申请/专利权人：阿巴洛斯治疗有限公司

申请日：2016-04-15

公开（公告）日：2022-12-23

公开（公告）号：CN108025054B

主分类号：A61K35/76

分类号：A61K35/76;A61K35/768;A61K39/12;A61K39/00;A61P35/00

优先权：["20150417 DE 102015207036.0"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.12.23#授权;2018.06.05#实质审查的生效;2018.05.11#公开

摘要：本发明涉及用于治疗和或预防肿瘤的沙粒病毒以及用于制备具有（改善的）肿瘤消退性能的沙粒病毒的方法。

主权项：1.能够活化先天性免疫细胞并从而实现肿瘤消退的沙粒病毒在制备用于治疗和或预防癌症的药物中的用途，其中所述沙粒病毒能够通过活化所述免疫细胞引起干扰素-α分泌增加，其中所述沙粒病毒是胡宁病毒株Candid#1或其中所述沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV，其中LCMV的L-和S-核糖核酸序列选自由WE、Armstrong、Clone13和DocileL-和S-核糖核酸序列组成的组。

全文数据：用于治疗和或预防肿瘤的沙粒病毒和用于制备具有改善的肿瘤消退性能的沙粒病毒的方法[0001]应用领域和背景技术本发明涉及用于治疗和或预防肿瘤的沙粒病毒以及用于制备具有改善的）肿瘤消退性能的沙粒病毒的方法。[0002]沙粒病毒属于人病原性多形RNA病毒家族。由于它们在动物主要是啮齿类动物）中的自然储宿Reservoir，具有这些病毒的疾病属于人畜共患病。人畜共患病表示可以从动物传递给人类、反之亦然从人类传递给动物的疾病。[0003]已知至少八种沙粒病毒，其在人类中造成疾病。典型的是无菌性脑膜炎和出血热。已知的可以在人类中引起疾病的病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV、瓜纳瑞托病毒GTOV、胡宁病毒JUNV、拉沙病毒LASV、Lujo病毒LUJV马丘波病毒MACV、沙比亚Sabia病毒SABV和白水河病毒WffAV。[0004]沙粒病毒通常分成两组，即旧大陆沙粒病毒和新大陆沙粒病毒。这些组在地理上和在遗传上不同。已经在东半球的国家，诸如欧洲、亚洲和非洲国家发现了旧大陆沙粒病毒，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。相反，已经在西半球的国家，诸如阿根廷、玻利维亚、委内瑞拉、巴西和美国发现了新大陆沙粒病毒。[0005]该病毒家族的名称源自拉丁文arenosus沙样或arena沙），以描述病毒粒子内的沙样核糖体结构。沙粒病毒的病毒粒子具有圆形至不规则形状，且根据物种和试验材料制品而具有50nm至300nm、经常110nm至130nm的直径。8nm至10nm长的棒形糖蛋白刺突嵌入在病毒包膜中。各个刺突由病毒包膜蛋白的四聚体组成。[0006]病毒粒子还包含两个具有螺旋对称的闭环衣壳。衣壳的长度在450nm至1300nm之间变化。一个病毒RNA核糖核酸聚合酶L-蛋白）分子附着于它们中的每一个。[0007]每个衣壳包含一个具有混合（即双义，±极性的单链RNA分子。两个单链RNA分子代表病毒基因组。它们被称作L大和S小），且是约7.5kb千碱基和3.5kb千碱基大。尽管所述衣壳是闭环形状，这些RNA链是直链的且因而不是圆形的。在RNA的3’末端处的19-30碱基长序列存在于两条链上且在该病毒家族中也是保守的。[0008]在形态学上非常罕见的是在病毒粒子内存在交替数目的细胞核糖体，这给病毒颗粒提供它们的“沙样”外观。同样地，在经纯化的病毒制品中，发现了许多不同的细胞RNA他包括核糖体RNA以及病毒RNA的复制形式、不同的病毒mRNA与核糖体结合的信使核糖核酸和病毒基因组的完全互补链。这些非基因组RNA以变化的量都位于上述衣壳外面。[0009]沙粒病毒作为疫苗载体的应用是已知的。一个显著的例子是针对阿根廷出血热使用的疫苗病毒Candid#1。这是胡宁病毒的疫苗变体。[0010]从WO2009083210Al已知复制缺陷型（S卩遗传修饰的）沙粒病毒颗粒病毒粒子）尤其用于治疗肿瘤疾病，例如黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肺癌的用途。在出版物“Developmentofreplication-defectivelymphocyticchoriomeningitisvirusvectorsfortheinductionofpotentCD8+Tcellimmunity’，（NatureMedicine，第16卷，第3期，2010年3月，第339-345页；doi:10.1038Nm.2104中，提及癌症免疫疗法作为这样的病毒颗粒的潜在应用领域。[0011]此外，WO2006008074Al公开了包装细胞其产生用沙粒病毒糖蛋白假型化的逆转录病毒病毒粒子用于实体瘤的基因治疗的用途。[0012]在现有技术中描述的用于治疗肿瘤的方法是基于通过遗传工程非常复杂地产生的病毒颗粒的应用。此外在基因疗法的治疗方法的情况下，通常不可能实现经遗传工程制备的病毒粒子或产生病毒粒子的包装细胞对肿瘤组织的充分且在治疗上有效的转导。