申请/专利权人：江南大学

申请日：2017-01-19

公开（公告）日：2020-01-21

公开（公告）号：CN106636177B

主分类号：C12N15/81(20060101)

分类号：C12N15/81(20060101);C12N15/66(20060101);C12R1/72(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.01.21#授权;2017.06.06#实质审查的生效;2017.05.10#公开

摘要：本发明公开了一个Candidaamazonensis的FLPFRT基因敲除系统，属于基因工程技术领域。本发明将FLP重组酶基因置于严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p下调控，并在FLP表达盒和抗性标记表达盒两端添加同向重复的FRT位点，以PDC为靶基因构建基因敲除盒整合到Candidaamazonensis基因组中，后续通过添加诱导剂诱导FLP表达，实现抗性基因的切除。本发明首次实现了Candidaamazonensis的无标记基因敲除，并可以用于连续敲除多个基因，为Candidaamazonensis的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。

主权项：1.一种亚马逊假丝酵母Candidaamazonensis的FLPFRT基因敲除方法，其特征在于，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒；所述方法包括以下步骤：1构建基因敲除盒，敲除盒从5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重组酶基因、SpCyC1t终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；2用包含基因敲除盒的质粒转化Candidaamazonensis，得到靶基因敲除的阳性克隆；3将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。

全文数据：^种Gandidaamazonensis的FLPFRT基因敲除方法技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种CandidaamazonensisFLPFRT基因敲除系统。背景技术[0002]Candidaamazonensis是近年来从亚马逊森林中新分离出的一株能够高效利用木糖的酵母，该酵母能够代谢多种糖类，同时具有发酵纤维二糖、海藻糖等的能力（CadeteRM1MeloMA1LopesMR1PereiraGM1ZilliJE1VitalMJ1GomesFC1LachanceMA1RosaCA.Candidaamazonensissp.nov.,anascomycetousyeastisolatedfromrottingwoodintheAmazonianforest.Internationaljournalof[0003]systematicandevolutionarymicrobiology,2012,62Pt6:1438-1440.〇Cadete等（CadeteRM，MeloMA，DussanKJ，RodriguesRC，SilvaSS，ZilliJE，VitalMJ,[0004]GomesFC,LachanceMA1RosaCA.DiversityandphysiologicalcharacterizationofD-xylose-fermentingyeastsisolatedfromtheBrazilianAmazonianForest.PLoS[0005]ONE,2012,78:e43135.在研究中发现Candidaamazonensis具有快速代谢木糖的能力，并在木糖醇生产方面表现出一定优势。实验室前期研究注意到该酵母能够分别在高木糖浓度35^1、高温42°：、？!12.5等胁迫条件下仍能有效发酵木糖并积累较高的生物量，表现出良好的耐高糖、耐高温以及耐酸性能。有望成为新型木糖发酵模式菌株范贺超，张梁，李赢，等.五株木糖利用酵母的生理代谢特性.微生物学报，2015,558:1026-1035.[0006]然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特性外，还需要基因表达与敲除等基本的分子生物学手段的有效支持，用以充分挖掘相关菌株优良信息。目前，Candidaamazonensis基因水平上的研究尚处于起步阶段，至今还未有全基因组测序的工作展开。此外，由于该酵母属于利用木糖类酵母，使用特殊的基因编码系统，即密码子CTG编码的是丝氨酸而非常见的亮氨酸（WohlbachDJ，KuoA,SatoTK,PottsKM,SalamovAA,LabuttiKM,SunH,ClumA,PangilinanJL,LindquistEA1LucasS1LapidusA,JinM1GunawanC,BalanV1DaleBE1JeffriesTff1ZinkelR1BarryKff,GrigorievIV,GaschAP.Comparativegenomicsofxylose-fermentingfungiforenhancedbiofuelproduction.