申请/专利权人：中国科学院水生生物研究所

申请日：2018-04-18

公开（公告）日：2020-10-27

公开（公告）号：CN108633843B

主分类号：C12N1/10(20060101)

分类号：C12N1/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.27#授权;2018.11.06#实质审查的生效;2018.10.12#公开

摘要：本发明涉及一种鲩肠袋虫的体外培养方法及使用的培养基的制备方法，属于寄生原生动物体外培养技术领域。本发明培养基的配方为：任氏液100ml、酵母提取物0.5g、䏡蛋白胨1.0g，胎牛血清3～6ml、马血清6～10ml、地衣芽孢杆菌菌液300～500μl、无菌淀粉200～300mg。本发明虫体培养步骤如下：将提取的鲩肠袋虫接种至配制好的培养基中，充氮气后密封，15℃培养48～72h后将虫体转移至另一个新鲜的培养基中，充氮气密封，15℃培养，如此循环往复，使虫体持续增殖。本发明培养基制备方法简单，稳定性好，虫体在培养基中可实现分裂增殖，为鲩肠袋虫的生理学和实验生态学研究奠定了基础。

主权项：1.一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，其特征在于：所述培养基的配方组分及含量如下：任氏液100ml、酵母提取物0.5g、䏡蛋白胨1.0g，胎牛血清3～6ml、马血清6～10ml、地衣芽孢杆菌菌液300～500μl、无菌淀粉200～300mg；其中：所述应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基采用下述方法制得，步骤如下：（a）准确称取酵母提取物0.5g和䏡蛋白胨1.0g，加入任氏液100ml，调节pH至7.0～7.5，高温高压灭菌后，4℃保存；（b）将步骤（a）形成的培养基按3～5ml体积分装至多个无菌厌氧瓶中，并分别向各厌氧瓶内加入地衣芽孢杆菌菌液9～25μl，置于30℃条件下微生物摇床内培养至浓度达到2×109～6×109CFUml；（c）向步骤（b）形成的各培养基中分别加入胎牛血清90～250μl，马血清180～500μl和无菌淀粉6～15mg后置于15℃条件下，备用。

全文数据：一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基、其制备方法以及鲩肠袋虫的体外培养方法技术领域[0001]本发明属于寄生原生动物体外培养技术领域，具体地说，本发明涉及一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基、其制备方法以及鲩肠袋虫的体外培养方法。背景技术[0002]鲩肠袋虫是由陈启鎏先生（1955首次发现并命名的草鱼肠道专性寄生纤毛虫。MolnArandReinhardt1978应用组织学方法对感染鲵肠袋虫的草鱼肠道进行观察，发现其寄生在后肠黏膜褶及内容物中，虫体大量增殖会导致草鱼后肠肠道出现卡他性肠炎，并且可能会使得其他肠段发炎。李明等2007,2014通过苏木精染色、扫描电镜及透射电镜等方法观察了鲩肠袋虫的形态及超微结构，较系统、全面地描述了鲩肠袋虫的形态特征，并应用18SrDNA对鲩肠袋虫的分类地位进行了探讨。[0003]目前肠袋虫属中的物种病理研究方面的资料稀少，只有结肠小袋纤毛虫因为是哺乳动物消化道的重要致病原而研究得相对较多。对于鲩肠袋虫与草鱼之间的关系是寄生还是共生尚不清楚，虽然在前人的研究过程中发现了鲩肠袋虫的包囊形式，但仍然不能确定它是否就是鲩肠袋虫的感染阶段。而且由于其宿主生活在复杂的水环境中，人们对鲩肠袋虫感染途径方面的信息也一无所知。有一些研究者发现当草鱼患有肠道出血性病状时，鲩肠袋虫的数量会明显增加，所以推断其对草鱼是有害的；但也有人认为它是与草鱼存在一定的共生关系，因为在草鱼幼苗中并没有发现鲩肠袋虫的存在，而当其食性转换为进食水草阶段才逐渐发现有肠袋虫的寄生，因此推断其可能像瘤胃纤毛虫一样有帮助宿主消化纤维素的功能。[0004]为了深入探究鲩肠袋虫的感染形式，开展虫体生活史及致病机理等生物学方面的研究，在体外对鲩肠袋虫进行持续稳定的培养是必不可少的。在本发明作出之前，国内外有关鲩肠袋虫的报道主要集中在形态学及流行病学研究，目前尚无鲩肠袋虫体外培养的培养基成分及培养方法等方面的研究报道。发明内容[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基、其制备方法以及鲩肠袋虫的培养方法。