申请/专利权人：中国科学院化学研究所

申请日：2019-04-25

公开（公告）日：2021-06-04

公开（公告）号：CN110058014B

主分类号：G01N33/535(20060101)

分类号：G01N33/535(20060101);G01N33/533(20060101);G01N33/68(20060101);G01N21/64(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.04#授权;2019.08.20#实质审查的生效;2019.07.26#公开

摘要：本发明实施例公开了一种用于筛选LRPPRC调控剂的产品及鉴定LRPPRC调控剂的方法，包括试剂盒和装置，试剂盒包括重组LRPPRC蛋白、GST蛋白、荧光素标记的核酸适配体R14、以及荧光素标记的对照核酸；装置包括多孔板和荧光偏振信号检测仪。本发明实施例使用短的核酸适配体，核酸适配体相比天然存在的RNA及DNA序列来讲具有更加短的序列与分子量，这保证了筛选过程中偏振信号检测窗口足够大，使得检测信噪比有很好的保证；无需预先对目标蛋白进行精细的晶体结构分析，可以极大的降低了药物筛选的门槛；该筛选方法对于核酸结合蛋白具有很好的通用性，极易推广。

主权项：1.一种基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，所述LRPPRC调控剂为GAA，所述GAA用于抑制LRPPRC蛋白与核酸的结合，包括以下步骤：1原核表达纯化LRPPRC蛋白和GST蛋白；2通过SELEX筛选，得到与LRPPRC结合蛋白特异性结合的核酸适配体R14，将得到的核酸适配体R14进行荧光素标记，并荧光标记对照核酸，所述对照核酸的序列为AATTTTTTAATTATTTATATTA；3分别将LRPPRC蛋白与荧光标记的核酸适配体R14混合、将LRPPRC蛋白与荧光标记对照核酸混合、将荧光标记的核酸适配体R14与GST蛋白混合，加入多孔板不同的孔中；4向各孔中加入GAA；5以荧光偏振信号检测仪检测步骤3中各混合物的荧光偏振信号。

全文数据：用于筛选LRPPRC调控剂的产品及鉴定LRPPRC调控剂的方法技术领域本发明实施例涉及生物医药领域，特别涉及一种用于筛选LRPPRC调控剂的产品及鉴定LRPPRC调控剂的方法。背景技术分子靶向治疗是现阶段疾病治疗的理论基础，包括肿瘤、心血管系统、神经系统疾病都急切需要临床可用的特异性分子抑制剂。现阶段，针对蛋白靶点的药物设计开发主要局限在以下两方面：第一主要针对具有激酶活性的生物进行药物开发，开发的靶向性药物也主要以抑制蛋白的酶活性为主，如癌症治疗中的吉非替尼抑制EGFR激酶活性、达沙替尼抑制SRC激酶活性、心血管系统他汀类药物抑制HMG-CoA还原酶活性等等。然而细胞内真正具有酶活性的蛋白质种类只占蛋白总数的很少比例，并且能作为药物靶点的蛋白酶类则更少了。第二针对蛋白酶类的酶活性抑制剂设计筛选极度依赖于对蛋白结构的理解基础，在缺少蛋白晶体结构的前提下，蛋白抑制剂的筛选将面临极大的挑战。因此，亟需针对更多的、尤其是非酶类的蛋白靶点开发有效的药物筛选体系，来提高分子靶向治疗的效率。核酸结合蛋白是一类可以特异性的和核酸结合的一个蛋白家族，根据结合的核酸类型可分为RNA结合蛋白和DNA结合蛋白。该类蛋白质一般具有保守的核酸结合域，该结构域可以选择性的与具有特定碱基序列的RNA或者DNA结合。现已经证实，核酸结合蛋白在DNA复制、DNA损伤修复、基因转录、蛋白翻译等几乎所有的生命活动过程中发挥着至关重要的作用，在诸如恶性肿瘤、心脑血管疾病、传染性疾病等人类生命健康相关的疾病中起着不可或缺的作用。以RNA结合蛋白LRPPRC为例，要想筛选到能阻断LRPPRC与RNA结合的小分子调控剂，需要知道LRPPRC结合的核酸特征，也就是保守的结合功能域motif，但是很多时候无法知晓绝大部分的LRPPRC结合RNA的motif，即使已知LRPPRC结合mRNA的motif，体外转录、回收获得RNA也存在很复杂的操作流程，并且RNA容易降解，容易导致系统不稳定。