申请/专利权人：国家海洋局第一海洋研究所

申请日：2017-12-21

公开（公告）日：2021-02-05

公开（公告）号：CN107964517B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A23K10/18(20160101);A23K50/80(20160101);C12R1/07(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.05#授权;2018.05.22#实质审查的生效;2018.04.27#公开

摘要：本发明公开了一株可拮抗多种水产养殖病原细菌的细菌菌株及其应用。本发明的拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensInAD‑160，微生物保藏号为CGMCCNo.14030。本发明的解淀粉芽孢杆菌InAD‑160是从印度洋深层海水中分离获得的，能抑制迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、腐败希瓦氏菌Shewanellaputrefaciens、创伤弧菌Vibriovulnificus等多种水产养殖病原菌的生长，可用于防治由迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌、创伤弧菌等细菌引起的水产养殖病害。本发明从深海获得的解淀粉芽孢杆菌InAD‑160是一株防治效率高、防治范围广的生物防治潜力菌株，具有良好的应用开发前景。

主权项：1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）的保藏编号为CGMCCNo.14030。

全文数据：一种可拮抗多种水产养殖病原菌的芽孢杆菌及其应用技术领域[0001]本发明属于有益菌筛选技术领域，具体涉及一种可拮抗多种水产养殖病原菌的芽孢杆菌及其应用。背景技术[0002]我国是世界水产养殖大国，是世界上唯一一个养殖产量超过捕捞产量的国家。然而在我国无论是沿海还是内陆地区水产养殖每年都不同程度地受到养殖病害的影响，给养殖行业造成巨大的损失和危害。在水产养殖病害中细菌性病害相对较多，流行的也相对较广。比如肠杆菌科爱德华菌属的迟缓爱德华氏菌，是一种革兰氏阴性肠道病原菌，已经在二十多种鱼类中引起了病害，如鳗麵，牙鲆，罗非鱼，中华鳖，鲤鱼等，给水产养殖造成了巨大损失;迟钝爱德华氏菌也是一种人、鱼共患病原菌，直接对人类健康造成了威胁。再例如弧菌科气单胞菌属的嗜水气单胞菌，广泛存在于淡水、污水和土壤中，能引发多种水生动物的传染病，导致水产动物的出血症，是我国淡水养殖鱼类爆发性传染病的主要病原；另外嗜水气单胞菌感染的主要对象是水产动物性食品，不仅能引起动物的感染，也能引起人的急性胃肠炎、败血症等，因而其成为水产养殖和食品公共卫生共同关注的重要病原菌。[0003]目前我国针对细菌性水产病害的防治手段依然主要依赖抗生素等化学药物，抗生素治疗等措施能够达到部分控制疾病发生、促进养殖动物生长的目的，但由此带来的病原微生物耐药性、药物残留、水环境污染和水产品质量安全等问题越来越严重；同时，由于这些药物的长期使用，在杀灭病原生物的同时也损坏了养殖动物皮肤、肠道等所拥有的正常微生物屏障，使那些原来被正常菌群屏障所抑制的内源性病原菌或外源性病原菌得以大量繁殖，摧毁养殖动物表皮和肠道正常微生物群的微生态平衡，造成养殖动物疾病发生情况雪上加霜。利用自然环境中的拮抗微生物抑制病原菌，防治养殖动物的病原侵袭，控制病害发生，即生物防治一直是一个研究热点。从自然界分离、鉴定或通过生物工程人工组建有益微生物，开发经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成含有活菌并用于动物的生物制剂或活菌制剂有重要的理论意义和实际应用价值。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一株可拮抗多种水产病原菌的海洋解淀粉芽孢杆菌;经广泛筛选，从印度洋海水样品中获得一株解淀粉芽孢杆菌，该菌对多种水产养殖病原菌如迟缓愛德华氏菌Edwardsiellatarda、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、创伤弧菌Vibriovulnificus、腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens的生长均有显著抑制作用。[0005]本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensInAD-160株，是从印度洋深层海水样品中分离出来的一株革兰氏阳性菌。