申请/专利权人：广西壮族自治区农业科学院

申请日：2021-03-01

公开（公告）日：2021-05-18

公开（公告）号：CN112813187A

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2021.06.04#实质审查的生效;2021.05.18#公开

摘要：本发明公开了一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，本发明利用一代测序检测Pita在高抗稻瘟病材料Y244和感病品种日本晴中差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变。在设计的正向引物中引入这两个碱基的差异，并在此基础上增加两条不同荧光标记通用引物，开发基于PARMS技术的水稻稻瘟病抗性基因Pita的荧光功能分子标记，便于Pita基因在水稻抗性分子育种上应用。

主权项：1.一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，其特征在于：包括如下步骤：1水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定多份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZB1和ZB9的材料Y224；2Pita基因结构分析：提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件VectorNTI11分析Pita基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变；3Pita基因功能标记的设计与合成：根据Pita编码区555位点G→A突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-Pita，该标记由3条Pita基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：正向引物Pita-Ra：TGACACCCTGCGATGCAAGAAGGTGACCAAGTTCATGCT；正向引物Pita-Rg：TGACACCCTGCGATGCACGAAGGTCGGAGTCAACGGATT；反向引物Pita-F：CAGCAACTAACGAGGCATAATCT；另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；4PARMS-Pita的使用：标记的3条根据Pita基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，Pita等位基因序列根据SNP差异与正向引物Pita-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物Pita-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；5Pita基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-Pita对稻瘟病基因Pita分型，将所设计的3条引物Pita-Fg、Pita-Fa和Pita-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL2×PARMSmastermix，0.15μL10mMPita-Fg标记引物，0.15μL10mMPita-Fa标记引物，0.4μL10mMPita-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μLddH2O；PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNPdecoderhttp:www.snpway.comsnpdecoder01软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号，蓝色的是抗稻瘟病Pita等位基因T类型材料，描获得HEX荧光信号，绿色的是感稻瘟病PitaG类型材料，灰色为阴性对照；6PARMS-Pita有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 广西壮族自治区农业科学院 一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用

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