申请/专利权人：四川大学

申请日：2019-01-16

公开（公告）日：2022-04-19

公开（公告）号：CN109628381B

主分类号：C12N5/073

分类号：C12N5/073;C12N5/071

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.04.19#授权;2019.05.10#实质审查的生效;2019.04.16#公开

摘要：本发明公开了一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，涉及生物医学领域。该方法包括：游离子宫：将怀孕小鼠处死后，完整游离出包含胚胎的子宫；游离胚胎：打开子宫壁，完整游离出胚胎；获取胚胎下颌组织：在解剖显微镜下，从胚胎中获取下颌组织；获取胚胎颌下腺：将下颌组织置于解剖显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。该方法改进了小鼠胚胎颌下腺的获取操作，与传统方法相比，减少了操作步骤，降低了操作难度，并且更大程度上保证了取出的颌下腺组织的完整性，从而提供了一种更好的颌下腺体外培养的模型，为颌下腺相关疾病的研究提供一个可靠的平台。

主权项：1.一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，其包括如下步骤：1游离子宫：将怀孕小鼠处死后，完整游离出包含胚胎的子宫；2游离胚胎：打开子宫壁，完整游离出胚胎；3获取胚胎下颌组织：在解剖显微镜下，从胚胎中获取下颌组织；4获取胚胎颌下腺：将胚胎下颌组织头部断面朝下，颈部断面朝上，舌尖指向12点钟方向的方式放置在解剖显微镜下，视野清楚放大后，固定脊髓颈段部分以固定下颌组织，分离表层组织后，将两侧下颌软骨分别向左右适当牵拉，分离颌下腺外侧多余组织，然后沿12点钟将直镊沿前上向后下方向插入颌下腺后部，夹断其与舌体及导管连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。