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.14030,保藏日期为2017年04月14号。[0006]本发明的淀粉芽孢杆菌InAD-160在制备拮抗海水养殖病原菌的生物制品中的应用；[0007]本发明再一个方面提供一种生物制品，该生物制品用于拮抗海水养殖病原菌；[0008]所述的海水养殖病原菌，为迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌或腐败希瓦氏菌；[0009]所述的生物制品，为发酵菌液或菌粉。[0010]本发明筛选获得的解淀粉芽孢杆菌InAD-160来源于深海，其生长适温、适盐、适PH范围广，其菌株菌液、菌株发酵培养液、发酵培养液的过滤液对淡水、海水养殖环境的多种水产养殖病原菌均有显著抑制作用，在应用方面具有良好的前景。附图说明[0011]图1:解淀粉芽孢杆菌InAD-160对迟缓爱德华氏菌生长的抑制图。具体实施方式[0012]为了更好了解本发明，以下通过实施例作进一步说明。[0013]实施例1解淀粉芽胞杆菌InAD-160分离鉴定与保藏[0014]步骤1.菌株分纯培养:本发明所获得菌株InAD-160的原始样品采集地点为印度洋某站位E88°;S4°底层海水。样品采集后，取1毫升海水样品加无菌甘油至终浓度为20%，立即放入-80°C冰箱保存，带回实验室后取出样品化冻无菌涂布到MA2216E培养基Difco，货号：212185上，用涂布好的培养皿倒置于25°C培养24-96小时，挑取长出的单菌落，在MA2216E培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25°C培养24-96小时，挑取长出的单菌落，再次在MA2216E培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25°C培养24-96小时，待单一菌落长出，在分纯一次。挑取连续分纯3次的单菌落到2ml含甘油终浓度为20%的MB2216培养基Difco,货号：279110中放入-80°C冰箱保存备用，同时留存连续分纯3次的InAD-160平皿备用。[0015]步骤2.菌株的16SrRNA基因的扩增与序列分析[0016]16SrRNA基因模板的制备:从InAD-160保存备用平皿上挑取单菌落到MA[0017]2216E培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25°C培养24-96小时，待单一菌落长出，用灭菌的牙签挑取2〜3个单菌落于20yLRNAfree水中混匀，菌液浓度略微浑浊即可。置于PCR仪，99°C，15min。取上清液做为PCR扩增模板。[0018]PCR扩增：PCR扩增所用引物为27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R5’-GGTTACCTTGTTACGACTTI’hPCR反应体系60yL:2XTaqMix30yL，引物：27F，1492R各3yL，模板3yL，无菌水补足至60μΙ^ΡΟ?反应条件：95°C，5min;94°C，45s;57°C，lmin30s;72°C，Imin30s，30个循环;72°C，10min。将PCR产物测序，其16SrRNA基因序列比对后将InAD-160鉴定与解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens最接近。[0019]解淀粉芽孢杆菌InAD-160通过16SrDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是1^3；[11118属的1^13；[111183111710119116€3^6118，同源性为99.8%，因此该菌为被命名为解淀粉芽孢杆菌InAD-160。[0020]该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.14030,保藏日期为2017年04月14号。[0021]在实验室中，该菌株长期保藏方式为将菌株加入含20%甘油的MB2216培养基DifCo，货号:279110培养基中，在-80°C保存;短期保藏方式为将菌株接种在MA2216E培养基DifCo，货号:212185斜面上，在4°C保存备用。[0022]本发明涉及的菌株具有如下特征：[0023]1形态学特征:在MA2216E培养基上，28°C培养24h后，菌落直径大小为l-2mm，乳白色，圆形，鼓起，边缘不整齐。[0024]2生理生化特性:该菌可生长盐度范围为0%_35%wv最适，生长pH范围为3.5-8.5最适7.0-8.0，生长温度范围为10°〇55°：最适25°：-30°：。该菌氧化酶反应阴性，过氧化氢酶反应阳性，有蛋白酶、溶菌酶、尿素酶活性，可利用柠檬酸盐，可还原硝酸盐。