[0013]目的和解决方案因此，本发明是基于如下目的:提供与现有技术相比更简单、且特别是更有效的用于肿瘤、特别是癌和肉瘤的治疗方案。[0014]该目的根据本发明通过根据独立权利要求1的沙粒病毒、根据权利要求14的药物以及根据独立权利要求15的体外方法实现。在从属权利要求中定义了优选的实施方案。所有权利要求的表述特此通过引用并入说明书的内容中。在说明书中公开了本发明的另一个主题，其实现本发明的目的。[0015]根据第一方面，本发明涉及用于治疗和或预防人类或动物中的肿瘤、优选恶性肿瘤的沙粒病毒。[0016]所述沙粒病毒的特征优选地在于，它不含有基因组外来RNA，即它不包含基因组外来RNA。换而言之，该沙粒病毒的基因组遗传物质优选地不含外来RNA或优选地不包含外来RNA〇[0017]在本发明的上下文中，表述“基因组外来RNA”应被理解为是指这样的RNA核糖核酸或RNA序列:其不发生在或不存在于野生型沙粒病毒的基因组中或野生型沙粒病毒的突变体突变的沙粒病毒）的基因组中，尤其是野生型沙粒病毒的天然突变体天然地突变的沙粒病毒）的基因组中。外来RNA的例子是人工的或合成的RNA分子、生物体的RNA和其它病毒的RNA。[0018]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），表述“野生型沙粒病毒”应被理解为是指这样的沙粒病毒:其基因组是在自然界中存在的遗传上正常的形式。[0019]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），表述“野生型沙粒病毒的突变体”或“突变的沙粒病毒”应被理解为是指这样的沙粒病毒:其基因组与野生型基因组相比包含自发的，即天然地造成的或由诱变剂诱导的修饰。[0020]因此，在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），表述“野生型沙粒病毒的天然突变体”或“天然地突变的沙粒病毒”应被理解为是指这样的沙粒病毒:其基因组与野生型基因组相比包含自发的，即天然地造成的修饰。天然地突变的沙粒病毒可以优选地通过传代、特别是连续传代制备，这将在下面更详细地讨论。[0021]本发明是基于以下惊人发现:没有基因组外来RNA的沙粒病毒能够实现肿瘤消退。肿瘤消退是由于由沙粒病毒造成的先天性和适应性免疫细胞的活化或刺激。活化的免疫细胞分泌增加的抗肿瘤细胞因子，诸如干扰素-α和干扰素-γ，由此对抗或摆脱肿瘤。另一个惊人发现是，在肿瘤表现的情况下，沙粒病毒造成抗肿瘤细胞因子的分泌显著增加。没有基因组外来RNA的沙粒病毒因而适合用在肿瘤治疗中。这已经由申请人借助于动物实验成功地验证。为此目的，使用了尤其是小鼠，人肿瘤在其中的生长是可能的。[0022]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒也不含有非基因组外来RNA。在本发明的上下文中，表述“非基因组外来RNA”应被理解为是指这样的在沙粒病毒基因组外的RNA或RNA序列:其不发生在或不存在于野生型沙粒病毒或野生型沙粒病毒的突变体突变的沙粒病毒）中，尤其是野生型沙粒病毒的天然突变体天然地突变的沙粒病毒）中。换而言之，在该实施方案中，所述沙粒病毒在整体上不包含外来RNA，也就是说既不包含基因组外来RNA也不包含非基因组外来RNA。[0023]在一个优选的实施方案中，所述沙粒病毒是野生型沙粒病毒。[0024]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒是野生型沙粒病毒的天然突变体，即天然地突变的沙粒病毒。[0025]所述天然突变体或所述天然地突变的沙粒病毒优选地通过在宿主动物和或宿主细胞中传代、尤其是多次传代制备。[0026]所述天然突变体或所述天然地突变的沙粒病毒特别优选地通过在宿主动物和或宿主细胞中连续传代制备。[0027]根据本发明提供的沙粒病毒因而优选地是这样的沙粒病毒:其从它的野生型形式开始通过在宿主动物和或宿主细胞中传代、优选地连续传代制备。[0028]在上述段落中提及的宿主动物优选地是啮齿类动物，特别是小鼠。另一方面，在以前段落中提及的宿主细胞优选地是树突细胞或肿瘤细胞。[0029]在本发明的上下文中，与本领域技术人员的理解相一致，术语“传代”应被理解为是指，沙粒病毒多次规则地引入宿主动物和或宿主细胞中。在本发明的上下文中，与本领域技术人员的理解相一致，表述“连续传代”应被理解为是指，沙粒病毒多次规则地引入不同的宿主动物，优选相同类型的宿主动物和或不同的细胞，优选相同类型的细胞中。由于环境宿主动物和或宿主细胞的多次变化，沙粒病毒遭受增加的适应压力或突变压力，由此增加从肿瘤消退的角度看在沙粒病毒的基因组中发生有利突变的可能性。[0030]在另一个实施方案中，所述肿瘤选自包含癌、黑素瘤、母细胞瘤、淋巴瘤和肉瘤或由它们组成的组。[0031]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），术语“癌”应被理解为是指上皮起源的恶性瘤形成。[0032]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），术语“肉瘤”应被理解为是指中胚层起源的恶性瘤形成。