[0006]为了实现本发明上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：[0007]本发明上述所述的一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，所述培养基的配方组分及含量如下:任氏液IOOml、酵母提取物0.5g、I示蛋白胨1.0g，胎牛血清3〜6ml、马血清6〜IOml、地衣芽抱杆菌菌液300〜500μ1、无菌淀粉200〜300mg。[0008]进一步地，上述技术方案中所述的任氏液的配方成分及含量如下:氯化钠NaCl6.5g，氯化钾（KCl0.14g，氯化钙（CaCh0.12g，碳酸氢钠（NaHCO30.2g，磷酸二氢钠NaH2PO40·Olg，蒸馏水IOOOml。[0009]本发明的第二个目的在于提供上述所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：[0010]a准确称取酵母提取物0·5g和豚蛋白胨1·Og，加入任氏液IOOml，调节pH至7·0〜7.5,高温高压灭菌后，4°C保存；[0011]⑹将步骤a形成的培养基按3〜5ml体积分装至多个无菌厌氧瓶中，并分别向各厌氧瓶内加入地衣芽孢杆菌菌液9〜25μ1，胶塞封闭后置于30°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到2XIO9〜6X109CFUml;[0012]c向步骤⑹形成的各培养基中分别加入胎牛血清90〜250μ1，马血清180〜500μ1和无菌淀粉6〜15mg后置于15°C条件下，备用。[0013]进一步地，上述技术方案步骤a所述的灭菌温度优选为121°C，灭菌时间优选为20min〇[0014]进一步地，上述技术方案步骤⑹所述的摇床的转速优选为150rpm。[0015]更进一步地，上述技术方案中所述的任氏液采用如下方法制备而成：[0016]⑴依次将氯化钠6.5g、氯化钾0.14g、碳酸氢钠0.2g、磷酸二氢钠0.Olg溶于999ml蒸馏水中，制得溶液1;[0017]ii配制质量浓度为12%的CaCl2溶液；[0018]iii取Iml步骤（ii所述的CaCl2溶液加入到溶液1中，混合均匀后，制得所述的任氏液，常温保存备用。[0019]本发明的还一目的在于提供上述所述的鲩肠袋虫的体外培养方法，包括如下步骤：[0020]1准备多个已灭菌的厌氧瓶，每个厌氧瓶中分别装有3〜5ml上述所述的鲩肠袋虫体外培养的培养基；[0021]2解剖草鱼肠道，在解剖镜下提取鲩肠袋虫，置于装有无菌生理盐水的无菌培养皿中，轻轻吹打清洗2〜3次后，更换无菌生理盐水，然后置于15°C恒温培养箱内静置一段时间；[0022]⑶在解剖镜下将步骤2静置后的培养皿内游离的虫体取出，接种至步骤⑴中的一个厌氧瓶中，连续充入氮气3〜5min后密封，置于15°C条件下恒温培养48〜72h;[0023]4将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，然后向厌氧瓶中连续充入氮气3〜5min后密封，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔48〜72h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖。[0024]进一步地，上述技术方案中所述的无菌生理盐水的浓度优选为0.65%wv。[0025]进一步地，上述技术方案中所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。[0026]进一步地，上述技术方案步骤⑵所述静置时间优选为20〜30min。[0027]进一步地，上述技术方案步骤2中所述鲩肠袋虫的提取、步骤3、步骤4中所述的鲩肠袋虫的取出、转移采用的均是无菌胶头滴管吸取的方式。[0028]本发明的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基是以酵母提取物、脑蛋白胨为基础，添加无机盐离子、地衣芽孢杆菌、胎牛血清、马血清和无菌淀粉制得的。[0029]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0030]1本发明的培养基配制方法简单，无需添加其他复杂成分；[0031]2本发明的培养方法简单，采用的仪器设备较少，在普通实验室条件下均可培养；[0032]3鲩肠袋虫在本发明的制得的培养基中培养，能够实现分裂增殖，且连续培养1年时间后，虫体仍保持旺盛的生命力和繁殖力。