在利用API50CH进行的细菌糖代谢研究中，菌株在以下的物质中都能产酸，表现为阳性:甘露醇、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、甲基-aD-吡喃甘露糖苷、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-棉子糖、淀粉、糖原、D-龙胆二糖;在以下的物质中都不能产酸，表现为阴性:赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇、甲基-β-吡喃木糖苷、D-半乳糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、卫矛醇、甲基-aD-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、菊粉、D-松三糖、木糖醇、D-土伦糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇、葡萄糖酸钾、2酮基葡萄糖酸钾和5酮基葡萄糖酸钾。[0025]4抑菌特征:利用打孔法孔径IOmm对解淀粉芽孢杆菌InAD-160进行抑菌特性测定，结果表明该菌对多种水产养殖病原菌迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌、腐败希瓦氏菌的生长均有显著抑制作用，其抑菌如下表1所示：[0026]表1打孔法测定解淀粉芽孢杆菌InAD-160对水产养殖病原菌的抑菌特性[0027][0028]实施例2.解淀粉芽胞杆菌InAD-160的应用[0029]步骤1.解淀粉芽胞杆菌InAD-160菌液的制备:取-80°C保存的菌种在2216E海水固体培养基划线，在25°C_30°C培养，挑取单菌落接种在新鲜的2216E海水液体培养基在25-30°C、120-200rpm发酵培养48h获得发酵液，发酵液菌种密度在IX109ml。[0030]步骤2.饵料制备:本实验中所用基础饵料为三通生物工程潍坊有限公司仔稚鱼饵料。按每IOg基础饵料拌4ml发酵液的标准制备实验组饵料，对照组饵料用养殖海水拌料。[0031]步骤3.大菱鲆养殖:平均体长为8.37±1.13cm，平均体重为9.2±1.99g的健康大菱鲆180尾，暂养在循环水养殖系统1周后随机分为实验组和对照组两个处理组，每个处理组3个平行，每个平行组放鱼30尾。实验组和对照组分别投喂加InAD-160菌液的饵料和基础饵料，每日投喂饵料1次，初始每组投喂量均为l〇g，后期根据饲养鱼的摄食情况调整投饵量。实验期间每周换水2次，换水量为23。养殖水温16-19°C，连续充气。[0032]步骤4.大菱鲆生长指标测定:在步骤3养殖试验进行5周后换水前，停食24h，各组养殖鱼称质量。统计各组鱼的体重和增重率:增重率=终末体质量-初始体质量初始体质量）X100%，实验组为（80.7±11.2%，对照组为（28.3±9.6%。因此，解淀粉芽孢杆菌InAD-160能提高大菱鲆增重率。[0033]步骤5.养殖大菱鲆的抗病力:取在2216E海水固体培养基上培养48h的迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda用无菌海水悬浮至浓度为5.8X105CFUmL，即为攻毒菌液，取步骤3养殖试验进行6周后的各组实验鱼，每尾腹部肌肉注射ΙΟΟμΙ上述攻毒菌液。3天后，统计各组鱼的累积死亡率:实验组为（50.3±2.5%，对照组为100%。因此，解淀粉芽孢杆菌InAD-160能提高大菱鲆抵御迟缓爱德华氏菌感染的能力。

权利要求：1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.14030。2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备拮抗海水养殖病原菌的生物制品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的海水养殖病原菌为迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌或腐败希瓦氏菌。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物制品为发酵菌液或菌粉。5.—种生物制品，其特征在于，所述的生物制品是使用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌制备的。6.如权利要求5所述的生物制品，其特征在于，所述的生物制品为发酵菌液或菌粉。

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