[0033]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），术语“黑素瘤”应被理解为是指黑素细胞起源的恶性瘤形成。[0034]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），术语“淋巴瘤”应被理解为是指淋巴细胞起源的恶性瘤形成。[0035]在本发明的上下文中（与本领域技术人员的理解相一致），术语“母细胞瘤”应被理解为是指胚胎起源的恶性瘤形成。[0036]在一个优选的实施方案中，所述癌选自包含肛门癌、支气管癌、肺癌、子宫内膜癌、胆囊癌、肝细胞癌、睾丸癌、结肠直肠癌、喉癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺肿瘤、咽癌、前列腺癌、甲状腺癌和宫颈癌或由它们组成的组。[0037]在一个优选的实施方案中，所述肉瘤选自包含血管肉瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经源性肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤或由它们组成的组。[0038]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒是旧大陆沙粒病毒，其优选地选自包含伊派病毒IP-PYV、拉沙病毒LASV、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV、莫巴拉病毒MOBV和莫佩亚病毒MOPV或由它们组成的组。[0039]在一个特别优选的实施方案中，所述沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，优选是选自包含WE、Armstrong、Clone13和DociIe或由它们组成的组的毒株。[0040]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒是新大陆沙粒病毒，其优选地选自包含奥尔帕瓦约（Allpahuayo病毒ALLV、阿马帕里Amapari病毒AMAV、熊峡谷病毒（BCNV、Chapare病毒、库皮科斯Cupixi病毒CPXV、Flexal病毒FLEV、瓜纳瑞托病毒GTOV、胡宁病毒JUNV、拉蒂诺Latino病毒LATV、马丘波病毒MACV、Oliveros病毒OLVV、帕腊南Parana病毒PARV、伯钦特病毒PICV、Pirital病毒PIRV、沙比亚病毒SABV、塔卡里伯病毒TCRV、太米阿米病毒TAMV和白水河病毒0VWAV或由它们组成的组。[0041]在一个特别优选的实施方案中，所述沙粒病毒是胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1CandidNo.I〇[0042]在另一个实施方案中，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1CandidNo.I，具有根据SEQIDNo.1根据序列表的核酸序列，尤其是S-核糖核酸序列或双义序列。[0043]在另一个实施方案中，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1CandidNo.1，具有根据SEQIDNo.2根据序列表的核酸序列，尤其是L-核糖核酸序列或双义序列。[0044]在另一个实施方案中，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1CandidNo.1，具有根据SEQIDNo.3根据序列表的核酸序列，尤其是S-核糖核酸序列或双义序列。[0045]在另一个实施方案中，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1CandidNo.1，具有根据SEQIDNo.4根据序列表的核酸序列，尤其是L-核糖核酸序列或双义序列。[0046]在另一个实施方案中，上面提及的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV病毒具有根据SEQIDNo.5根据序列表的核酸序列，尤其是S-核糖核酸序列或双义序列。[0047]在另一个实施方案中，上面提及的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV病毒具有根据SEQIDNo.6根据序列表的核酸序列，尤其是L-核糖核酸序列或双义序列。[0048]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒分离自肿瘤裂解物、器官裂解物、尿或血液。[0049]在一个替代实施方案中，所述沙粒病毒分离自细胞培养基，尤其是人肿瘤细胞系。[0050]在另一个实施方案中，所述沙粒病毒以位于细胞外的病毒粒子的形式，即以沙粒病毒颗粒的形式存在以用于施用。[0051]在另一个实施方案中，提供、优选地制备所述沙粒病毒以用于局部、尤其是肌肉内、腹膜内或皮下施用。换而言之，所述沙粒病毒在另一个实施方案中用于局部、尤其是肌肉内、腹膜内或皮下施用。[0052]优选的是，提供、优选地制备所述沙粒病毒以用于以IPFlK噬斑形成单位kg体重至1012PFUkg体重、特别是IO2PFUkg体重至IO6PFUkg体重、优选地IO3PFUkg体重至IO5PFUkg体重的剂量局部施用。