附图说明[0033]图1为本发明实施例1中鲩肠袋虫在体外培养的培养基中的生长曲线图；[0034]图2为本发明实施例1中鲩肠袋虫在体外培养30天后，在显微镜下观察到的鲩肠袋虫活体图；[0035]图3为本发明实施例1中鲩肠袋虫在体外培养30天后，在显微镜下观察到的正在分裂的鲩肠袋虫个体图。具体实施方式[0036]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。[0037]为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。[0038]下述实施例中的鲩肠袋虫虫体均采集自湖北省武汉市梁子湖中感染的草鱼，将草鱼带回实验室后进行解剖及虫体分离培养。[0039]实施例1[0040]本实施例的一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，所述培养基的配方组分及含量如下:任氏液IOOml、酵母提取物0.5g、.豚蛋白胨I.Og，胎牛血清3.5ml、马血清IOml、地衣芽孢杆菌菌液335μ1、无菌淀粉300mg;[0041]其中：所述的任氏液的配方成分及含量如下：氯化钠NaCl6.5g，氯化钾KCl〇·Hg，氯化钙CaCl20·12g，碳酸氢钠NaHCO30·2g，磷酸二氢钠NaH2PO40·0Ig，蒸馏水IOOOml0[0042]上述所述的任氏液是采用如下方法制备而成，包括如下步骤：[0043]⑴依次将氯化钠6.5g、氯化钾0.14g、碳酸氢钠0.2g、磷酸二氢钠0.Olg溶于999ml蒸馏水中，制得溶液1;[0044]ii配制质量浓度为12%的CaCl2溶液；[0045]iii取Iml步骤（ii所述的CaCl2溶液加入到溶液1中，混合均匀后，制得所述的任氏液，常温保存备用。[0046]本实施例上述所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，包括如下步骤：[0047]a准确称取酵母提取物0.5g和豚蛋白胨I.Og于250ml锥形瓶中，加入任氏液IOOml，调节pH至7.0〜7.5，锡箱纸封口后121°C高温高压灭菌20min，培养基冷却后4°C保存；[0048]⑹将步骤a配制好的培养基按3ml体积分装至多个25ml已灭菌的厌氧瓶中，并向每个厌氧瓶中加入地衣芽孢杆菌菌液ΐ〇μ1，胶塞封闭后置于3〇°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到3X109CFUml，所述摇床的转速为150rpm;[0049]C向步骤⑹形成的各培养基中分别加入胎牛血清ΙΟΟμΙ，马血清300μ1和无菌淀粉9mg后放置于15°C恒温培养箱中备用，此时鲩肠袋虫体外培养的培养基制作完成。[0050]上述所述的鲩肠袋虫的体外培养方法，包括如下步骤：[0051]1将上述装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶取出几个，备用；[0052]2将草鱼用MS-222麻醉后放入解剖盘，用无菌水冲洗肛门附近，用无菌解剖剪解剖草鱼，取出内脏，剪取后肠部分置于直径9cm的无菌培养皿中，使用小的解剖剪将后肠全部剖开，用无菌解剖刀刮取肠内容物于直径5.5cm无菌培养皿中，加入5ml浓度为0.65%wV的无菌生理盐水，静置3min，在解剖镜下检查内容物中寄生的鲩肠袋虫，发现虫体后用无菌胶头滴管吸取虫体于另一装有浓度为0.65%wv的无菌生理盐水的培养皿中，清洗3次后更换新的无菌生理盐水，置于15°C恒温培养箱中静置25min;[0053]3取出恒温培养箱中的培养基和装有鲩肠袋虫的培养皿，用无菌胶头滴管吸取10只形态正常、状态活跃的虫体接种至装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶中，连续充氮气3min后密封厌氧瓶，置于15°C恒温培养箱中静置培养48h;[0054]4取出步骤3恒温培养箱中装有培养物的厌氧瓶，倒出培养物至无菌培养皿中，在解剖镜下用无菌胶头滴管将所有虫体转移至另一个新鲜的装有3ml鲩肠袋虫体外培养培养基的厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