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2011，10832:13212-13217.，这使得常规表达系统所对应的一些载体元件包括筛选标记、报告基因等难以有效用于该CTG类酵母中。[0007]本实验室前期利用定点突变后CDS区9个CTG突变为亮氨酸密码子TTG的潮霉素抗性基因hphm和绿色荧光蛋白基因gfpm1个CTG突变为TTG以及来自Spathasporapassalidarum酵母的启动子、终止子等元件成功构建了一个适用于Candidaamazonensis的整合型表达载体PRACTH-gfpm，然而，有限的筛选标记很难满足人们对于代谢工程育种的要求。因此，对于新型木糖利用酵母Candidaamazonensis，目前急需一个筛选标记可重复使用的基因敲除系统来在菌种改造方面对其进行更深入的研究。[0008]位点特异性重组系统，如FLPFRT或Cre-Ioxp等，就是一种能够实现筛选标记基因回收的有效工具。近年来，在CTG类酵母中发展起来的FLPFRT位点特异性重组系统，因重组效率和靶向性高、可快速准确地实现抗性消除而受到众多研究者的青睐。[0009]FLPFRT系统由FLP重组酶和FRT识别位点两部分组成。FLP是1个48kDa的多肽单体蛋白，其可以介导34bp的FRT重复序列位点特异性重组，切除同向重复的2个FRT位点间的DNA片段和1个FRT位点，保留另一个FRT位点。早在1999年Staib等（StaibP，KretSchmarM,NichterleinT，etal.Host-induced,stage-specificvirulencegeneactivationinCandidaalbicansduringinfection[J].Molecularmicrobiology,1999,323:533-546.就选择在Candidaalbicans中将密码子修饰过后3个CTG突变为TTG的FLP重组酶基因置于SAP2与分泌天门冬氨酰蛋白酶有关）的启动子下进行调控，并在FLP表达盒和霉酚酸抗性标记基因（MH3R两端添加同向重复的FRT位点，由此构建的敲除系统在SAP2启动子对FLP酶的调控下，实现两个FRT位点之间片段的切除。[0010]同年，MorSchhauser等（M〇rSchhiiuserJ，MichelS，StaibP.SequentialgenedisruptioninCandidaalbicansbyFLP-mediatedsite-specificrecombination[J].Molecularmicrobiology，1999,323:547-556在抗性标记被URA3营养缺陷型标记替代的基础上，使用同样的技术在C.albicans中进行了连续分别两轮敲除⑶R4基因和MDRl基因，获得突变纯合株，成功实现了FLPFRT系统在Candidaalbicans中抗性重复使用和多基因连续敲除方面的应用。[0011]此外，Sanchez-Martinez等（Sanchez-MartinezC，Perez-MartinJ.Site-specifictargetingofexogenousDNAintothegenomeofCandidaalbicansusingtheFLPrecombinase[J].MolecularGeneticsandGenomics，2002,2683:418-424和Reuss等Reu0O，VikA^，KolterR，etal.TheSATlflipper,anoptimizedtoolforgenedisruptioninCandidaalbicans[J].Gene，2004,341:119-127.选择用一个Candidaalbicans自身来源的麦芽糖诱导型启动子MAL2替换前面的SAP2构建的FLPFRT系统也成功实现了Candidaalbicans中同向FRT位点之间序列的删除，其中FLP重组酶的表达受麦芽糖的诱导，因此通过培养基中麦芽糖的有无就可以实现对FLP表达的调控，从而可实现对FRT位点间片段切除在时空顺序上的控制。[0012]在这基础上，当Ding&Butler等人（DingC，ButlerG.DevelopmentofageneknockoutsysteminCandidaparapsilosisrevealsaconservedroleforBCRlinbiofilmformation[J].Eukaryoticcell，2007,6⑶：1310-1319.将该敲除系统应用于Candidaparapsilosis中时，发现只有将CaMAL2启动子替换成宿主自身来源的CpMAL2时，才能有效行使其功能。而让人意外的是，Gacser等人GAcserA，TrofaD，SdldferW^tal.TargetedgenedeletioninCandidaparapsilosisdemonstratestheroleofsecretedlipaseinvirulence[J].TheJournalofclinicalinvestigation，2007，11710:3049-3058和Nguyen等人（NguyenLN，TrofaD，NosanchukJD.FattyacidsynthaseimpactsthepathobiologyofCandidaparapsilosisinvitroandduringmammalianinfection[J].PloSone，2009,412:e8421在后来被相继报道称不需改变MAL2启动子序列，便可在Candidaparapsilosis中成功实现由FLP重组酶介导的敲除。