换而言之，所述沙粒病毒优选地用于以IPFU噬斑形成单位kg体重至1012PFUkg体重、特别是IO2PFUkg体重至IO6PFUkg体重、优选地IO3PFUkg体重至IO5PFUkg体重的剂量局部施用。[0053]在一个替代实施方案中，提供、优选地制备所述沙粒病毒以用于全身、尤其是静脉内施用。换而言之，在一个替代实施方案中，所述沙粒病毒用于全身、尤其是静脉内施用。[0054]优选的是，提供、优选地制备所述沙粒病毒以用于以IPFUkg体重至IO12PFUkg体重、特别是IO2PFUkg体重至IO6PFUkg体重、优选地IO3PFUkg体重至IO5PFUkg体重的剂量全身施用。换而言之，所述沙粒病毒优选地用于以IPFUkg体重至IO12PFUkg体重、特别是IO2PFUkg体重至IO6PFUkg体重、优选地IO3PFUkg体重至IO5PFUkg体重的剂量全身施用。[0055]根据第二方面，本发明涉及用于治疗和或预防肿瘤、尤其是恶性肿瘤的药物。[0056]所述药物的特征特别地在于:它具有根据本发明的第一方面的沙粒病毒。[0057]所述药物优选地还包含药学上可接受的载体。所述载体特别地可以选自包含水、盐水溶液、缓冲溶液和细胞培养基或由它们组成的组。[0058]在另一个实施方案中，所述药物也包含活性成分。所述活性成分特别地可以是细胞抑制剂、抗体和或细胞因子。[0059]关于所述药物、尤其是沙粒病毒的其它特征和优点以及肿瘤，完全参考目前为止的说明书以避免重复。[0060]根据第三方面，本发明涉及用于制备具有肿瘤消退（即肿瘤摆脱对抗性能或改善的肿瘤消退性能的沙粒病毒的方法。[0061]所述肿瘤优选地是恶性肿瘤，优选癌、黑素瘤、母细胞瘤、淋巴瘤或肉瘤。因此，所述方法优选地是用于制备具有改善的）癌_、黑素瘤_、母细胞瘤_、淋巴瘤-或肉瘤-消退性能的沙粒病毒的方法。[0062]所述方法包括下述步骤：a用沙粒病毒感染树突细胞或肿瘤细胞，b在受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞中培养所述沙粒病毒，和c从受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞分离所述培养的沙粒病毒或培养的沙粒病毒的一部分Teilmenge〇[0063]步骤次序a至c也可以被称作沙粒病毒在树突细胞或肿瘤细胞中的单次传代。[0064]在一个优选的实施方案中，所述沙粒病毒是在进行步骤a之前已经在宿主动物中进行连续传代的沙粒病毒。关于其它细节和优点，可以参考在本发明的第四方面的上下文中做出的对应阐述。[0065]在另一个实施方案中，所述树突细胞或肿瘤细胞是呈细胞培养物树突细胞培养物或肿瘤细胞培养物的形式。[0066]所述肿瘤细胞优选地是恶性肿瘤细胞，尤其是癌-、黑素瘤-、母细胞瘤-、淋巴瘤-或肉瘤细胞。[0067]所述癌细胞可以选自包含肛门癌细胞、支气管癌细胞、肺癌细胞、子宫内膜癌细胞、胆囊癌细胞、肝细胞癌细胞、睾丸癌细胞、结肠直肠癌细胞、喉癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺肿瘤细胞、咽癌细胞、前列腺癌细胞、甲状腺癌细胞和宫颈癌细胞或由它们组成的组。[0068]所述肉瘤细胞可以选自包含血管肉瘤细胞、软骨肉瘤细胞、尤文肉瘤细胞、纤维肉瘤细胞、卡波西肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、恶性纤维组织细胞瘤细胞、神经源性肉瘤细胞、骨肉瘤细胞和横纹肌肉瘤细胞或由它们组成的组。[0069]在另一个实施方案中，所述肿瘤细胞是永生化的免疫细胞，尤其是永生化的巨噬细胞。[0070]优选地通过将沙粒病毒加给所述细胞，根据步骤a感染所述树突细胞或肿瘤细胞。[0071]在一个优选的实施方案中，用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或用新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型（相同肿瘤类型）的那些重复步骤次序a至c。[0072]在一个特别优选的实施方案中，将步骤次序a至c重复多次。作为优选，为每次重复使用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型的那些。[0073]优选地将步骤次序a至c重复1次至10000次，特别是10次至1000次，优选地30次至60次，其中优选地为每次重复使用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型的那些。[0074]通过步骤次序a至c的多次重复，所述沙粒病毒持续地被迫适应新的环境，即新的树突细胞或肿瘤细胞。该持久的适应压力有利于突变的发生，由此可以产生或改善所述沙粒病毒的肿瘤消退性能。[0075]在根据步骤b的沙粒病毒培养过程中，在树突细胞或肿瘤细胞内发生沙粒病毒基因组的复制和沙粒病毒的繁殖。[0076]优选地在标准细胞培养条件下根据步骤b培养沙粒病毒。[0077]优选地将沙粒病毒在树突细胞或肿瘤细胞中培养1分钟至1年、尤其是10小时至1个月、优选24小时至72小时的时间段。[0078]优选地从细胞培养物上清液中根据步骤c分离经培养的沙粒病毒。