全文数据：一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法技术领域本发明涉及生物医学领域，具体而言涉及一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法。背景技术颌下腺即下颌部的唾液腺，左右各一个，属于唾液腺的一个组成部分，主要的功能就是分泌唾液。颌下腺位于下巴骨下颌骨的下方，接近下巴骨弯曲角附近，所以也叫下颌下腺下颌骨下方的唾液腺。颌下腺作为唾液腺重要的组成部分，通过提供唾液来发挥维持口腔内酸碱度、杀灭有害细菌等作用，来维持口腔健康。目前，因唾液腺功能丧失或手术切除唾液腺的患者生活质量会明显降低。因此研究小鼠胚胎过程中颌下腺的分支形态发生及相关影响因素，对更好地构建体外颌下腺模型供临床实验研究、设计构造人工颌下腺等均有重要意义。小鼠胚胎颌下腺则是相关研究中重要的体外培养模型。但如何获取小鼠胚胎颌下腺一直是一个难点。目前多采用双侧旋转分离下颌软骨的方法，但该方法在显微镜镜下操作时步骤较多且复杂，同时颌下腺腺体并不能完全附着于舌体，需要较高的技巧及足够的熟练度后才有一定的成功率，且取出的颌下腺组织多不完整。发明内容本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作，取出的颌下腺组织的完整性高，从而提供了一种更好的颌下腺体外培养的模型。本发明采用的技术方案如下：一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其包括如下步骤：（1）游离子宫：将怀孕小鼠处死后，完整游离出包含胚胎的子宫；（2）游离胚胎：打开子宫壁，完整游离出胚胎；（3）获取胚胎下颌组织：在解剖显微镜下，从胚胎中获取下颌组织；（4）获取胚胎颌下腺：将下颌组织置于解剖显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，步骤（1）中，小鼠的孕龄为12-14天。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，所述小鼠选自所述小鼠品种选自BALBc小鼠、C57BL小鼠、C3H小鼠、C3HHe小鼠、KM小鼠、ICR小鼠、NIH小鼠、CFW小鼠、LACA小鼠中的任意一种。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，步骤（2）中，打开子宫后，将胚胎夹持取出胚胎；夹持过程中，夹持部位远离颌下腺。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，步骤（3）中，在显微镜光源上放置一层白色覆盖物。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，在显微镜下，视野清楚后，固定胚胎，自颈部与颏部之间切下胚胎头部；然后，于口裂处舌头上方自前向后由平行于下颌长轴的方向切下下颌组织。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，所述下颌组织包括麦克尔软骨、舌、颌下腺、舌下腺、脊髓颈段及软组织。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，步骤（4）中，将胚胎下颌组织头部断面朝下，颈部断面朝上，舌尖指向12点钟方向的方式放置在解剖显微镜下；固定脊髓颈段部分以固定下颌组织。本发明的一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，分离表层组织后，将两侧下颌软骨分别向左右适当牵拉，分离颌下腺外侧多余组织；然后沿12点钟将直镊沿前上向后下方向插入颌下腺后部，夹断其与舌体及导管连接。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法改进了小鼠胚胎颌下腺的获取操作，与传统方法相比，减少了操作步骤，降低了操作难度，并且更大程度上保证了取出的颌下腺组织的完整性，从而提供了一种更好的颌下腺体外培养的模型，为颌下腺相关疾病的研究提供一个可靠的平台。附图说明本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1是实施例5中获取的颌下腺的图片。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例1本实施例提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作取出的颌下腺组织的完整性高。具体步骤如下：步骤一：将怀孕小鼠处死后，完整游离出包含胚胎的子宫。步骤二：打开子宫壁，完整游离出胚胎。步骤三：在显微镜下，从胚胎中获取下颌组织。步骤四：将下颌组织置于显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。实施例2本实施例提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作取出的颌下腺组织的完整性高。具体步骤如下：步骤一：取孕龄12天的C57BL小鼠，以颈椎脱位法处死，用75%酒精浸泡消毒小鼠胸腹部，在小鼠腹部中线由耻骨联合直线剪开皮肤、肌肉及腹膜暴露腹腔至剑突下方，牵开腹部皮肤及肌肉显露子宫，以小弯钳抬起子宫，剪刀剪开并分离子宫系膜游离子宫，在此过程中防止挤压子宫及胚胎，将游离出的包含胚胎的子宫置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。此处所述储存用培养基成分为：DMEMF12液体培养基，加入青霉素溶液和链霉素溶液，最终浓度分别为100Uml和100μgml，存储于4℃冰箱中（下同）。步骤二：打开子宫壁，完整游离出胚胎。步骤三：在显微镜下，从胚胎中获取下颌组织。步骤四：将下颌组织置于显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。实施例3本实施例提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作取出的颌下腺组织的完整性高。具体步骤如下：步骤一：取孕龄13天的C3H小鼠，以颈椎脱位法处死，用75%酒精浸泡消毒小鼠胸腹部，在小鼠腹部中线由耻骨联合直线剪开皮肤、肌肉及腹膜暴露腹腔至剑突下方，牵开腹部皮肤及肌肉显露子宫，以小弯钳抬起子宫，剪刀剪开并分离子宫系膜游离子宫，在此过程中防止挤压子宫及胚胎，将游离出的包含胚胎的子宫置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤二：以显微直解剖镊打开子宫壁，并小心将胚胎夹持，从子宫中分离，此过程中为了防止挤压损伤颌下腺，夹持过程中，夹持部应远离下颌下腺；将游离出的胚胎置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤三：在显微镜下，从胚胎中获取下颌组织。步骤四：将下颌组织置于显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。实施例4本实施例提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作取出的颌下腺组织的完整性高。具体步骤如下：步骤一：取孕龄14天的CFW小鼠，以颈椎脱位法处死，用75%酒精浸泡消毒小鼠胸腹部，在小鼠腹部中线由耻骨联合直线剪开皮肤、肌肉及腹膜暴露腹腔至剑突下方，牵开腹部皮肤及肌肉显露子宫，以小弯钳抬起子宫，剪刀剪开并分离子宫系膜游离子宫，在此过程中防止挤压子宫及胚胎，将游离出的包含胚胎的子宫置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤二：以显微直解剖镊打开子宫壁，并小心将胚胎夹持，从子宫中分离，此过程中为了防止挤压损伤颌下腺，夹持过程中，夹持部应远离下颌下腺；将游离出的胚胎置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤三：在解剖显微镜光源处覆盖一层纸巾可增加其漫反射光，使组织阴影更加立体便于观察。将胚胎置于解剖显微镜下，调节至适当放大倍数，并调节至视野清楚；侧向放置胚胎，以直镊固定胚胎体部，自颈部与颏部之间切下胚胎头部，此时可见下颌部分两处明显出血点，即为双侧颈动脉，颌下腺即位于其内侧。再于口裂处舌头上方，自前向后由平行于下颌长轴的方向切下下颌组织，主要包含麦克尔软骨、舌、下颌下腺、舌下腺、脊髓颈段及少量其他软组织；将切下的下颌组织置于盛有3mL储存用培养基的35mm培养皿中；4℃暂存暂存。步骤四：将下颌组织置于显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。实施例5本实施例提供一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，该方法步骤简便，容易操作取出的颌下腺组织的完整性高。具体步骤如下：步骤一：将所有手术及培养器械消毒灭菌，手术人员穿着防护服，进入无菌操作环境。步骤二：取孕龄13天的ICR小鼠，以颈椎脱位法处死，用75%酒精浸泡消毒小鼠胸腹部，在小鼠腹部中线由耻骨联合直线剪开皮肤、肌肉及腹膜暴露腹腔至剑突下方，牵开腹部皮肤及肌肉显露子宫，以小弯钳抬起子宫，剪刀剪开并分离子宫系膜游离子宫，在此过程中防止挤压子宫及胚胎，将游离出的包含胚胎的子宫置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤三：以显微直解剖镊打开子宫壁，并小心将胚胎夹持，从子宫中分离，此过程中为了防止挤压损伤颌下腺，夹持过程中，夹持部应远离下颌下腺；将游离出的胚胎置于盛有25mL储存用培养基的100mm培养皿中，4℃暂存。步骤四：在解剖显微镜光源处覆盖一层纸巾可增加其漫反射光，使组织阴影更加立体便于观察。将胚胎置于解剖显微镜下，调节至适当放大倍数，并调节至视野清楚；侧向放置胚胎，以直镊固定胚胎体部，自颈部与颏部之间切下胚胎头部，此时可见下颌部分两处明显出血点，即为双侧颈动脉，颌下腺即位于其内侧。再于口裂处舌头上方，自前向后由平行于下颌长轴的方向切下下颌组织，主要包含麦克尔软骨、舌、下颌下腺、舌下腺、脊髓颈段及少量其他软组织；将切下的下颌组织置于盛有3mL储存用培养基的35mm培养皿中；4℃暂存暂存。步骤五：将胚胎下颌组织以头部断面朝下，颈部断面朝上，舌尖指向12点钟方向的方式放置在解剖显微镜下，调节至适当放大倍数，并调节至视野清楚；用用直镊固定脊髓颈段部分以固定整个组织，用另一个直镊，沿中线分离颈部断面下颌部分最表层组织，分离后即可一定程度见颌下腺腺体，位于舌体两侧。用直镊将两侧下颌软骨分别向左右适当牵拉，分离颌下腺外侧多余组织；沿12点钟将直镊沿前上向后下方向插入颌下腺后部，夹断其与舌体及导管连接，即可较为完整的分离胚胎小鼠的颌下腺组织。用本实施例提供的方法获取的小鼠颌下腺组织如图1所示。需要说明的是，通过本发明提供的方法获得的颌下腺组织包含下颌下腺及舌下腺，二者通常难以分开。但是，在玻璃培养皿中培养时，在倒置显微镜下可以看到舌下腺稍小，上皮芽较少，受孕第13天的胚胎中常只有一个上皮芽出现，与颌下腺紧密相邻，此时的颌下腺一般已有3-5个上皮芽。本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