[0013]基于以上FLPFRT系统在CTG类酵母中的研究应用，对于能够在Candidaamazonensis中适用的FLPFRT敲除系统的获得，其关键在于拥有一个能严格调控FLP酶表达的启动子，目前，已有不少调控型启动子被克隆及功能鉴定，其中研究频率比较高的诱导型启动子包括酿酒酵母来源的受葡萄糖抑制、半乳糖诱导的GALl和GALlO启动子GuarenteL,YocumRR1GiffordP.AGALlO-CYClhybridyeastpromoteridentifiestheGAL4regulatoryregionasanupstreamsite[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，1982,7923:7410-7414.;酿酒酵母来源的受葡萄糖抑制、麦芽糖诱导的MAL62FinleyRL,ZhangH,ZhongJ，etal.RegulatedexpressionofproteinsinyeastusingtheMAL61_62promoterandamatingschemetoincreasedynamicrange[J].Gene,2002,285I:49-57.和白色假丝酵母来源的MAL2ReuM，VikA，KolterR,etal.TheSATlflipper,anoptimizedtoolforgenedisruptioninCandidaalbicans[J].Gene，2004,341:119-127.;以及受木糖诱导的XYL启动子KopkeK，HoffB,KiickU.ApplicationoftheSaccharomycescerevisiaeFLPFRTrecombinationsysteminfilamentousfungiformarkerrecyclingandconstructionofknockoutstrainsdevoidofheterologousgenes[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology，2010，7614:4664-4674.等等，这些启动子的诱导或抑制效果都比较明显，但大多数启动子在非诱导条件下甚至是抑制的条件下仍然有一定量的基础表达，难以达到严格诱导的标准，具有一定的局限性。此外，不同来源的启动子或者不同的表达宿主因为其遗传背景不同，可能导致启动子的行使功能有差异。发明内容[0014]针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了适用于Candidaamazonensis的严格诱导型启动子SpGALlp受半乳糖诱导或SpMALlp受麦芽糖诱导），诱导调控FLP基因，构建抗性标记可重复利用的FLPFRT基因敲除系统，能够用于高效地连续敲除Candida.amazonensis内目的基因，为菌株的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。[0015]本发明的技术方案如下：[0016]-种Candidaamazonensis的FLPFRT基因敲除方法，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒。[0017]所述方法具体包括以下步骤：[0018]1构建基因敲除盒，敲除盒从5'-3'依次包括以下核心元件:靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGALlp或SpMALlp、caFLP重组酶基因、SpCyClt终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；[0019]2用基因敲除盒转化Candidaamazonensis，得到革巴基因敲除的阳性克隆；[0020]⑶将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。[0021]其中，所述靶基因为PDC基因，编码丙酮酸脱羧酶，该基因编码序列如SEQIDNO:1所示；[0022]所述的FRT位点的序列如SEQIDNO:2所示；[0023]所述的严格诱导型启动子SpGALlp为Spathasporapassalidarum来源的β-半乳糖苷酶基因GALl启动子，受半乳糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQIDΝ0:3所示；[0024]所述的严格诱导型启动子SpMALlp为Spathasporapassalidarum来源的α-麦芽糖苷酶基因MALI启动子，受麦芽糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQIDΝ0:4所示；[0025]所述的caFLP为适用于Candidaamazonensis的重组酶基因，该基因的编码序列如SEQIDNO:5所示；[0026]所述的SpCyClt终止子为Spathasporapassalidarum来源的细胞色素C基因CYCl终止子，该终止子的DNA序列如SEQIDNO:6所示；[0027]所述的潮霉素抗性基因hphm表达盒，其DNA序列如SEQIDN0:7所示。