[0079]优选地，在根据步骤c的分离之前，将所述树突细胞或肿瘤细胞根据特定性能、优选地借助于细胞分选装置进行分选，并随后培养。优选地将经分选的细胞培养24小时的时间段。[0080]在另一个实施方案中，所述方法还包括下述步骤：d克隆所述分离的沙粒病毒，和e将所述分离的沙粒病毒测序。[0081]关于所述方法、尤其是沙粒病毒的其它特征和优点以及肿瘤，参考本说明书。[0082]根据第四方面，本发明涉及用于制备具有肿瘤消退，S卩肿瘤摆脱对抗性能或改善的肿瘤消退性能的沙粒病毒的方法。[0083]所述肿瘤优选地是恶性肿瘤，优选地是癌、黑素瘤、母细胞瘤、淋巴瘤或肉瘤。因此，所述方法优选地是用于制备具有改善的癌_、黑素瘤_、母细胞瘤_、淋巴瘤-或肉瘤-消退性能的沙粒毒病的方法。[0084]所述方法包括下述步骤：a用沙粒病毒感染具有肿瘤的宿主动物，b在受感染的宿主动物中培养所述沙粒病毒，和c从受感染的宿主动物分离所述培养的沙粒病毒或培养的沙粒病毒的一部分。[0085]步骤次序a至c也可以被称作沙粒病毒在宿主动物中的单次传代。[0086]在一个优选的实施方案中，在进行步骤a之前将肿瘤组织移植至所述宿主动物。[0087]在一个替代实施方案中，使用通过遗传工程修饰的宿主动物，其自发地发生肿瘤。[0088]特别是啮齿类动物，优选地小鼠，可以用作宿主动物。例如，NODSCID小鼠或LoxP-Tag小鼠可以用作宿主动物。在NodSCID小鼠中，SCID突变重症联合免疫缺陷）与NOD非月巴胖糖尿病类型组合。在SCID突变纯合的小鼠中，没有形成功能性的T-细胞或B-细胞。借助于该免疫缺陷，这些动物特别适合于耐受异体细胞，例如移植的肿瘤。[0089]可以例如通过沙粒病毒的全身，特别是静脉内，或局部，例如皮下的施用，根据步骤a感染宿主动物。[0090]特别地，可以通过将沙粒病毒施用，优选地注射进宿主动物的肿瘤中感染宿主动物。[0091]在一个优选的实施方案中，用新的、尤其是未感染的宿主动物，优选相同类型的那些重复步骤次序a至c。[0092]在一个特别优选的实施方案中，将步骤次序a至c重复多次。优选地为每次重复使用新的、尤其是未感染的宿主动物，优选相同类型那些。换而言之，如果对沙粒病毒进行在宿主动物，优选相同类型那些中的连续传代，根据本发明是优选的。[0093]优选地将步骤次序a至c重复1次至1000次，特别是10次至100次，优选地30次至60次，其中为每次重复使用新的、尤其是未感染的宿主动物，优选相同类型的那些。[0094]通过步骤次序a至c的多次重复，所述沙粒病毒持续地被迫适应新的环境，即新的宿主动物。该持久的适应压力有利于突变的发生，由此可以产生或改善所述沙粒病毒的肿瘤消退性能。[0095]在根据步骤b的沙粒病毒培养过程中，在宿主动物内发生沙粒病毒基因组的复制和沙粒病毒的繁殖。[0096]优选地将沙粒病毒在宿主动物中培养1分钟至500天、尤其是10分钟至100天、优选1小时至30天的时间段。[0097]在一个优选的实施方案中，所述沙粒病毒分离自宿主动物的尿、血液、肿瘤或器官裂解物。[0098]在另一个实施方案中，所述方法还包括下述步骤：d用根据步骤c分离的沙粒病毒感染树突细胞或肿瘤细胞，e在受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞中培养所述沙粒病毒，和f从受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞分离所述培养的沙粒病毒或培养的沙粒病毒的一部分。[0099]步骤次序d至f也可以被称作沙粒病毒在树突细胞或肿瘤细胞中的单次传代。[0100]优选地通过将沙粒病毒加给所述细胞，根据步骤d感染树突细胞或肿瘤细胞。[0101]在一个优选的实施方案中，用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或用新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型（相同肿瘤类型）的那些重复步骤次序d至f。[0102]在一个特别优选的实施方案中，将步骤次序d至f重复多次。作为优选，为每次重复使用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型的那些。换而言之，如果另外对沙粒病毒进行在树突细胞，优选相同类型的那些，或肿瘤细胞，优选相同类型的那些中的连续传代，根据本发明是特别优选的。[0103]优选地将步骤次序d至f重复1次至1000次，特别是10次至100次，优选地30次至60次，其中优选地为每次重复使用新的、尤其是未感染的树突细胞，优选相同类型的那些，或新的、尤其是未感染的肿瘤细胞，优选相同类型的那些。[0104]由于额外增加的适应压力或突变压力，沙粒病毒在宿主动物，优选相同类型的那些中的连续传代与沙粒病毒在树突细胞，优选相同类型的那些，或肿瘤细胞，优选相同类型的那些中的连续传代的组合特别地适合于制备具有改善的肿瘤消退性能的沙粒病毒。[0105]优选地将沙粒病毒在树突细胞或肿瘤细胞中培养1分钟至500天、尤其是10分钟至100天、优选1小时至30天的时间段。[0106]优选地，在根据步骤f分离之前，将所述树突细胞或肿瘤细胞根据特定性能、优选地借助于细胞分选装置进行分选，并随后培养。优选地将经分选的细胞培养24小时的时间段。