因此亟需提供一种更稳定、更通用、更灵敏的鉴定LRPPRC调控剂的方法。发明内容本发明实施方式的目的在于提供一种用于筛选LRPPRC调控剂的产品及鉴定LRPPRC调控剂的方法，提供了一种更稳定、更通用、更灵敏的以核酸结合蛋白为靶点的鉴定LRPPRC调控剂的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于筛选LRPPRC调控剂的产品，包括试剂盒和装置，所述试剂盒包括重组LRPPRC蛋白、GST蛋白、荧光素标记的核酸适配体R14、以及荧光素标记的对照核酸；所述装置包括多孔板和荧光偏振信号检测仪。进一步，所述重组LRPPRC的浓度与GST蛋白浓度相同，均为14-136μgmL，优选68-120μgmL。进一步，所述核酸适配体R14的序列为GGTGGGTGGGTTGGGTGG，所述对照核酸的序列为AATTTTTTAATTATTTATATTA；所述荧光标记的核酸适配体R14与荧光标记的对照核酸浓度相同，储备液浓度均为100nM，工作液浓度均为10-8M。进一步，所述荧光偏振信号检测仪是酶标仪，优选InfiniteM1000PROplatereader酶标仪。进一步，所述产品用于筛选LRPPRC蛋白负调控剂或C端结合剂。本发明还提供一种基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，包括：1原核表达纯化LRPPRC蛋白和GST蛋白；2合成荧光素标记的核酸适配体R14和荧光标记对照核酸，所述对照核酸的序列为AATTTTTTAATTATTTATATTA；3分别将LRPPRC蛋白与荧光标记的核酸适配体R14混合、将LRPPRC蛋白与荧光标记对照核酸混合、将荧光标记的核酸适配体R14与GST混合，加入多孔板中不同的孔中；4向各孔中加入候选分子；5以荧光偏振信号检测仪检测步骤3中各混合物的荧光偏振信号。进一步，所述步骤3还包括DMSO空白对照。进一步，所述LRPPRC、GST的反应浓度均为120μgmL，所述荧光标记的核酸适配体R14、荧光标记对照核酸的反应浓度均为40nM；所述候选分子的工作浓度为24μM。进一步，本发明所述方法还包括采集所述孔板上每个孔的荧光信号以及偏振光信号；与DMSO孔的信号进行归一化处理，加入小分子化合物后，所述孔的偏振光信号的抑制率大于50％；且荧光信号自身的变化小于1.5倍的小分子化合物，即为LRPPRC负调控剂。进一步，本发明所述方法为高通量筛选方法。本发明实施方式相对于现有技术而言，通过SELEX筛选，可以在不知晓RNA结合的motif前提下，得到与LRPPRC结合蛋白特异性结合的核酸适配体，将得到的核酸适配体进行荧光素标记与LRPPRC结合蛋白相互作用形成核酸-蛋白复合物，此时处于高偏振光信号状态，将小分子化合物添加到核酸-蛋白复合物体系中，能够阻断蛋白核酸结合功能的化合物可以将荧光标记的核酸适配体从蛋白上解离，处于低偏振光信号状态，由于核酸适配体碱基数量更少，分子量更小，根据偏振光检测原理，分子量越小的情况下，偏振光变化会更显著，根据偏振光信号的抑制率大于50％；且荧光信号自身的变化小于1.5倍的筛选条件得到符合条件的LRPPRC负调控剂。附图说明一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。图1是本发明实施例1中采用westernblot检测各条核酸适配体序列富集到的LRPPRC、Actin的蛋白水平；图2是本发明实施例2中5个LRPPRC片段；图3是本发明实施例2中采用westernblot检测各条核酸适配体序列富集到的GST标签；图4是本发明实施例3中各个反应体系的偏振信号值与浓度反应曲线；图5是本发明实施例3中各个LRPPRC蛋白浓度梯度下的信噪比SN以及Z因子值；图6是本发明实施例4中850种小分子化合物抑制LRPPRC与核酸结合的效果图；图7是本发明实施例4中20种候选小分子化合物偏振光抑制率示意图；图8是本发明实施例5中不同GAA浓度下LRPPRC蛋白的荧光光谱变化曲线；图9是本发明实施例5中不同GAA浓度下GAA与LRPPRC的混合后温度变化曲线；图10是本发明实施例6中不同GAA浓度、不同时间下LRPPRC蛋白的变化趋势图；图11是本发明实施例6中不同化合物处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞中CDK6的mRNA的富集量。