[0028]特别的，所述caFLP可以指将酿酒酵母来源的FLP重组酶基因内含有的3个CTG密码子突变为TTG，使得在Candidaamazonensis内编码的是亮氨酸，而非丝氨酸。[0029]优选的，步骤⑴中所述构建基因敲除盒由以下具体步骤得到：[0030]1以Candidaamazonensis基因组为模板，用序列为SEQIDNO:8的引物PDC-I和序列为SEQIDN0:9的引物PDC-2扩增PDC基因5'端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位点StuI，片段下游引入酶切位点KpnI;利用序列为SEQIDNO:10的引物HC-3和序列为SEQIDN0:11的引物PDC-4扩增PDC3'端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位点KpnI，片段下游引入酶切位点stuI;用重叠延伸PCR法将roc-L和roc-R序列拼接获得roc基因同源重组片段roa-R;[0031]2将PDCL-R连接至PMD19-Tsimple载体，转化感受态E.coliJM109,获得阳性克隆，命名为Ts-PDCLR;提取质粒Ts-PDCLR，用Kpn頂每切，去磷酸化后备用；[0032]3以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，用序列为SEQIDNO:12的引物SpGALlp-F和序列为SEQIDN0:13的引物SpGALlp-RPCR扩增启动子SpGALlp，片段上游引入酶切位点KpnI，下游引入SalI;以序列为SEQIDNO:14的引物SpMALlp-F和序列为SEQIDNO:15的引物SpMALlp-RPCR扩增启动子SpMALlp，片段上游引入酶切位点BamHI，下游引入SalI;[0033]⑷将纯化的片段SpGALlp和重组质粒PRACTH-gfpm分别用BglII和SalI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于lOOygmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpGALlp-gfpm;将纯化的片段SpMALlp用BamHI和SalI双酶切，质粒PRACTH-gfpm用BglII和SalI双酶切，二者的酶切产物分别纯化后过夜连接，其中BamHI和BglII是同尾酶，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于l〇〇ygmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpMALlp-gfpm;[0034]5对重组质粒SpGALlpSpMALlp-gfpm和Ts-caFLP分别用SalI和NotI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于lOOygmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒SpGALlpSpMALlp-caFLP;[0035]6以质粒SpGALlp-caFLP为模板，用序列为SEQIDN0:16的引物FRT-l和序列为SEQIDNO:17的引物FRT-2扩增带有FRT位点的片段FRT-SpGALlp-caFLP-SpCyClt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI;以质粒SpMALlp-caFLP为模板，用序列为SEQIDNO:18的FRT-3和序列为SEQIDNO:17的FRT-2扩增带有FRT的片段FRT-SpMALlp-caFLP-SpCyClt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI;[0036]7上述带有FRT的片段经KpnI酶切并纯化后，分别与步骤2中备用的Ts-PDCLR经T4DNA连接酶连接，转化感受态E.coliJM109,获得阳性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGALlpSpMALlp-caFLP-hphm-FRT-PDCR，简称为Ts-PRFgHRP或Ts-PRFmHRP，该同源重组载体通过StuI酶切后割胶回收同源重组片段PDCL-FRT-SpGALIpSpMALIp-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRPPRFmHRP备用。[0037]优选的，步骤2的具体操作方法为:将基因敲除盒经醋酸锂介导法转入Candidaamazonensis中，涂布含900ygmL潮霉素即HygromycinB的平板筛选得到转化子;在通过更高浓度的潮霉素抗性平板进行转化子筛选后，进一步获取阳性转化子。[0038]优选的，所述诱导培养基分为两种：[0039]当选择用SpGALlp启动子来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基为半乳糖诱导培养基YEPG;[0040]当选择用SpMALlp来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基则为麦芽糖诱导培养基YEPM。