申请/专利权人：中国科学院昆明动物研究所

申请日：2016-11-08

公开（公告）日：2021-06-11

公开（公告）号：CN108059672B

主分类号：C07K14/815(20060101)

分类号：C07K14/815(20060101);C12N15/15(20060101);A61K38/58(20060101);A61P7/02(20060101);A61P9/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.06.11#授权;2018.07.20#实质审查的生效;2018.05.22#公开

摘要：本发明涉及一种森林山蛭Haemadipsasylvestris抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin是森林山蛭镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成。本发明森林山蛭抗血栓肽Sylvestin能够抑制FXIIa和kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑出血的作用；该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为制备FXIIa、kallikrein抑制剂和抗血栓和抑制急性脑出血药物应用。

主权项：1.森林山蛭抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。

全文数据：森林山蜂抗血栓肽SyIvestiη及其基因和应用技术领域[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种森林山輕（Haemadipsasylvestris抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用。背景技术[0002]脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的主要病因之一，也是世界性卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中，急性缺血性疾病的发病率居于首位，具有致残率高、死亡率高和复发率高的特点。全球脑卒中病死逾150万例年，随着老年人口的增加呈逐年增长的趋势，严重威胁着人类生命健康和生活质量。因此，研究治疗急性脑缺血的药物具有巨大的社会需求和重要的社会意义。[0003]急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中血栓形成导致血流不畅，进而造成血管梗死的结果。治疗急性脑缺血的关键措施之一是解除血管栓塞，恢复缺血区血液供应。因此，溶栓治疗成为临床治疗急性脑缺血的关键环节。溶栓药物的应用被临床证明能有效解除脑缺血，成为治疗急性脑缺血的主要方向。目前被美国FDA批准的抗脑缺血药物只有t-PA组织型纤溶酶原激活物一种，但该药仅在发病3h有效。t-PA的作用靶点是纤溶酶原，会导致较高的出血发生率。以FXIIa激活型凝血酶原十二因子和kallikrein激肽释放酶为作用靶点的药物出血倾向非常低，因此以它们为作用靶点，研究和开发新型药效好、副作用低的治疗抗血栓药物，具有良好的社会经济效益和市场前景。[0004]蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。[0005]森林山輕Haemadipsasylvestris，又称草輕。輕纲，水輕科。体略呈长椭圆形，长约3厘米。该物种的模式产地在緬甸长林山。分布于印度尼西亚、緬甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。我们首次从森林山蛭中识别了一个作用很强的FXIIa和kallikrein抑制剂Sylvestin。[0006]本发明涉及的多肽SyIvestin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓和抑制急性脑缺血活性。发明人将本发明的森林山輕抗血栓肽SyIvestin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的森林山蛭抗血栓肽Sylvestin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。发明内容[0007]本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗血栓性的森林山輕Sylvestin肽及其基因和应用。[0008]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：[0009]森林山輕抗血栓肽SyIvestin是森林山輕抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列（SEQIDNO:1为：TSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。[0010]森林山蛭抗血栓肽基因的克隆包括：[0011]森林山蛭唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选森林山蛭抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’△八八：：1^66厶厶^66丁厶丁6了3’，？〇1?另一扩增引物为3’？〇1??41116『引物，其序列为5’CCGAGGTTTGGTGGCTCATT3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山輕抗血栓肽的由316个核苷酸组成，自5’端至3’端序列（核苷酸序列SEQIDNO:2为：[0013]其中55-183的片段编码森林山蛭抗血栓肽成熟肽。森林山蛭抗血栓肽基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。[0014]森林山蛭抗血栓肽的分离纯化方法：[00Ί5]收集的森林山輕勾衆液首先过凝胶层析柱SephadexG-50,收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相RP-HPLCC4、C18柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。