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。核酸适配体是在体外通过SELEXSystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment方法筛选到可以与给定的特定靶标的特异性结合的寡核苷酸片段。该类核酸适配体具有分子量小、特异性强、结合能力大等多重优势，近年来逐渐在分子分析、生物表征、药物递送等领域显示明显的优势。荧光偏振检测是分析化学领域一种经典的分析方法，是表征分子与分子相互作用的基本手段。该方法的基本原理是其基本原理是荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。小分子大小的荧光分子的偏振信号较弱，当小分子荧光物质与大分子物质相互结合后，整体分子量急剧增加，分子振动变慢，偏振信号显著增加。理论上荧光标记的核酸适配体在与大分子量的靶标蛋白结合后会有偏振光的变化，然而，现阶段仍然没有将核酸适配体筛选与偏振光检测组合用于高通量药物筛选的报道。实施例1验证核酸适配体R14与LRPPRC的特异性结合免疫共沉淀法证明LRPPRC蛋白与核酸适配体R14特异性结合1离心收集细胞，裂解后12000g离心收集细胞裂解液；2合成生物素标记的AS1411以及R14，AS1411是已报道的特异性结合蛋白质核仁素的核酸适配体；R14是通过LRPPRC蛋白筛选得到的核酸适配体，其中R14:GGTGGGTGGGTTGGGTGG；AS1411:GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，加水溶解，配成100nM的储存液体；3用含5mMMgCl2的PBS配置蛋白-核酸适配体的混合物，蛋白500ug，核酸适配体200pm，终体积1ml；4蛋白-核酸适配体的混合物室温作用30min后，加入50ul链霉亲和素包被的beads回收生物素标记的核酸适配体-蛋白复合物；5将获得的的适配体-蛋白复合物用PBS洗涤三次后，加入30ul蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min；6采用westernblot检测各条核酸适配体序列富集到的LRPPRC、Actin的蛋白水平，具体如图1所示，由图1可知，核酸适配体R14可以很好的与LRPPRC蛋白结合。实施例2LRPPRC蛋白片段化，证明核酸适配体R14结合在LRPPRC蛋白的C末端1根据LPRRC蛋白的序列特征，将LRPPRC设计切割成5个片段，分别记为LRP1-LRP5，具体如图2所示；2将所有的LRPPRC片段整合到GST表达质粒上，大肠杆菌中进行原核表达纯化，将得到的LRPPRC原核表达蛋白溶解在PBS中；3配置LRPPRC片段化蛋白-生物素标记R14的混合物，蛋白片段100ug，生物素标记R14为200pmol，终体积1ml；4LRPPRC片段蛋白-R14的混合物室温作用30min后，加入50ul链霉亲和素包被的beads回收生物素标记的R14-LRPPRC片段蛋白复合物；5将获得的R14-LRPPRC片段蛋白复合物用PBS洗涤三次后，加入30ul蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min；6采用westernblot检测各条核酸适配体序列富集到的GST标签，实验结果如图3所示，在LRPPRC片段蛋白6中LRP6检测到GST标签，而其他的片段蛋白中没检测到GST标签，说明只有LRPPRC蛋白片段LRP6跟R14有结合，即核酸适配体R14与LRPPRC的C末端结合。