[0107]在另一个实施方案中，所述方法还包括下述步骤：g克隆根据步骤f分离的沙粒病毒，和h将分离的沙粒病毒测序。[0108]替代地，根据本发明可以提供的是，将根据步骤c分离的沙粒病毒克隆并随后测序。[0109]关于所述方法、尤其是沙粒病毒的其它特征和优点、肿瘤以及树突细胞和肿瘤细胞，同样完全参考目前为止的说明书，以避免不必要的重复。[0110]本发明的其它特征和优点从呈实施例、所属附图和权利要求形式的优选实施方案的以下描述显现。下述实施方案仅仅用于阐述和用于更好地理解本发明，并且决不应当理解为限制性的。[0111]实验部分1.方法和材料1.1小鼠除非另外提及，否则使用的小鼠是来自C57BL6背景。Map3id4a〃aiM、鼠缺乏号且因此是高度免疫抑制的。Irf3ZIr7v々j、鼠不能产生干扰素。MD.SCID小鼠不具有适应性免疫系统。因此，可能在这些小鼠中生长人肿瘤。LoxP-Tag小鼠自发地发生肝肿瘤。[0112]1.2细胞系和试剂MOPC细胞是鼠口咽癌细胞。Mc38是鼠结肠癌细胞。Raw细胞是永生化的巨噬细胞。A431是人肺癌细胞;Sw40是人结肠癌细胞，HeIa是人宫颈癌细胞。借助于M-CSF从骨髓前体细胞培养原代巨噬细胞。将细胞维持在含有10%胎牛血清Sigma-Aldrich、2mmol1L-谷氨酰胺和100Uml青霉素的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基中。在5%CO2中培养所有细胞。[0113]1.3病毒LCMV毒株WE得自Zinkernagel教授实验免疫学，苏黎士，瑞士）的实验室，并在L929细胞中繁殖。Candid#1得自PaulaCannon教授南加州大学）。[0114]1.4肿瘤生长和治疗将大约5XIO5个肿瘤细胞在100yL中）皮下地注射进6-12周龄小鼠的右胁腹中。测量最长肿瘤直径。通过在肿瘤周围注射2XIO4PFULCMV-WE或Candid#1在100-200yL中）来治疗小鼠。[0115]1.5肿瘤血管的形态测定分析用连续冷冻切片进行形态测定分析，其中将内皮细胞标志物CD31染色。使用三个肿瘤切片的平均值计算微血管密度MVD的定量。将MVD计算为每肿瘤面积的血管数目。[0116]1.6低氧的检测在将昵莫硝唑注射进移植肿瘤的动物中后，通过昵莫硝唑加合物的形成来检测低氧肿瘤区域30min。使用Hypoxyprobe-1Plus试剂盒根据生产商的说明书（PharmaciaNaturInternational,Inc.将肿瘤切片染色。[0117]1.7IFN-aELISA根据生产商的数据ResearchDiagnosticsRDI，Flanders,NJ通过ELISA确定血清IFN-α水平。[0118]1.8统计分析使用不成对的Student两侧t-检验对比平均值。将数据显示为平均值土SEM。将统计显著性水平设定在P〈0.05。[0119]2.研究2.1用LCMVWE毒株感染永生化的巨噬细胞肿瘤细胞和从原代骨髓产生的巨噬细胞原代）。24小时以后测量复制η=3。[0120]可以证实，LCMVWE毒株在永生化的和健康的细胞中复制。得到的结果用图显示在图1中。[0121]图1具有下述图例：纵坐标：LCMVlogioPFUml横坐标:肿瘤细胞健康的巨噬细胞原代）。[0122]2.2用5XIO5个MOPC细胞第3天治疗WTC57BL6小鼠。另外用2XIO4PFULCMVWE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。观察肿瘤生长。[0123]可以证实，用LCMV的治疗造成几乎完全肿瘤消退。得到的结果用图显示在图2中。[0124]图2具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0125]2.3用5叉105个]\«：38细胞治疗訂〇578176小鼠（第3天）。另外用2叉104?卩1]1^1^WE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。观察肿瘤生长。[0126]可以证实，用LCMV的治疗造成显著的肿瘤消退。得到的结果用图显示在图3中。[0127]图3具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0128]2.4将具有自发地发生的肝癌的约9月龄LoxP-TAg小鼠用2XIO6PFULCMV静脉内地感染或保持不治疗。在第6天η=3和第20天η=4-5通过肉眼定量肿瘤结直径=3mm〇[0129]可以证实，用LCMV的治疗显著地减少癌性肝结的数目。得到的结果用图显示在图4中。[0130]图4具有下述图例：纵坐标:肝结数目）横坐标:时间。[0131]2.5给WTC57BL6小鼠（η=4组皮下地注射5XIO5个MOPC细胞第-3天）、或2XIO4PFULCMVWE毒株）（第0天）、或5XIO5个MOPC细胞第-3天和2XIO4PFULCMV第0天两者。在第3天收集血清样品并进行IFN-a-ELISA。[0132]可以证实，所述LCMV在同时施用癌细胞的实验动物中造成急剧增加的干扰素-γ分泌。得到的结果用图显示在图5中。[0133]图5具有下述图例：纵坐标：IFN-αpgml。[0134]2.6用5XIO5个MOPC细胞治疗小鼠和WT小鼠（第3天）。