[0016]森林山蛭抗血栓肽的化学合成方法：[0017]根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪433A,AppliedBiosystems合成其全序列。通过HPLC反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95%。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MLDI-TOF测定其分子量。合成的抗血栓肽溶于灭菌水，用于活性测定。[0018]一种药物组合物，该药物包括：[0019]a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；[0020]b.药学上能接受的载体或赋形剂。[0021]本发明的有益效果在于：[0022]分离纯化得到森林山輕抗血栓肽57]^681:;[11，并克隆得到其〇0嫩序列。该抗血栓肽能够抑制FXIIa、ka11ikreiη，有极显著的抗血栓和抑制急性脑缺血作用。另外该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为抑制FXIIa、kalIikrein的试剂和制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。附图说明[0023]图1显示森林山輕抗血栓肽SyIvestin的抗血栓作用。[0024]图2显示森林山輕抗血栓肽Sylvestin的抗急性脑缺血作用。具体实施方式[0025]下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。[0026]森林山蛭抗血栓肽基因克隆：[0027]1.森林山蛭总RNA提取：[0028]1迅速从液氮中取出多条山蛭，用剪刀剪下山蛭前端包括山蛭口腔和咽部），总重量IOOmg左右，放入研钵中，加入液氮后充分研磨。待研成粉末状后，加入ImlTrizol提取缓冲液（Invitrogen，与液氮共研磨。待Trizol溶化，将研钵中全部液体吸出至1.5ml离心管中，室温放置5min。[0029]2加入200yL氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5min;4°C，12000g离心IOmin;吸取上层无色水相至新的1.5ml离心管中（尽量多吸上层液体，但一定要避免吸到中下层，中层白色为蛋白沉淀，粉红色下层为酚-氯仿）。[0030]3加入等体积4°C预冷异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min，4°C，12000g离心IOmin，管底微量沉淀为RNA，用移液枪轻微吸去上清。[0031]⑷沉淀加入Iml75%冰上预冷乙醇洗涤，4°C，7500g离心5min，弃上清，重复两次;超净台中放置5-1Omin，晾干无乙醇味），即为森林山蛭头部总RNA;往晾干的EP管中加入30yL0.1%DEPC水，轻微震荡溶解RNA。从中吸取2yL加98yLDEPC水，于230nm、260nm、280nm波长处检其吸光值。取IOyL用于I%琼脂糖胶电泳。其余总RNA于-80°C冻存。[0032]2.森林山蛭cDNA双链的合成：[0033]按照Creator™SMART™cDNALibraryConstructionKitClontech说明书操作构建森林山蛭头部cDNA文库。具体操作如下：[0034]IcDNA第一链合成mRNA反转录）[0035]在无RNasePCR管中加入2yL森林山蛭头部总RNA、lyLSMARTtmIVoligonucleotide、lyLCDSHI3’Primer，加IyLDEPC水使总体积达到5yL，混勾并离心10s;72°C保温2min，冰上孵育2min;在上述PCR管中加入2yL5X第一链buffer、lyL20mMDTT、1yLIOmMdNTP混合物、IyLPowerScript逆转录酶，混匀并离心IOs13PCR仪中42°C保温lh，冰上终止反应。⑵采用长末端聚合酶链式反应LD-PCR方法扩增cDNA第二链[0036]将IyLcDNA第一链mRNA反转录），40yL去离子水，5yL10Xbuffer缓冲，IyL50XdNTP混合物，IyL5’PCRprimer，lyLCDSm3’PCR引物以及IyL聚合酶于PCR管中混匀。按以下程序进行PCR扩增：[0037]①95cCImin[0038]②20个循环：[0039]95〇C15sec[0040]65〇C30sec[0041]68°C6min[0042]扩增结束后，合成好的cDNA双链用PCR管分装成IOyL每管，取出5yL进行1%琼脂糖电泳，其余立刻置于-80°C保存。[0043]3.大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备：[0044]1挑取单个DH5a菌落，接种于ImL不含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于ImLLB培养液中，37°C振荡2h。[0045]2当OD6QQ达到0.35时，将菌液在冰上放置IOmin使培养物冷却至0°C。[0046]34°C，5000rpm离心5min，以回收细胞。[0047]⑷倒出培养液，将管倒置Imin以使最后的痕量培养液流尽。[0048]5每ImL初始培养液加入600yL预冷的0·IMCaCl2-MgCl2溶液（80mMMgCl2，20mMCaCl2重悬每份细胞沉淀。[0049]64°C，5000rpm离心5min，以回收细胞。[0050]⑵倒出培养液，将管倒置Imin以使最后的痕量液体流尽。[0051]8每ImL初始培养物加入60yL用冰预冷的0.IMCaCl2重悬细胞沉淀。4°C冰箱放置10-18h。[0052]4.cDNA文库的筛选：[0053]1特异性引物的合成[0054]使用primerblast设计两条引物。[0055]2从山蛭cDNA中克隆目标序列[0056]20yL体系：Tag酶0·IyL，CDSIII、SMART4各0·4yL，dNTPO·4yL，buffer2yL，Mg2+1·2μL，PO^Kl6yL[0058]3序列的连接、转化与检测。在微量离心管中加入0.2yLTakaraPMD19-T载体，2.3yLDNA双链;加入2.5yL等量的连接酶缓冲液混合物冰上溶解）；16°C反应过夜;全部5μL连接产物加至60yLDH5a感受态细胞中，冰上放置30min;42°C热激90s，轻放于冰上3-5min，修复细胞膜；尽快加入温浴过的LB培养基，37°C，80rpm摇菌45min;取IOOyL涂布与含有100ugml的AMPLB培养基中，37°C培养16h;菌落长出后，挑单克隆进行IOyL菌液PCR。