[0041]优选的，所述诱导培养基的组成为：[0042]半乳糖诱导培养基YEPG:蛋白胨20,酵母提取物10,半乳糖20,单位为gL;用于固体培养基时添加1.6%的琼脂粉；[0043]麦芽糖诱导培养基YEPM:蛋白胨20，酵母提取物10，麦芽糖20，单位为gL;用于固体培养基时添加1.6%的琼脂粉。[0044]优选的，所述的宿主酵母Candidaamazonensiss保藏于荷兰真菌菌种保藏中心，保藏编号为CBS12363。[0045]本发明有益的技术效果在于：[0046]本发明提供的适用于Candidaamazonensis的FLPFRT基因敲除系统，利用严格诱导型启动子SpGALlp或SpMALlp控制重组酶caFLP的表达，在FLP表达盒和hphm抗性基因表达盒两端添加同向重复的FRT位点，以F1DC为革El基因构建敲除盒整合到Candidaamazonensis基因组中，后续通过添加诱导剂诱导FLP表达，切除FRT位点间FLP和hphm表达盒。[0047]本发明提供的敲除系统可以用于连续敲除多个基因。应用本发明，我们成功敲除了Candidaamazonensis的PDC基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常。[0048]本发明只需要一次同源重组和后续的培养基诱导便可获得重组酶基因和抗性基因一同被切除的靶基因敲除株，而不需要另外转入一个携带重组酶的游离质粒，如Cre-Loxp系统中携带Cre酶的PSH47质粒。并且只需要一个可用的抗性标记便可完成多个基因的连续敲除。[0049]本发明基因敲除株与其出发菌株相比，除了目的基因的部分或完全缺失及多了一个34bp的FRT位点外，无其他基因上的差异。该敲除系统可以直接以野生型菌株为改造对象，不需要利用URA3或HISl、ARG4等营养缺陷型菌株，一方面省去了营养缺陷型菌株的筛选过程，也避免了回复突变等问题;另一方面由于URA3等基因的缺失会改变菌株的表型，这可能会导致其对突变株有其他未知的影响。[0050]基因敲除以后的菌株性状稳定，发酵、生长不受影响。附图说明[0051]图1为实施例1的定点突变后FLP基因CDS序列（H]表示定点突变位点）；[0052]图2为实施例2的重组载体Ts-PRFgmHRP的质粒图谱；[0053]图3为roc基因敲除流程图；[0054]图4为CandidaamazonensisPDC基因敲除株的PCR验证图；[0055]图5为原始菌株Candidaamazonensis及PDC敲除株在含900ygmL潮霉素Hyg的YEro平板上的生长状况图。具体实施方式[0056]下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。[0057]实施例1重组酶基因FLP的定点突变[0058]以Saccharomycescerevisiae为模板，用引物FLP-FSEQIDNO:19和FLP-RSEQIDNO:20PCR扩增获得FLP基因序列（序列上游引入酶切位点SalI，序列下游引入酶切位点NotI，连接PMD19-Tsimple载体，转化感受态E.coliJM109,获得重组子Ts-FLP。以质粒Ts-FLP为模板，采用Stratagene定点突变试剂盒购自安捷伦科技有限公司），分别使用引物FLP-1SEQIDN0:21和FLP-2SEQIDN0:22;FLP-3SEQIDN0:23和FLP-4SEQIDN0:24;FLP-5SEQIDN0:25和FLP-6SEQIDN0:26经过3轮PCR定点突变，，获得环状PCR产物。扩增条件为：95°C预变性2min，95°C变性30s，55°C退火2min，68°C延伸4min，30个循环，68°C充分延伸5min。将上述PCR产物纯化后用内切酶DpnI于37°C消化30min，于65°C反应15min以失活内切酶DpnI。将酶切产物纯化后，转化E.coliJMl09感受态细胞购自北京全式金公司），涂布于LBlOOygmL氨苄青霉素平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒。经过上述突变操作后，突变质粒命名为Ts-caFLP，其中突变后FLP的⑶S序列如图1所示。[0059]实施例2PDC基因敲除盒的构建[0060]1以Candidaamazonensis基因组为模板，用引物PDC-ISEQIDN0:8和roC-2SEQIDN0:9扩增PDC基因5'端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位点StuI，在片段下游引入酶切位点KpnI;利用引物PDC-3SEQIDN0:10和roC-4SEQIDN0:ll扩增TOC3'端400bp的下游序列HC-R，片段上游引入酶切位点KpnI，片段下游引入酶切位点StuI;用重叠延伸PCR法将roc-L和roc-R序列拼接获得roc基因同源重组片段rocL-R。[0061]2将PDCL-R连接PMD19-Tsimple载体，转化感受态E.coliJM109,获得阳性克隆，命名为Ts-PDCL-R。提取质粒Ts-PDCLR，用Kpn頂每切，去磷酸化后备用。[0062]3以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，用引物SpGALlp-FSEQIDN0:12和SpGALlp-RSEQIDN0:13PCR扩增启动子SpGALlp，片段上游引入酶切位点KpnI，下游引入SalI;以引物SpMALlp-FSEQIDN0:14和SpMALlp-RSEQIDN0:15PCR扩增启动子SpMALlp，片段上游引入酶切位点BamHI，下游引入SalI。