另外用2XIO4PFULCMVWE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。观察肿瘤生长。[0135]可以证实，用LCMV的治疗造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图6中。[0136]图6具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0137]2.7用5XIO5个MOPC细胞治疗XIr7__小鼠和WT小鼠（第3天）。另外用2XIO4PFULCMVWE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。观察肿瘤生长。[0138]可以证实，用LCMV的治疗造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图7中。[0139]图7具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0140]2.8用5XIO5个MOPC细胞治疗WT小鼠（第3天）。另外用2XIO4PFULCMVCffE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。在肿瘤移植以后第9天，通过⑶31染色在组织学上分析肿瘤。定量微血管密度MDV和血管-血管间距。[0141]可以证实，用LCMV的治疗造成肿瘤血管密度的下降。得到的结果用图显示在图8A中。[0142]图8A具有下述图例：左侧：右侧：纵坐标:MVD[mm3]纵坐标:血管-血管间距μπι横坐标:肿瘤肿瘤LCMV横坐标:肿瘤肿瘤LCMV。[0143]2.9用5XIO5个MOPC细胞治疗WT小鼠（第3天）。另外用2XIO4PFULCMV0VE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。在第9天，给所述动物注射昵莫硝唑，然后针对低氧区域在组织学上分析肿瘤。[0144]可以证实，用LCMV的治疗造成癌组织中的氧供应不足。得到的结果用图显示在图8Β中。[0145]图8Β具有下述图例：纵坐标:低氧区域肿瘤%横坐标:肿瘤肿瘤LCMV。[0146]2.10给WTC57BL6小鼠在右胁腹皮下地注射5XIO5个MOPC细胞第3天）。在第0天，在右胁腹（同侧的）、左胁腹对侧的）或静脉内地用2XIO4PFULCMVWE毒株治疗一组动物。观察肿瘤生长。[0147]可以证实，在全身施用时，用LCMV的治疗也造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图9中。[0148]图9具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0149]2.11给NOD.SCID小鼠皮下地注射5XIO5个A431细胞第-3天），并然后保持不治疗或用2XIO4PFULCMVWE毒株治疗。在指定的天测量肿瘤大小最长直径）。当肿瘤大小达到12mm时，将小鼠处死。[0150]可以证实，用LCMV的治疗增加了实验动物中的存活率。得到的结果用图显示在图10中。[0151]图10具有下述图例：纵坐标:存活率%横坐标:时间天）。[0152]2.12用5XIO5个Sw40细胞治疗NOD.SCID小鼠（第0天）。另外用2XIO4PFULCMVWE毒株在肿瘤周围或用2XIO4PFUCandid#1在肿瘤周围治疗一组小鼠（第0天）。观察肿瘤生长。[0153]可以证实，用LCMV和Candid#1的治疗造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图11中。[0154]图11具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0155]2.13用5XIO5个Hela细胞治疗N0D.SCID小鼠（第0天）。另外用2XIO4PFULCMVWE毒株在肿瘤周围治疗一组小鼠（第3天）。观察肿瘤生长。[0156]可以证实，用LCMV的治疗造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图12中。[0157]图12具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0158]2.14将NOD.SCID小鼠用5XIO5个HepG2细胞治疗第-10天），并然后另外用或不用2XIO4PFUCandid#1在肿瘤周围治疗第0天）。观察肿瘤生长。[0159]可以证实，用Candid#1的治疗在该肿瘤类型的情况下造成肿瘤消退。得到的结果用图显示在图13中。[0160]图13具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0161]2.15用LCMV感染原代人细胞肝细胞、结肠上皮细胞、黑素细胞和来自相同组织来源的肿瘤细胞Μ0Ι1。1、2和3天以后在上清液中测量病毒的量。[0162]在该实验中，可以证实沙粒病毒与健康组织相比在肿瘤细胞中增多地复制。[0163]图14具有下述图例：纵坐标:在细胞培养物上清液中的传染性病毒对数噬斑形成单位）横坐标:时间天）。