实施例3为了验证核酸适配体-LRPPRC蛋白偏振筛选体系是否适用高通量药物筛选体系，本实施例分别通过以下两个方面进行验证：一：筛选系统特异性验证对核酸进行FITC标记后，验证系统的特异性1原核表达纯化LRPPRC蛋白，GST蛋白作为对照蛋白，BCA法进行定量；2合成荧光素标记包括但不限于HEX、CY3、CY5等荧光标记方法的LRPPRC特异性核酸适配体AptamerR14，GGTGGGTGGGTTGGGTGG以及无关对照序列controlDNA，AATTTTTTAATTATTTATATTA，配置成100nM的储备液；2配置蛋白与核酸序列的复合物，LRPPRC特异性核酸适配体及无关对照序列浓度都为10-8M，GST空载蛋白或者LRPPRC蛋白浓度梯度为0，7，14，34，68，136ugml，室温放置30min；330min后，用InfiniteM1000PROplatereaderTecan,Switzerland酶标仪检测各个反应体系的偏振信号值；4根据各个反应体系的偏振信号值绘制浓度反应曲线，具体如图4所示。由图4可知，核酸适配体R14与LRPPRC蛋白结合后偏振信号可达将近300mp，大大高于其他报道的核酸-蛋白结合的偏振信号，该优势是因为用到的核酸适配体片段小，分子量小。同时R14与GST对照蛋白结合、对照序列RTT与LRPPRC结合的偏振信号都显著低于R14与LRPPRC蛋白结合的。充分筛选过程中核酸与蛋白结合的特异性。二：筛选体系高通量筛选适应性验证测定整个反应体系的信噪比与Z因子变异区间，评判筛选体系是不是适用于高通量筛选1原核表达纯化LRPPRC蛋白，BCA法进行定量；2合成荧光素标记包括但不限于HEX、CY3、CY5等荧光标记方法的LRPPRC特异性核酸适配体AptamerR14，GGTGGGTGGGTTGGGTGG配置成100nM的储备液；2配置LRPPRC-R14的复合物，R14浓度一直为10-8M，LRPPRC蛋白浓度梯度为0,7,14,34,68,136ugml，室温放置30min。以只加荧光标记R14不加LRPPRC蛋白的孔作为对照背景孔；330min后，用InfiniteM1000PROplatereaderTecan,Switzerland酶标仪检测，计算各个LRPPRC蛋白浓度梯度下的信噪比SN以及Z因子值，一般信噪比SN值大于8，Z值在0.5-1.0之间时，说明体系适用于高通量筛选。如图5所示，体系在蛋白浓度高于60ugml的时候，可以很好的满足高通量要求。实施例4按以上优化好的蛋白、核酸浓度，从含有850个小分子化合物的文库进行高通量筛选，从文库中筛选可以阻断核酸适配体R14与LRPPRC结合的小分子化合物，如图6所示，总计20种化合物可以阻碍LRPPRC与核酸的结合。从图7看出醋酸棉酚GAA显示出较强的LRPPRC抑制功能。具体的筛选方法如下：1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质；2体外合成荧光素标记包括但不限于HEX、CY3、CY5等荧光标记方法的LRPPRC特异性结合的核酸适配体R14-flu；3配置LRPPRC与R14-flu的复合物体系，以PBS作为缓冲液，浓度为LRPPRC120ugml，R14-flu40nM，于黑色不透光的384孔板中，每孔加入15ul的LRPPRC与R14-flu的复合物；4将850种小分子化合物用PBS分别稀释为60uM的储备液，于384孔板每个孔加入10ul，以DMSO孔作为对照，室温作用5min；5InfiniteM1000PROplate酶标仪对每个孔的荧光信号以及偏振光信号分别进行采集，与DMSO孔的信号进行归一化处理，计算每种小分子加入后，统计偏振光的抑制率以及荧光信号自身的变化倍数，以偏振光的抑制率为横坐标，以荧光信号自身的变化倍数为纵坐标得到图6，如图6所示，总计20种小分子化合物可以阻碍LRPPRC与核酸的结合，即总计20种负调控剂可以阻碍LRPPRC与核酸的结合；6筛选条件是偏振光信号的抑制率大于50％，而荧光值自身的变化小于1.5倍由于偏振光也受到荧光分子自身的荧光信号强度的影响，本实施例需要保证小分子加入后偏振光的变化是因为蛋白与核酸的结合被抑制了，而不是小分子的加入降低了荧光分子的荧光信号导致的。