[0063]⑷将纯化的片段SpGALlp和重组质粒PRACTH-gfpm分别用BglII和SalI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于LB100ygmL氨苄青霉素平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpGALlp-gfpm;将纯化的片段SpMALlp用BamHI和SalI双酶切，质粒PRACTH-gfpm用BglII和SalI双酶切，二者的酶切产物分别纯化后过夜连接BamHI和BglII是同尾酶），转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于LBKOygmL氨节青霉素平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpMALlp-gfpm。[0064]5对重组质粒SpGALlpSpMALlp-gfpm和Ts-caFLP分别用SalI和NotI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于LB100ygmL氨苄青霉素平板上，挑选单菌落，获得重组质粒SpGALlpSpMALlp-caFLP。[0065]6以质粒SpGALlp-caFLP为模板，用引物FRT-lSEQIDN0:16和FRT-2SEQIDNO:17扩增带有FRT位点的片段FRT-SpGALIp-caFLP-SpCyCIt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI;以质粒SpMALlp-caFLP为模板，用FRT-3SEQIDN0:18和FRT-4SEQIDNO:17扩增带有FRT的片段FRT-SpMALlp-caFLP-SpCyClt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI。[0066]7上述带有FRT的片段经KpnI酶切并纯化后，分别与步骤2中备用的Ts-PDCLR经T4DNA连接酶连接，转化感受态E.coliJM109,获得阳性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGALlpSpMALlp-caFLP-hphm-FRT-PDCR简称为Ts-PRFgmHRP，其质粒图谱如图2所示。该同源重组载体通过Stu頂每切后割胶回收同源重组片段PDCL-FRT-SpGALlpSpMALlp-caFLP-hphm-FRT-PDCRPRFgHRPPRFmHRP备用。[0067]实施例3PEGLiAc法转化CandidaamazonensisCBS12363[0068]1于YPD平板中挑取CandidaamazonensisCBS12363单菌落，接种于20mLYF1D培养基中，于IOOmL摇瓶中30°C过夜培养；[0069]2将过夜培养的新鲜菌液接种于50mLYro培养基中，于250mL摇瓶中30°C，200rpm培养，至菌液OD6QQ到1.2左右；[0070]35000rpm室温离心5min，收集菌体细胞；[0071]⑷将细胞重新悬浮于500yL0.lmolL的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细胞；[0072]5在感受态细胞中按顺序加入下列转化混合液：240yL50%PEG3350,36yL1.0molLLiAc，25yL鲑鱼精DNA，50yL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴IOmin后立即冰浴；[0073]⑶剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；[0074]⑵置于30Γ温育Ih;[0075]⑶置于42°C金属浴热击22min;[0076]9待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；[0077]10加入ImLYPD培养基，于30°C后培养2h;[0078]115000rpm离心5min，弃掉800yL上清，混匀菌体并涂布潮霉素（900ygmL抗性平板，30°C培养2-3d，获得转化子。[0079]实施例4CandidaamazonensisPDC基因敲除株的鉴定[0080]利用引物^：-1旣〇10勵：8和？0：-4細〇10勵：11鉴定？0：基因的敲除：敲除盒成功整合上roc位点的敲除株，其PCR产物为敲除盒片段，大小为5.4kb，而原始菌株的PCR结果为i.7kb的roc基因条带；[0081]利用引物FLP-FSEQIDNO:19和FLP-RSEQIDNO:20鉴定PDC基因的敲除：敲除株的PCR产物为1.3kb左右的DNA条带，而原始菌株则显示无条带。[0082]PDC敲除株的PCR验证如图4所示。图中泳道M为DL15000DNAmarker，泳道1-3为以引物PDC-I和PDC-4进行的PCR扩增；泳道4-5为以引物FLP-F和FLP-R进行的PCR扩增。（其中泳道1为野生菌株CandidaamazonensisCBS12363;泳道2和4为抗性未消除的PDC敲除株;泳道3和5则为抗性已成功消除的PDC敲除株）。