314，反应体系为25μL，包括10×LA聚合酶缓冲液2.5μL，dNTPs混合液dATP，dCTP，dGTP和dTTP各10mmolL0.5μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL，外侧引物GSP1和AP1均为10mmolL各0.5μL，DNA模板基因组文库DNA1μL，加蒸馏水至25μL。PCR反应条件：94℃预变性25s，72℃3min，7个循环；94℃25s，67℃3min，32个循环；最后67℃延伸7min。用PCR产物稀释50倍作为第二轮的模板。以GSP2GAGGCAAAATAAAAGGCCGGGTAGAG和AP2ACTATAGGGCACGCGTGGT进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括10×LA聚合酶缓冲液2.5μL，dNTPs混合液dATP，dCTP，dGTP和dTTP各10mmolL0.5μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL，GSP2和AP2均为10mmolL各0.5μL，稀释模板1μL，加蒸馏水至25μL。PCR反应条件：94℃预变性25s，72℃3min，5个循环，94℃25s，67℃3min，20个循环；最后67℃延伸7min。分别取预扩增PCR产物、第一轮PCR扩增产物及第二轮PCR扩增产物5μL，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳观察，并确定可能的正确条带。回收目的条带，连接克隆载体pMD19-T，CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组子PCR鉴定，将PCR反应所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。将能够扩增出目的大小片段的菌液送往擎科公司进行测序，最后再运用SeqMan软件对测序结果进行分析。通过PLACE和PLANTCARE在线软件对启动子进行分析，得到蜡梅CpVIN3启动子序列SEQIDNo.1，命名为CpVIN3pro，分析结果如图1和表1所示，该启动子具有54个TATA-box和38个CAAT-box核心元件，此外，还含有提高转录水平顺式作用元件5’UTRPy-richstretch，脱落酸响应元件ABRE，热应激元件HSE，胚乳表达调控元件GCN4_motif，昼夜控制调节元件circadian，参与生长素响应调控元件AuxRR-core，胁迫相关应答元件TC-richrepeats，多个光应答元件如BoxI、Box-4、CATT-motif等。CpVIN3pro中除基本的启动元件及大量RNA聚合酶II结合位点TATA-box和与转录活性相关CAAT-box的核心元件外，还含有多个胁迫响应元件，说明蜡梅CpVIN3基因启动子具有部分抗逆性，暗示CpVIN3基因可能与冬季开花相关；多个光应答元件和1个昼夜调控元件等，证实蜡梅开花可能与长短日照和昼夜时间相关。表1启动子调控区元件分析实施例2对拼接获得的CpVIN3基因上游启动子序列进行全长克隆对测序结果进行拼接获得较长的CpVIN3基因上游启动子序列。再依据此序列，设计其上下游特异引物扩增获得全长启动子序列，并将上游引物命名为N-CpVIN3-P-F，下游引物命名为N-CpVIN3-P-R。特异引物序列：N-CpVIN3-P-F：5’-AAGCTTGTATTATTAAGTAGGCTAAAGTAT-3’N-CpVIN3-P-R：5’-GGATCCAACAATCCAAAAATGAGAAGTTT-3’以蜡梅基因组DNA为模板，特异引物N-CpVIN3-P-F、N-CpVIN3-P-R为引物进行启动子的全长扩增，将扩增所得PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，出现一条约2000bp的条带图2。目的片段切胶回收后与克隆载体pMD19-T进行连接反应，再通过转化大肠杆菌感受态细胞，筛选出阳性克隆，最后送往成都擎科测序部公司进行测序分析。实施例3植物表达载体pBI121-CpVIN3pro::GUS的构建植物表达载体pBI121是一个双元载体，含有基因系统和CaMV35S启动子。为了研究CpVIN3基因启动子的功能，本研究中用其替换植物表达载体pBI121中的35S启动子，与GUS报告基因融合，构建植物表达载体。用HindIII和BamHI分别双酶切通过PCR扩增所得的片段和pBI121载体，分别回收酶切产物后进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR和酶切鉴定阳性克隆，命名为pBI121-CpVIN3pro::GUS。将阳性质粒用电转法转入农杆菌GV3101，经PCR初步鉴定阳性菌落后提取其质粒，再反转大肠杆菌DH5α，提取其质粒进行酶切鉴定。运用软件Primer5.0，根据CpVIN3pro序列以及常用酶切位点序列，设计一对加酶切位点的引物，将引物送往擎科生物技术有限公司进行合成。引物设计如下：上游引物CpVIN3pro-F：5’-GTATTATTAAGTAGGCTAAAGTAT-3’方框部分为HindIII酶切位点下游引物CpVIN3pro-R：5’-AACAATCCAAAAATGAGAAGTTT-3’方框部分为BamHI酶切位点PCR获得加有酶切位点的启动子片段，将扩增所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段后，连接克隆载体pMD19-T，构建中间载体，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送往成都擎科公司进行测序。