针对20种候选小分子化合物的偏振光抑制率进行统计，统计结果如图7所示，其中GAA显示出最大的偏振光抑制能力，也就是GAA作为负调控剂种的一种能最有效的抑制LRPPRC蛋白与核酸的结合。实施例5本实施例分别采用荧光滴定及等温量热的方法，检测LRPPRC与GAA的直接结合。一、荧光滴定法测定GAA与LRPPRC蛋白的直接结合1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质60ugml；2配置GAA的储备液浓度为50mM；3在LRPPRC蛋白液中添加浓度梯度的GAA，分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16，32uM；4采用FLS980fluorescencespectrometerEdinburghInstruments,Ltd.荧光光谱仪检测LRPPRC蛋白在300-380nm波段额荧光值变化。绘制在不同GAA浓度下LRPPRC蛋白的荧光光谱变化，具体如图8所示，从图8可以看出，随着GAA浓度的增加，LRPPRC蛋白的自发荧光逐渐降低。二、等温量热法ITC测定GAA与LRPPRC蛋白的直接结合1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质60ugml；2配置GAA的储备液浓度为50mM；3将GAA储备液分步滴入LRPPRC蛋白缓冲液，iTC200instrumentMicroCal,GE等温量热仪记录每次加入GAA后温度变化，实验结果如图9所示，从图9可以看出，GAA与LRPPRC的混合后有显著的放热现象。由上可知，荧光滴定及等温量热实验都证实LRPPRC与GAA存在直接结合。实施例6验证GAA抑制LRPPRC的分子功能实验本实施例主要从两个方面验证GAA对LRPPRC有抑制作用，具体如下：一、GAA直接降解LRPPRC蛋白1肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460培养至对数生长期，加入浓度梯度的GAA0、1、5、10uM，培养48小时后，离心收集细胞，裂解后获取细胞全蛋白。40ug总蛋白用于westernblot检测LRPPRC蛋白的变化趋势；2肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460培养至对数生长期，采用终浓度为10uM的GAA进行时间梯度实验，分别处理0、8、16、24小时。离心收集细胞，裂解后获取细胞全蛋白。40ug总蛋白用于westernblot检测LRPPRC蛋白的变化趋势，LRPPRC蛋白的变化趋势如图10所示。二、RIP实验RNAImmunoprecipitation验证GAA影响CDK6的mRNA与LRPPRC蛋白的结合：1胰酶消化收集肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460，裂解细胞提取细胞裂解液，往细胞裂解液中添加终浓度10uM的所示化合物GAA、7F2、1E5、10C5、11E10，以添加DMSO的样品作为NC对照。2每管添加2ug的LRPPRC抗体abcam公司，货号ab97505及50ul的proteinAG磁珠，四度过夜，孵育后，PBS洗涤，提取proteinAG磁珠上富集的mRNA，逆转录后进行Realtime-PCR扩增，检测CDK6的mRNA丰度，用DMSO处理样本的富集量进行归一化统计分析，统计结果如图11所示。由图10可知，在用GAA处理肿瘤细胞后，LRPPRC的蛋白水平显著下降。