[0083]实施例5Candidaamazonensis抗性基因的消除与验证[0084]阳性克隆在固体诱导培养基上分离纯化2-3次后其中PRFgHRP敲除株对应的诱导培养基为YEPG;PRFmHRP敲除株对应的诱导培养基为YEPM;挑取单菌落同时点板于含潮霉素和不含潮霉素的YEH平板，筛选普通YEH平板上生长而含潮霉素抗性板上不生长的单菌落，如图5所示。图中W为野生菌株CandidaamazonensisCBS12363;01为抗性未消除的]3DC敲除株;02则为抗性已成功消除的PDC敲除株。[0085]提取其染色体，用引物roc-lSEQIDNO:8和roc-4SEQIDNO:11进行PCR扩增，抗性消除株，其PCR产物大小为0.8kb左右；用引物FLP-FSEQIDNO:19和FLP-RSEQIDNO:20进行PCR扩增，无产物扩增出。[0086]抗性基因消除的PCR验证如图4所示。图中泳道M为DL15000DNAmarker，泳道1-3为以引物roc-1和roc-4进行的PCR扩增；泳道4-5为以引物FLP-F和FLP-R进行的PCR扩增。其中泳道1为野生菌株CandidaamazonensisCBS12363;泳道2和4为抗性未消除的PDC敲除株;泳道3和5则为抗性已成功消除的roc敲除株）。[0087]对PCR验证正确的抗性消除株，将其0.8kb大小的PCR产物送上海生工生物工程进行测序，对测序结果（SEQIDN0:27分析，表明其为PDCL-FRT-PDCR片段序列，进一步表明FRT位点之间的片段已成功被切除。[0088]上述结果表明成功敲除了Candidaamazonensis的PDC基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常，可作为出发菌株进行后续基因改造。[0089]本发明提供了适用于Candidaamazonensis的严格诱导型启动子SpGALlp受半乳糖诱导或SpMALlp受麦芽糖诱导），诱导调控FLP基因，构建了抗性标记可重复利用的FLPFRT基因敲除系统，并通过敲除PDC基因成功验证了该系统在Candidaamazonensis中的应用，为菌株的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。

权利要求：1.一种〇31111^311^2011611818的？1^^1?1'基因敲除方法，其特征在于，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1构建基因敲除盒，敲除盒从5'-3'依次包括以下核心元件:靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGALlp或SpMALlp、caFLP重组酶基因、SpCyClt终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；⑵用基因敲除盒转化Candidaamazonensis，得到革El基因敲除的阳性克隆；⑶将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶基因为HC基因，编码丙酮酸脱羧酶，该基因编码序列如SEQIDNO:1所示；所述的FRT位点的序列如SEQIDN0:2所示；所述的严格诱导型启动子SpGALlp为Spathasporapassalidarum来源的β-半乳糖苷酶基因GALl启动子，受半乳糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQIDΝ0:3所示；所述的严格诱导型启动子SpMALlp为Spathasporapassalidarum来源的α-麦芽糖苷酶基因MALI启动子，受麦芽糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQIDΝ0:4所示；所述的caFLP为适用于Candidaamazonensis的重组酶基因，该基因的编码序列如SEQIDNO:5所示；所述的SpCyClt终止子为Spathasporapassalidarum来源的细胞色素C基因CYCl终止子，该终止子的DNA序列如SEQIDNO:6所示；所述的潮霉素抗性基因hphm表达盒，其DNA序列如SEQIDN0:7所示。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述caFLP是指将酿酒酵母来源的FLP重组酶基因内含有的3个CTG密码子突变为TTG，使得在Candidaamazonensis内编码的是亮氨酸，而非丝氨酸。