气3min后密封，继续放入15°C恒温培养箱中培养48h;[0055]5将步骤4恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至另一个厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气3min后密封，采用步骤4相同的培养条件继续培养48h;[0056]6将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔48h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖，实验期间及时准备新鲜的鲩肠袋虫体外培养的培养基。[0057]上述所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。[0058]本实施例鲩肠袋虫体外培养的研究实验持续了1年时间，虫体每2天观察计数一次。取第1个月的虫体数目结果制作生长曲线图，如图1所示，由图1可以看出，在这1个月的时间内，培养基中的鲩肠袋虫虫体始终保持旺盛的繁殖力和活力，并且生长曲线具有持续增长趋势。[0059]图2、图3分别为本实施例中鲩肠袋虫在体外培养30天后，在显微镜下观察到的鲩肠袋虫活体图和正在分裂的鲩肠袋虫个体图。由图2、图3可以看出，本发明能够使鲩肠袋虫在鲩肠袋虫体外培养的培养基中实现分裂增殖和长期稳定培养，且在培养过程中保持旺盛的生命力和繁殖力，为进行鲩肠袋虫的生理学和实验生态学研究奠定了坚实的基础。[0060]实施例2[0061]本实施例的一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，所述培养基的配方组分及含量如下:任氏液IOOml、酵母提取物0.5g、豚蛋白胨1.0g，胎牛血清3ml、马血清6ml、地衣芽孢杆菌菌液300μ1、无菌淀粉200mg;[0062]其中:所述的任氏液的配方及制备方法与实施例1完全相同。[0063]本实施例上述所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，包括如下步骤：[0064]a准确称取酵母提取物0·5g和.1示蛋白胨1·Og于250ml锥形瓶中，加入任氏液IOOml，调节pH至7.0〜7.5，锡箱纸封口后121°C高温高压灭菌20min，培养基冷却后4°C保存；[0065]⑹将步骤a配制好的培养基按3ml体积分装至多个25ml已灭菌的厌氧瓶中，并向每个厌氧瓶中加入地衣芽孢杆菌菌液如1，胶塞封闭后置于30°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到6X109CFUml，所述摇床的转速为150rpm;[0066]C向步骤⑹形成的各培养基中分别加入胎牛血清90μ1，马血清180μ1和无菌淀粉6mg后放置于15°C恒温培养箱中备用，此时鲩肠袋虫体外培养的培养基制作完成。[0067]上述所述的鲩肠袋虫的体外培养方法，包括如下步骤：[0068]1将上述装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶取出几个，备用；[0069]2将草鱼用MS-222麻醉后放入解剖盘，用无菌水冲洗肛门附近，用无菌解剖剪解剖草鱼，取出内脏，剪取后肠部分置于直径9cm的无菌培养皿中，使用小的解剖剪将后肠全部剖开，用无菌解剖刀刮取肠内容物于直径5.5cm无菌培养皿中，加入5ml浓度为0.65%wV的无菌生理盐水，静置3min，在解剖镜下检查内容物中寄生的鲩肠袋虫，发现虫体后用无菌胶头滴管吸取虫体于另一装有浓度为0.65%wv的无菌生理盐水的培养皿中，清洗3次后更换新的无菌生理盐水，置于15°C恒温培养箱中静置20min;[0070]3取出恒温培养箱中的培养基和装有鲩肠袋虫的培养皿，用无菌胶头滴管吸取10只形态正常、状态活跃的虫体接种至装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶中，连续充氮气5min后密封厌氧瓶，置于15°C恒温培养箱中静置培养72h;[0071]4取出步骤3恒温培养箱中装有培养物的厌氧瓶，倒出培养物至无菌培养皿中，在解剖镜下用无菌胶头滴管将所有虫体转移至另一个新鲜的装有3ml鲩肠袋虫体外培养培养基的厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