[0059]5.挑取单克隆测序及序列筛选：[0060]挑取20个与目标序列核酸大小相近的单菌落送测序公司进行DNA测序。采用ABI3730测序仪测序。测序引物为M13+:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，M13_:5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。测序结果进行序列筛选。[0061]6.森林山輕抗血栓肽SyIvestin基因序列测定：[0062]提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST™SequencingPrimerRV-M和BcaBEST™SequencingPrimerM13_47，BcaBEST™SequencingPrimerRV-M序列：5'GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’，BcaBEST™SequencingPrimerM13_47:5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。基因测序结果自5’端至3’端序列（核苷酸序列SEQIDNO:2为：[0063]GGGAACCCGAAACGGGCATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAAACCTCGGAACCGGTATGTGCATGCCCAAAAATGCTATTTTGGGTTTGTGGTAAAGATGGTGAGACTTACACCCATCCTTGCATTGCAAAATGCCATAATGTTGAAGTTGAACATGATGGGAAGTGCAAATGAAAGGGACCATTCTTCGAAATTGCCTGAAACTTAAAAATATTGATTTGAATTTAATTAATTCTTATTAATTATAACGTTTCATCATAATAAATGAATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA[0064]森林山蛭抗血栓肽Sylvestin基因核苷酸的序列表为:序列长度为316个碱基，序列类型:核酸，链数:单链，拓扑学:直链状，序列种类:cDNA，来源:森林山蛭唾液腺。[0065]编码森林山蛭成熟抗血栓肽Sylvestin的为核苷酸序列SEQIDNO:2的第55-183位核苷酸。森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列（SEQIDNO:l为：TSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。[0066]森林山輕抗血栓肽SyIvestin基因作为基因工程制备森林山輕抗血栓肽的应用。[0067]森林山輕抗血栓肽SyIvestin分离纯化：[0068]1.山蛭的处理[0069]用液氮直接速冻活的森林山蛭。在低温下，用棉布包裹山蛭并用铁锤把山蛭敲成数段。把敲过的山蛭和适量的50MmTrispH8.0缓冲溶液混合匀浆，4°C，12000g离心30min，上清即为森林山蛭体腔液粗样。把全部上清混合在一起，分装成3ml每管，于-80°C保存。[0070]2.山輕SephadexG-50凝胶分离与反相高压色谱分离[0071]第一步36口1^1616-50凝胶层析。取21111山輕勾楽_液上样于1'1^8-]^10.021]1〇1八，pH7.8缓冲液平衡过的SephadexG-50AmershamBioscience凝胶柱（26mmX100cm。用同样浓度的平衡缓冲液洗脱，流速为〇.3mlmin，3ml管，使用CBS-A程控全自动部分收集器收集（上海青浦沪西仪器厂）。使用MLtrospec2IOOpro分光光度计（AmershamBiosciences测定280nm和215nm值。收集各峰组分存于-20°C备用。[0072]第二步C4反向高压色谱法。活性蛋白使用反相高压色谱（Waters1525BinaryHPLCPumpC4柱Lichrospher10X250mm继续分离;溶剂A:0.1%TFA的超纯水溶液，溶剂8:0.1%了?六的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度:0-101^11，8:0%;10-111^11，8:0-5%;11-40min，B:5-33%;40-50min，B:33-38%;50-60min，B:38-70%，60-70，B:70-100%。流速为1.5!111111；[11，上样量为311^粗样蛋白。峰收集使用¥3丨6^2489可见紫外检测器检测215nm，每一个峰为一个收集单位。[0073]第三步C8柱反向高压色谱法。C8柱XBridge™4.6X250mm。溶剂A:0.1%TFA的超纯水溶液，溶剂B:0.1%TFA的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-1011^11，8:0%;10-14min，B:0-20%;14-24min，B:20%;24-55min，B:20-35%;55-60min，B:35-100%。流速为0.7!111111；[11，上样量为111^粗样蛋白。峰收集使用¥3丨6^2489可见紫外检测器检测215nm，每一个峰为一个收集单位。以上步骤跟踪检测和收集FXIIa和kallikrein抑制活性部分。Edman讲解法对其纯化所得的抗血栓肽纯品进行N-端测序model491，ABI，美国）。电喷雾电离质谱ESI-MS测定抗血栓肽分子量。[0074]森林山輕抗血栓肽SyIvestin的化学合成：[0075]1.森林山輕抗血栓肽SyIVestiη的化学合成方法：根据编码森林山輕抗血栓肽Sylvestin的蛋白测序结果和基因推断森林山輕抗血栓肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。[0076]2.分子量测定采用快原子轰击质谱法（Fastatombombardmentmassspectrometry,FAB-MS，以甘油：间硝基节醇：二甲亚砜（I:I:I，V:V:V，体积比）为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为ΙμΑ，发射电压为25Kv。[0077]3.纯化的森林山蛭抗血栓肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。