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1中所述构建基因敲除盒由以下具体步骤得到：1以Candidaamazonensis基因组为模板，用序列为SEQIDN0:8的引物TOC-1和序列为SEQIDNO:9的引物PDC-2扩增PDC基因5'端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位点StuI，片段下游引入酶切位点KpnI;利用序列为SEQIDNO:10的引物PDC-3和序列为SEQIDN0:ll的引物PDC-4扩增PDC3'端400bp的下游序列roC-R，片段上游引入酶切位点KpnI，片段下游引入酶切位点StuI;用重叠延伸PCR法将PDC-L和PDC-R序列拼接获得PDC基因同源重组片段roa-R;2将PDCL-R连接至PMDl9-TsimpIe载体，转化感受态E.coIiJMl09,获得阳性克隆，命名为Ts-PDCLR;提取质粒Ts-PDCLR，用Kpn頂每切，去磷酸化后备用；3以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，用序列为SEQIDNO:12的引物SpGALlp-F和序列为SEQIDN0:13的引物SpGALlp-RPCR扩增启动子SpGALlp，片段上游引入酶切位点KpnI，下游引入SalI;以序列为SEQIDNO:14的引物SpMALlp-F和序列为SEQIDNO:15的引物SpMALlp-RPCR扩增启动子SpMALlp，片段上游引入酶切位点BamHI，下游引入SalI;4将纯化的片段SpGALlp和重组质粒PRACTH-gfpm分别用BglII和SalI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于lOOygmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpGALlp-gfpm;将纯化的片段SpMALlp用BamHI和SalI双酶切，质粒PRACTH-gfpm用BglII和SalI双酶切，二者的酶切产物分别纯化后过夜连接，其中BamHI和BglII是同尾酶，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于100μgmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpMALlp-gfpm;5对重组质粒SpGALlpSpMALlp-gfpm和Ts-caFLP分别用SalI和NotI双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于lOOygmL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒SpGALlpSpMALlp-caFLP;6以质粒SpGALlp-caFLP为模板，用序列为SEQIDN0:16的引物FRT-l和序列为SEQIDNO:17的引物FRT-2扩增带有FRT位点的片段FRT-SpGALlp-caFLP-SpCyCIt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI;以质粒SpMALlp-CaFLP为模板，用序列为SEQIDN0:18的FRT-3和序列为SEQIDNO:17的FRT-2扩增带有FRT的片段FRT-SpMALlp-caFLP-SpCyClt-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点KpnI;7上述带有FRT的片段经KpnI酶切并纯化后，分别与步骤（2中备用的Ts-PDCLR经T4DNA连接酶连接，转化感受态E.coliJM109，获得阳性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGALlpSpMALlp-caFLP-hphm-FRT-PDCR，简称为Ts-PRFgHRP或Ts-PRFmHRP，该同源重组载体通过StuI酶切后割胶回收同源重组片段PDCL-FRT-SpGALIpSpMALIp-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRPPRFmHRP备用。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2的具体操作方法为:将基因敲除盒经醋酸锂介导法转入Candidaamazonensis中，涂布含900ygmL潮霉素即HygromycinB的平板筛选得到转化子;在通过更高浓度的潮霉素抗性平板进行转化子筛选后，进一步获取阳性转化子。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基分为两种：当选择用SpGALlp启动子来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基为半乳糖诱导培养基YEPG;当选择用SpMALlp来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基则为麦芽糖诱导培养基YEPM。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基的组成为：半乳糖诱导培养基YEPG:蛋白胨20,酵母提取物10,半乳糖20,单位为gL;用于固体培养基时添加1.6%的琼脂粉；麦芽糖诱导培养基YEPM:蛋白胨20，酵母提取物10，麦芽糖20，单位为gL;用于固体培养基时添加1.6%的琼脂粉。9.根据权利要求2~8任一项所述的方法，其特征在于，所述的宿主酵母Candidaamazonensiss保藏于荷兰真菌菌种保藏中心，保藏编号为CBS12363。

百度查询： 江南大学 一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法

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