气5min后密封，继续放入15°C恒温培养箱中培养72h;[0072]⑸将步骤⑷恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至另一个厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气5min后密封，采用步骤4相同的培养条件继续培养72h;[0073]6将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔72h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖，实验期间及时准备新鲜的鲩肠袋虫体外培养的培养基。[0074]上述所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。[0075]本实施例鲩肠袋虫体外培养的研究实验持续了1年时间，虫体每72h观察计数一次。在1年时间内，培养基中的鲩肠袋虫虫体始终保持旺盛的繁殖力和活力。[0076]另外，发明人在显微镜下对本实施例鲩肠袋虫在体外培养1年后的鲩肠袋虫活体和正在分裂的鲩肠袋虫个体分别进行了观察，结果表明，本实施例制得的培养基能够使鲩肠袋虫实现稳定分裂增殖和长期稳定培养，且在培养过程中保持旺盛的生命力和繁殖力。[0077]实施例3[0078]本实施例的一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，所述培养基的配方组分及含量如下:任氏液IOOml、酵母提取物0.5gJ示蛋白胨I.Og，胎牛血清6ml、马血清9ml、地衣芽孢杆菌菌液335μ1、无菌淀粉250mg;[0079]其中:所述的任氏液的配方及制备方法与实施例1完全相同。[0080]本实施例上述所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，包括如下步骤：[0081]a准确称取酵母提取物0.5g和I示蛋白胨I.Og于250ml锥形瓶中，加入任氏液IOOml，调节pH至7.0〜7.5，锡箱纸封口后121°C高温高压灭菌20min，培养基冷却后4°C保存；[0082]⑹将步骤a配制好的培养基按3ml体积分装至多个25ml已灭菌的厌氧瓶中，并向每个厌氧瓶中加入地衣芽孢杆菌菌液ΐ〇μ1，胶塞封闭后置于3〇°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到2X109CFUml，所述摇床的转速为150rpm;[0083]c向步骤⑹形成的各培养基中分别加入胎牛血清180μ1，马血清270μ1和无菌淀粉7.5mg后放置于15°C恒温培养箱中备用，此时鲩肠袋虫体外培养的培养基制作完成。[0084]上述所述的鲩肠袋虫的体外培养方法，包括如下步骤：[0085]1将上述装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶取出几个，备用；[0086]2将草鱼用MS-222麻醉后放入解剖盘，用无菌水冲洗肛门附近，用无菌解剖剪解剖草鱼，取出内脏，剪取后肠部分置于直径9cm的无菌培养皿中，使用小的解剖剪将后肠全部剖开，用无菌解剖刀刮取肠内容物于直径5.5cm无菌培养皿中，加入5ml浓度为0.65%wV的无菌生理盐水，静置3min，在解剖镜下检查内容物中寄生的鲩肠袋虫，发现虫体后用无菌胶头滴管吸取虫体于另一装有浓度为0.65%wv的无菌生理盐水的培养皿中，清洗3次后更换新的无菌生理盐水，置于15°C恒温培养箱中静置30min;[0087]3取出恒温培养箱中的培养基和装有鲩肠袋虫的培养皿，用无菌胶头滴管吸取10只形态正常、状态活跃的虫体接种至装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶中，连续充氮气4min后密封厌氧瓶，置于15°C恒温培养箱中静置培养60h;[0088]4取出步骤3恒温培养箱中装有培养物的厌氧瓶，倒出培养物至无菌培养皿中，在解剖镜下用无菌胶头滴管将所有虫体转移至另一个新鲜的装有3ml鲩肠袋虫体外培养培养基的厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气4min后密封，继续放入15°C恒温培养箱中培养60h;[0089]5将步骤4恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至另一个厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气4min后密封，采用步骤4相同的培养条件继续培养60h;[0090]6将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔60h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖，实验期间及时准备新鲜的鲩肠袋虫体外培养培养基。