提取阳性重组克隆载体后，用限制性内切酶HindIII和BamHI对其进行双酶切，酶切后的序列带有HindIII和BamHI粘性末端，同时用HindIII和BamHI双酶切pBI121空载质粒，去掉CaMV35S启动子。1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，与目的片段大小一致，表明启动子序列和植物表达载体双酶切成功。胶回收从pMD19-T上酶切下来CpVIN3pro启动子序列和去掉35S启动子的pBI121片段后，用T4DNA快速连接酶连接过夜，构建成植物表达载体，命名为pBI121-CpVIN3pro::GUS。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对转化后的菌液进行PCR鉴定，扩增出的片段大小与目标片段大小一致，初步判定表达载体连接成功结果见图3。选择PCR鉴定结果为阳性的菌液进行质粒提取，再用内切酶HindIII和BamHI对重组质粒进行双酶切验证，得到了约2100bp左右的预期目的片段图4。证明该启动子片段已经正确插入pBI121载体中，表达载体pBI121-CpVIN3pro::GUS构建成功。实施例4农杆菌介导瞬时转化烟草将实施例3制备的植物表达载体阳性克隆菌液进行质粒提取，然后利用电转化法转入到农杆菌GV3101中，用引物CpVIN3pro-F、CpVIN3pro-R进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5所示，从图中可以看出8个菌落均为阳性菌落，表明表达载体已成功转入农杆菌中，选择5号农杆菌侵染W38烟草叶片。浸染叶片经共培养后，随机取出进行GUS组织化学染色。结果如图6所示，转CaMV35S启动子和转化pBI121-CpVIN3pro的烟草叶片经GUS组织化学染色后均有蓝色斑点呈现，而阴性对照没有呈现出蓝色斑点，表明所克隆的CpVIN3基因的启动子能够驱动下游GUS报告基因的表达。实施例5农杆菌介导转化拟南芥为了分析蜡梅CpVIN3基因启动子CpVIN3pro的组织及发育特异性，利用花序侵染法将构建好的启动子与GUS融合表达载体pBI121-CpVIN3pro::GUS转入拟南芥Col-0中进行稳定表达，经Kan抗性筛选和PCR鉴定获得T2代纯合体转基因拟南芥，取T2代转基因植株不同发育时期植株及不同组织进行GUS染色分析。结果显示：在不同发育时期的各组织中均能检测到GUS活性，表明克隆到的蜡梅CpVIN3基因启动子序列CpVIN3pro能够驱动GUS基因在不同发育时期及不同组织中组成型表达；比较各组织中GUS的染色情况，发现在茎尖分生区、腋芽分生区、花芽分生区有较强的GUS活性，且伴随着花朵不断发育GUS活性加强图7。表明CpVIN3可能参与植物成花诱导，CpVIN3pro能为需要春化诱导开花的植物提供新的启动子资源。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表西南大学蜡梅CpVIN3基因启动子及其用途9SIPOSequenceListing1.012176DNA腊梅Chimonanthuspraecox1gtattattaagtaggctaaagtataatatgcaaaactaaatctacaatcagaactaacat60cgaatatttgattaaatgttgatgaaaggccaaaacttgatttgacttatctttagttta120ataaaaagttaagctcgagctcaaaatgatttcattttttataagaatatttttctcatt180tttttaattaaaaaaaaaaggttcttatataaatttgtgatgcaggcttggggtgaactt240caacaattttaatacgtgacatgataatagatcaaaagacatttccgtctatagagcccg300cgcagctaattacgaagtttagaaaaggattttgtattgctataacttgaataaaccaaa360cttataacgacaaatttcctaggaattctaatgtgctttcattgaaatttagattaaagt420ctcttttaattagtgattgaaatggaaatgcagttaaaaagagataattgaaaattgaat480tgaatgatacttgtttggacaacaggtcagggtattggtttgagaagcctctcaaaagtc540aaaacaatgaactccacattagaaattcgaattctccattaattaattgaatgtataatt600tttgaaaattacataggtatttatagagaaattgaagtgaaaagacaggattatctctgc660cttcgttaaccacaccaagaaagaatgcttcctctaaaaaatagttaagtaaaggagaaa720gaaatatgtaaggaaacgttgcctcgtttgggaccaatccctgtttacacaaatcaacca780atatgcatgctggatcttgccaccaaggcacaatggatggctgggattaattccaagaaa840cacaaaatatagaaatcgtctctagcctatagacttggcaacacagtctcctcatctttc900tctcttgcaaactcgccattcccctttgggtttggatgatgtggacggccatggaggatt960agagagagaggatttaggggtagggatggacatgggcttttgtgtagtggaattggttgg1020gtcaggcttagaaggactggagttggacttaacaggcttagcttggtccattctaggctg1080atatgggcctttcaaaatctgctaggtcattgagatttgactatgaaaattgactagata1140attagagtctaatggtgatctcacgatcaaaatgagataggaaagccaattcaatttcct1200ccacatgatgaaggtccactgaatgtgaatcactggaccggatgctctcatcaatttgga1260tcagattgggtcaaaaattttttttttattaattatctatatctaactcgatttgaactg1320catgtttggcctataggttagattgggttgaggaaaaataaagactaaaattcgggtcgc1380gttaaattcacctctaaatatccaactagactagacctaacccaaccataatcgattatc1440gatcatatctagatttttagatattgctattttattatgtttaaatttatttcttaagtt1500attattatcaaattttaaaatcaagttgatggaaaatattatacatgtatatacagttca1560tgcttaaaataaagggagtatatgtcgggccaagtcggggctagttgagttattgtggta1620gattagagttgagttgagtcacaatagttaggttttgaggtcgatttatactgagttgag1680ttagactttaaccagacccagcctgaccggtcccaccagatgaatggtcttggtcccaaa1740aaattcgtcccaaaaaagaacaagtcatttttgtgttgtagacgcacatgggagaatgtg1800tataacccttatgggaaactggaaaagcccatttggccgttgagtgtcctcgaatctacc1860taagctgacaacccttaacttcccttgtgtagtaacttcacctaaaaatcctttctttca1920actcttcctctcctttttctctcatcccattctctcttctcttttctctgtcttcactcc1980tcagtttttcatgctttatctcttgcatttctgtaaatgaatagttctaccaatttctct2040acccggccttttattttgcctcactcttctgtaccctgaagttctagataagggtccctt2100ttcatttgacctctttctacctctctctctctctcgctctctcccagtgtttctaaactt2160ctcatttttggattgt2176228DNA腊梅Chimonanthuspraecox2gacccgtcactacccgagagtctaaaac28322DNA腊梅Chimonanthuspraecox3gtaatacgactcactatagggc22426DNA腊梅Chimonanthuspraecox4gaggcaaaataaaaggccgggtagag26519DNA腊梅Chimonanthuspraecox5actatagggcacgcgtggt19630DNA腊梅Chimonanthuspraecox6aagcttgtattattaagtaggctaaagtat30729DNA腊梅Chimonanthuspraecox7ggatccaacaatccaaaaatgagaagttt29830DNA腊梅Chimonanthuspraecox8aagcttgtattattaagtaggctaaagtat30929DNA腊梅Chimonanthuspraecox9ggatccaacaatccaaaaatgagaagttt29

权利要求：1.一种分离的蜡梅CpVIN3基因启动子分子，其为：1由SEQIDNo.1的核酸序列所示的多核苷酸序列组成；或2由与SEQIDNo.1的核酸序列一致性在85％以上的多核苷酸序列组成，具有1中所有的启动子元件，具有启动子活性。2.一种核酸构建体，其包含可操作性地连接到异源的可转录的多核苷酸分子的权利要求1的启动子。3.如权利要求2所述的核酸构建体，其中，所述的可转录的多核苷酸分子可操作地连接到3’转录终止多核苷酸分子。4.如权利要求2所述的核酸构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是具有农学重要性的基因。5.权利要求2的核酸构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是标记基因。6.用权利要求2所述的构建体稳定转化的转基因植物细胞。7.权利要求6的转基因植物细胞，其中，该转基因植物是双子叶植物。8.权利要求7的转基因植物细胞，其中，所述双子叶植物选自拟南芥、蜡梅、烟草、梅花、向日葵、牡丹、芍药、茶梅和山茶。9.指导可转录的多核苷酸序列在植物细胞中表达的方法，其包括将权利要求1的启动子可操作地连接到所述多核苷酸序列并用可操作地连接到该多核苷酸序列的启动子转化植物细胞。10.如权利要求10的方法，其包括从植物细胞再生植物。

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