[0078]森林山輕抗血栓肽SyIvestin是森林山輕抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山輕抗血栓肽Sylvestin的氨基酸序列（SEQIDNO:1为：TSEPVCACPKMLFWVCGKDGETYTHPCIAKCHNVEVEHDGKCK。[0079]森林山輕抗血栓肽Sylvestin的药理实验：[0080]1.酶动力学:在96孔板中IOyL样品与IOyL终浓度为0.2μΜ的FXIIa混合于40yL缓冲液（100mMNacl、50mMTris-HClpH8.0、5mMCaCl2中。室温放置5分钟后，加入30yL缓冲液与IOyL终浓度为0.04mM发色底物的混合液，终体积为IOOyL。凝血反应的动力学使用EpochBioTek酶标仪、GENCHS1.09软件检测0D4〇5,20min，间隔47s。样品浓度为10μΜ。Sylvestin对凝血酶、FXa等无抑制作用。可以抑制FXIIa和kailikrein。经计算Sylvestin对FXIIa和kalIikrein的抑制常数分别为2.9μΜ、17.8nM。[0081]2.APTT和PT实验：将APTT试剂平衡至室温，轻轻倒置混匀APTT试剂。50yLAPTT试剂、50yL正常血浆和5yL样品混匀后，在37°C的水浴锅中孵育3分钟，加入50yL预热的CaCl2溶液，立即混匀，用酶标仪记检测OD65qJT实验:37°C预热凝血酶原试剂15分钟。50yL正常血浆与5yL样品在37°C水浴锅中孵育3分钟，加入预热的凝血酶原试剂IOOyU立即混匀，用酶标仪记录0D65Q。Sylvestin对PT实验无作用，对APTT实验具有浓度依赖效果，表明Sylvestin抑制内源性凝血途径，与是FXIIa抑制剂的结果一致。[0082]3.卡拉胶致鼠尾血栓模型:实验动物用昆明小鼠，体重25_30g昆明医学院实验动物中心提供），饲养一周后，随机分组n=6，雌雄各半。第1组为生理盐水对照组，样品组为2mgkg、4mgkg，阳性对照为500U只肝素钠北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。尾静脉给药处理30min后，以60mgkg的剂量从小鼠腹腔注射卡拉胶（carrageenan，typeI，Sigma，用生理盐水溶解成I%的浓度），由于在低温环境下，血栓形成率90%，所以饲养温度为17.5°：。12、24、36、4811后根据尾部皮肤颜色变化测定血栓形成的平均长度。随着时间的增加，各组血栓的平均长度都增加了。12h由于血栓形成的不明显，测量时有较大的误差，但对照组明显比其他组症状明显;肝素钠从12h到24h长度增加了一倍;对照组基本不变，可能因为限于鼠尾的长度;样品组长度略微增加。在每个测量时间点，相对于对照组，4mgkg和肝素对鼠尾血栓形成的影响都有意义。数据处理为GraphpadPrime5，数据平均值土SD，1:_七681:吨〈0.05。在1211到3611，371¥681:;[11组对血栓的抑制率都降低了，然而在4811抑制率有升高了，不过整体上随着时间的延长，抑制率降低了。相对于肝素组和2mgkg组，4mgkg组抑制率变化不大。Sylvestin对血栓的抑制率随着浓度的增加变大图1。[0083]4.急性脑缺血线栓模型:使用2%戊巴比妥钠80mgkg麻醉昆明小鼠（30〜35g，中深度麻醉后，颈正中切口逐层切开大鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉CCA，颈内动脉ICA和颈外动脉ECA，使用电凝器凝结ECA上甲状腺动脉和咽动脉并剪断。结扎ECA的远心端，并在其近心端挂线，暂时夹闭CCA和ICA，剪断ECA，将线栓从ECA残端插入ICA，结扎ECA残端，移除ICA的动脉夹，由ICA向内上方缓慢推进。适当调整方向，插入到线栓标记处从CCA分叉处计算IOmm，开始计时，Ih后移去线栓，观察无活动性出血后缝合切口。整个过程用电热毯保温，温度为36〜37°C。将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。脑缺血24h，按BedersonScore评分法评估并记录神经功能缺损评分：0分为无功能障碍;1分为不能伸展右前肢;2分为向右侧旋转;3分为向右倾倒;4分为无自主活动伴意识障碍;5分为死亡。24h后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具中（冰上），沿视交叉向后切成2mm厚的切片，将其放入2%TTC的磷酸盐缓冲液，于37°C温箱中染色30min，再用4%多聚甲醛过夜固定并拍照。缺血体积百分数=[缺血体积-左半脑体积-右半脑体积]右半脑体积XI〇〇。缺血再灌注前IOmin，尾静脉给药1次，实验组分别为1、3、5mgkg，对照组为生理盐水，体积1〇〇μ1。缺血再灌注后IOmin内，尾静脉给药1次，剂量同上;6h再给药一次。每组6只。Sylvestin可以有效减轻脑缺血再灌注造成的损伤图2。[0084]综上所述，森林山輕抗血栓肽Sylvestin，能用于制备FXIIa和kallikrein抑制剂和抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。[0085]一种药物组合物，该药物包括：[0086]a.权利要求1所述的抗血栓肽SyIvestin或药学上能接受的盐；[0087]b.药学上能接受的载体或赋形剂。[0088]其中，本发明多肽可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式。这些盐包括但不限于与如下酸形成的盐:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲璜酸、乙璜酸、苯璜酸或羟乙磺酸。其他盐包括:与碱金属或碱土金属如钠、钾、钙或镁形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。[0089]药物组合物还包括药学上能接受的载体。术语“药学上能接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。所述的载体包括但不限于）：盐水、缓冲剂、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。这些载体还可能存在辅助性的物质，如润湿剂、乳化剂、PH缓冲剂等。[0090]所述的赋形剂指:在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂;半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分;液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