[0091]上述所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。[0092]本实施例鲩肠袋虫体外培养的研究实验同样持续了1年时间，虫体每60h观察计数一次。在1年时间内，培养基中的鲩肠袋虫虫体始终保持旺盛的繁殖力和活力。[0093]另外，发明人在显微镜下对本实施例鲩肠袋虫在体外培养1年后的鲩肠袋虫活体和正在分裂的鲩肠袋虫个体分别进行了观察，结果表明，本实施例制得的培养基能够使鲩肠袋虫实现稳定分裂增殖和长期稳定培养，且在培养过程中保持旺盛的生命力和繁殖力。[0094]实施例4[0095]本实施例的一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，所述培养基的配方组分及含量如下：任氏液IOOml、酵母提取物0.5g、_蛋白胨1.0g，胎牛血清5ml、马血清IOml、地衣芽孢杆菌菌液500μ1、无菌淀粉300mg;[0096]其中:所述的任氏液的配方及制备方法与实施例1完全相同。[0097]本实施例上述所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，包括如下步骤：[0098]a准确称取酵母提取物0.5g和豚蛋白胨I.Og于250ml锥形瓶中，加入任氏液IOOml，调节pH至7.0〜7.5，锡箱纸封口后121°C高温高压灭菌20min，培养基冷却后4°C保存；[0099]⑹将步骤a配制好的培养基按5ml体积分装至多个25ml已灭菌的厌氧瓶中，并向每个厌氧瓶中加入地衣芽孢杆菌菌液25μ1，胶塞封闭后置于30°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到4X109CFUml，所述摇床的转速为150rpm;[0100]c向步骤⑹形成的各培养基中分别加入胎牛血清250μ1，马血清500μ1和无菌淀粉15mg后放置于15°C恒温培养箱中备用，此时鲩肠袋虫体外培养的培养基制作完成。[0101]上述所述的鲩肠袋虫的体外培养方法，包括如下步骤：[0102]1将上述装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶取出几个，备用；[0103]⑵将草鱼用MS-222麻醉后放入解剖盘，用无菌水冲洗肛门附近，用无菌解剖剪解剖草鱼，取出内脏，剪取后肠部分置于直径9cm的无菌培养皿中，使用小的解剖剪将后肠全部剖开，用无菌解剖刀刮取肠内容物于直径5.5cm无菌培养皿中，加入5ml浓度为0.65%wV的无菌生理盐水，静置3min，在解剖镜下检查内容物中寄生的鲩肠袋虫，发现虫体后用无菌胶头滴管吸取虫体于另一装有浓度为0.65%wv的无菌生理盐水的培养皿中，清洗3次后更换新的无菌生理盐水，置于15°C恒温培养箱中静置25min;[0104]3取出恒温培养箱中的培养基和装有鲩肠袋虫的培养皿，用无菌胶头滴管吸取10只形态正常、状态活跃的虫体接种至上述装有鲩肠袋虫体外培养基的厌氧瓶中，连续充氮气5min后密封厌氧瓶，置于15°C恒温培养箱中静置培养48h;[0105]4取出步骤3恒温培养箱中装有培养物的厌氧瓶，倒出培养物至无菌培养皿中，在解剖镜下用无菌胶头滴管将所有虫体转移至另一个新鲜的装有5ml鲩肠袋虫体外培养培养基的厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气5min后密封，继续放入15°C恒温培养箱中培养48h;[0106]5将步骤4恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至另一个厌氧瓶中，与此同时记录下全部虫体的数目，然后将厌氧瓶充氮气5min后密封，采用步骤4相同的培养条件继续培养48h;[0107]6将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔48h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖，实验期间及时准备新鲜的鲩肠袋虫体外培养的培养基。