权利要求：1.一种小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）游离子宫：将怀孕小鼠处死后，完整游离出包含胚胎的子宫；（2）游离胚胎：打开子宫壁，完整游离出胚胎；（3）获取胚胎下颌组织：在解剖显微镜下，从胚胎中获取下颌组织；（4）获取胚胎颌下腺：将下颌组织置于解剖显微镜下，视野清楚放大后固定，分离最表层组织后，夹断颌下腺与舌体及导管的连接，即可获取完整的胚胎颌下腺。2.根据权利要求1所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，步骤（1）中，小鼠的孕龄为12-14天。3.根据权利要求2所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，所述小鼠选自所述小鼠品种选自BALBc小鼠、C57BL小鼠、C3H小鼠、C3HHe小鼠、KM小鼠、ICR小鼠、NIH小鼠、CFW小鼠、LACA小鼠中的任意一种。4.根据权利要求1所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，步骤（2）中，打开子宫后，将胚胎夹持取出胚胎；夹持过程中，夹持部位远离颌下腺。5.根据权利要求1所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，步骤（3）中，在显微镜光源上放置一层白色覆盖物。6.根据权利要求5所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，在显微镜下，视野清楚后，固定胚胎，自颈部与颏部之间切下胚胎头部；然后，于口裂处舌头上方自前向后由平行于下颌长轴的方向切下下颌组织。7.根据权利要求6所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，所述下颌组织包括麦克尔软骨、舌、颌下腺、舌下腺、脊髓颈段及软组织。8.根据权利要求1所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，步骤（4）中，将胚胎下颌组织头部断面朝下，颈部断面朝上，舌尖指向12点钟方向的方式放置在解剖显微镜下；固定脊髓颈段部分以固定下颌组织。9.根据权利要求8所述的小鼠胚胎颌下腺的获取方法，其特征在于，分离表层组织后，将两侧下颌软骨分别向左右适当牵拉，分离颌下腺外侧多余组织；然后沿12点钟将直镊沿前上向后下方向插入颌下腺后部，夹断其与舌体及导管连接。

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