由图11可知，在用GAA处理肿瘤细胞后，用LRPPRC特异性抗体捕获到的能与LRPPRC特异性结合的CDK6的mRNA是显著减少的，说明GAA也可以阻断LRPPRC与mRNA的结合。综上所述，GAA可以通过降低LRPPRC基因表达或减弱LRPPRC蛋白活性来抑制肿瘤细胞的生长，从而达到治疗LRPPRC高表达肿瘤疾病的目的。与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：首先，本发明实施例使用短的核酸适配体R14，核酸适配体R14相比天然存在的RNA及DNA序列来讲具有更加短的序列与分子量，这保证了筛选过程中偏振信号检测窗口足够大，使得检测信噪比有很好的保证；其次该筛选方法在操作过程中，无需预先对目标蛋白进行精细的晶体结构分析，可以极大的降低了药物筛选的门槛；最后，该筛选方法对于广泛的核酸结合蛋白具有很好的通用性，极易推广。本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

权利要求：1.一种用于筛选LRPPRC调控剂的产品，其特征在于，包括试剂盒和装置，所述试剂盒包括重组LRPPRC蛋白、GST蛋白、荧光素标记的核酸适配体R14、以及荧光素标记的对照核酸；所述装置包括多孔板和荧光偏振信号检测仪。2.如权利要求1所述用于筛选LRPPRC调控剂的产品，其特征在于，所述重组LRPPRC的浓度与GST蛋白浓度相同，均为14-136μgmL，优选68-120μgmL。3.如权利要求1所述用于筛选LRPPRC调控剂的产品，其特征在于，所述核酸适配体R14的序列为GGTGGGTGGGTTGGGTGG，所述对照核酸的序列为AATTTTTTAATTATTTATATTA；所述荧光标记的核酸适配体R14与荧光标记的对照核酸浓度相同，储备液浓度均为100nM，工作液浓度均为10-8M。4.如权利要求1所述用于筛选LRPPRC调控剂的产品，其特征在于，所述荧光偏振信号检测仪是酶标仪，优选InfiniteM1000PROplatereader酶标仪。5.如权利要求1-4任一项所述用于筛选LRPPRC调控剂的产品，其特征在于，所述产品用于筛选LRPPRC蛋白负调控剂或C端结合剂。6.一种基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：1原核表达纯化LRPPRC蛋白和GST蛋白；2合成荧光素标记的核酸适配体R14和荧光标记对照核酸，所述对照核酸的序列为AATTTTTTAATTATTTATATTA；3分别将LRPPRC蛋白与荧光标记的核酸适配体R14混合、将LRPPRC蛋白与荧光标记对照核酸混合、将荧光标记的核酸适配体R14与GST蛋白混合，加入多孔板不同的孔中；4向各孔中加入候选分子；5以荧光偏振信号检测仪检测步骤3中各混合物的荧光偏振信号。7.如权利要求6所述基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，所述步骤3进一步包括DMSO空白对照。8.如权利要求6所述基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，所述LRPPRC、GST蛋白的反应浓度均为120μgmL，所述荧光标记的核酸适配体R14、荧光标记对照核酸的反应浓度均为40nM；所述候选分子的工作浓度为24μM。9.如权利要求6-8任一项所述基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，采集所述孔板上每个孔的荧光信号以及偏振光信号；与DMSO孔的信号进行归一化处理，加入小分子化合物后，所述孔的偏振光信号的抑制率大于50％；且荧光信号自身的变化小于1.5倍的小分子化合物，即为LRPPRC负调控剂。10.如权利要求6-8任一项所述基于荧光偏振信号检测鉴定LRPPRC调控剂的方法，其特征在于，所述方法为高通量筛选方法。

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