[0108]上述所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。[0109]本实施例鲩肠袋虫体外培养的研究实验持续了1年时间，虫体每2天观察计数一次。在1年时间内，培养基中的鲩肠袋虫虫体始终保持旺盛的繁殖力和活力。[0110]另外，发明人在显微镜下对本实施例鲩肠袋虫在体外培养1年后的鲩肠袋虫活体和正在分裂的鲩肠袋虫个体也分别进行了观察，结果表明，本实施例制得的培养基能够使鲩肠袋虫实现稳定分裂增殖和长期稳定培养，且在培养过程中保持旺盛的生命力和繁殖力。

权利要求：1.一种应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，其特征在于:所述培养基的配方组分及含量如下：任氏液IOOml、酵母提取物0.5g、豚.蛋白胨I.Og，胎牛血清3〜6ml、马血清6〜IOml、地衣芽抱杆菌菌液300〜500μ1、无菌淀粉200〜300mg。2.根据权利要求1所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基，其特征在于:所述的任氏液的配方成分及含量如下:氯化钠6.5g，氯化钾0.14g，氯化钙0.12g，碳酸氢钠0.2g，磷酸二氢钠0.Olg，蒸馏水IOOOml。3.—种权利要求1所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括如下步骤：a准确称取酵母提取物0.58和_蛋白胨I.Og，加入任氏液IOOml，调节pH至7.0〜7.5，高温高压灭菌后，4°C保存；⑹将步骤a形成的培养基按3〜5ml体积分装至多个无菌厌氧瓶中，并分别向各厌氧瓶内加入地衣芽孢杆菌菌液9〜25μ1，置于30°C条件下微生物摇床内培养至浓度达到2XIO9〜6XIO9CFlVml;c向步骤b形成的各培养基中分别加入胎牛血清90〜250μ1，马血清180〜500μ1和无菌淀粉6〜15mg后置于15°C条件下，备用。4.根据权利要求3所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，其特征在于：步骤a所述的灭菌温度为121°C，灭菌时间为20min。5.根据权利要求3或4所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，其特征在于:步骤⑹所述的摇床的转速为150rpm。6.根据权利要求3或4所述的应用于鲩肠袋虫体外培养的培养基的制备方法，其特征在于:所述的任氏液采用如下方法制备而成：⑴依次将氯化钠6.5g、氯化钾0.14g、碳酸氢钠0.2g、磷酸二氢钠0.Olg溶于999ml蒸馏水中，制得溶液1;ii配制质量浓度为12%的CaCl2溶液；iii取Iml步骤（ii所述的CaCl2溶液加入到溶液1中，混合均匀后，制得所述的任氏液，常温保存备用。7.—种鲩肠袋虫的体外培养方法，其特征在于:包括如下步骤：1准备多个已灭菌的厌氧瓶，每个厌氧瓶中分别装有3〜5ml权利要求1或2所述的鲩肠袋虫体外培养的培养基；2解剖草鱼肠道，在解剖镜下提取鲩肠袋虫，置于装有无菌生理盐水的无菌培养皿中，轻轻吹打清洗2〜3次后，更换无菌生理盐水，然后置于15°C恒温培养箱内静置一段时间；3在解剖镜下将步骤2静置后的培养皿内游离的虫体取出，接种至步骤（1中的一个厌氧瓶中，连续充入氮气3〜5min后密封，置于15°C条件下恒温培养48〜72h;4将上一步骤恒温培养后厌氧瓶内的所有虫体转移至下一个厌氧瓶中，然后向厌氧瓶中连续充入氮气3〜5min后密封，采用上一步骤相同的培养条件继续培养，每隔48〜72h重复转移、培养一次，使鲩肠袋虫持续繁殖。8.根据权利要求7所述的鲩肠袋虫的培养方法，其特征在于:所述的无菌生理盐水的质量体积浓度为0.65%。9.根据权利要求7所述的鲩肠袋虫的培养方法，其特征在于:所述的氮气为纯氮，氮气纯度大于99.99%。10.根据权利要求7所述的鲩肠袋虫的培养方法，其特征在于:步骤2所述静置时间为20〜30min。

百度查询： 中国科学院水生生物研究所 一种鲩肠袋虫的体外培养方法及使用的培养基的制备方法

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