权利要求：1.森林山輕抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。2.编码森林山蛭抗血栓肽Sylvestin的基因，其特征在于，由SEQIDN0:2所示的核苷酸序列组成。3.根据权利要求1所述的森林山輕抗血栓肽SyIVestiη，其特征在于，所述抗血栓肽SyIvestin在制备FXIIa和kallikrein抑制剂中的应用。4.根据权利要求1所述的森林山輕抗血栓肽SyIVestiη，其特征在于，所述抗血栓肽SyIvestin在制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。5.—种药物组合物，其特征在于，该药物包括：a.权利要求1所述的抗血栓肽Sylvestin或药学上能接受的盐；b.药学上能接受的载体或赋形剂。6.根据权利要求1所述的森林山輕抗血栓肽SyIVestiη，其特征在于，所述抗血栓肽SyIvestin的制备方法包括:从森林山輕中分离纯化、化学合成或基因工程。7.根据权利要求6所述的森林山輕抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的分离纯化的制备方法为:将收集的森林山輕勾楽液首先过凝胶层析柱SephadexG-50，收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相RP-HPLCC4、C18柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。8.根据权利要求6所述的森林山輕抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的化学合成的制备方法为:根据Edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。9.根据权利要求6所述的森林山輕抗血栓肽Sylvestin，其特征在于，所述的基因工程的制备方法为:利用权利要求2所述的编码森林山輕抗血栓肽SyIvestin的基因制备森林山蛭抗血栓肽。

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