[0164]2.16带有在肩部中的转移灶和在胁腹中的转移灶⑽PC细胞）的C57BL6小鼠的肿瘤直径A和存活率B，其保持不治疗或已经用2xl06PFULCMV静脉内地治疗。[0165]在该实验中可以证实，LCMV的静脉内疗法非常有效地作用于两个局部转移灶并因而延长存活。[0166]图15A具有下述图例：纵坐标:两个转移灶的肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0167]图15B具有下述图例：纵坐标:存活率百分比横坐标:时间天）。[0168]2.17带有黑素瘤B16F10细胞）的C57BL6小鼠的肿瘤直径，其保持不治疗或用2xl04PFULCMV肿瘤内地治疗。[0169]在该实验中可以证实，使用LCMV的局部疗法在黑素瘤的情况下是非常有效的。[0170]图16具有下述图例：纵坐标:黑素瘤的肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0171]2.18MTret小鼠的黑素瘤的数目（发生内源性黑素瘤），其保持不治疗或用2xl06PFULCMV静脉内地治疗。[0172]在该实验中可以证实，使用LCMV的全身疗法在黑素瘤的情况下是非常有效的。[0173]图17具有下述图例：纵坐标:黑素瘤的数目。[0174]2.19带有人纤维肉瘤Sw872细胞的NOD.SCID小鼠的肿瘤直径A和存活率⑻，其保持不治疗或用2xl06PFUCandid#1瘤内地治疗。[0175]在该实验中可以证实，Candid#1在纤维肉瘤的情况下也非常有效地起作用并因而延长存活。[0176]图18A具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0177]图18B具有下述图例：纵坐标:存活率百分比横坐标:时间天）。[0178]2.20带有人咽癌FaDu细胞）的NOD.SCID小鼠的肿瘤直径A和存活率⑻，其保持不治疗或用2xl06PFULCMV肿瘤内地治疗。[0179]在该实验中可以证实，LCMV在人咽癌的情况下也非常有效地起作用并因而延长存活。[0180]图19A具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0181]图19B具有下述图例：纵坐标:存活率百分比横坐标:时间天）。[0182]2.21在肿瘤特异性的T细胞上的受体PD-1、IL2受体、IL7受体的表达，其影响T细胞的功能。肿瘤特异性的T细胞源自具有B16F10肿瘤且另外在有或没有LCMV的情况下瘤内地治疗的小鼠的血液。[0183]在该实验中可以证实，LCMV积极地影响肿瘤特异性的T细胞。[0184]图20具有下述图例：纵坐标:不同受体的表达的效能StSrke平均荧光强度）。[0185]2.22带有鼠皮下淋巴瘤EL4细胞）的C57BL6小鼠的肿瘤直径A和存活率⑻，其用或不用肿瘤特异性的T细胞0T1细胞治疗并另外用或不用LCMV2xl06PFU瘤内地治疗。[0186]在该实验中可以证实，LCMV与T细胞疗法协同地起作用。[0187]图21A具有下述图例：纵坐标:肿瘤直径cm横坐标:时间天）。[0188]图21B具有下述图例：纵坐标:存活率百分比横坐标:时间天）。[0189]2.23带有鼠咽癌M0PC细胞且用LCMV2xl04PFU瘤内地治疗的C57BL6小鼠和ro-i缺陷型小鼠fticd厂—小鼠）的存活率。[0190]在该实验中可以证实，LCMV与ro-1阻断协同地起作用。[0191]图22具有下述图例：纵坐标:存活率百分比横坐标:时间天）。[0192]在一般描述中提及的核酸序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6对应于在下述序列表中公开的核酸序列。[0193]序列表序列表）LangKarlSebastian〈120用于治疗癌或肉瘤的沙粒病毒以及用于制备对癌和肉瘤具有改善的免疫治疗效果的沙粒病毒的方法〈213胡宁病毒〈223胡宁病毒毒株Candid-I片段S-AY746353-病毒;ssrna负链病毒;沙粒病毒科;沙粒病毒;新大陆沙粒病毒〈213胡宁病毒〈223胡宁病毒毒株Candid#1片段L-AY819707-病毒;ssrna负链病毒;沙粒病毒科;沙粒病毒;新大陆沙粒病毒〈213胡宁哺乳动物沙粒病毒〈223胡宁病毒毒株Candid#1片段S，完整序列.-ACCESSIONFJ969442-版本FJ969442.1-GI:264665554-病毒；ssRNA病毒；ssRNA负链病毒;沙粒病毒科；哺乳动物沙粒病毒。〈213胡宁哺乳动物沙粒病毒〈223胡宁病毒毒株Candid#1片段L，完整序列.-ACCESSIONAY819707-版本AY819707.2-GI:227957900-病毒；ssRNA病毒；ssRNA负链病毒;沙粒病毒科；哺乳动物沙粒病毒。〈213淋巴细胞性脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒病毒LCMV〈223淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒Clone13片段S，完整序列.ACCESSIONDQ361065-版本DQ361065.2-GI:116563461.-ssRNA病毒；ssRNA负链病毒;沙粒病毒科；哺乳动物沙粒病毒。〈213淋巴细胞性脉络丛脑膜炎哺乳动物沙粒病毒病毒LCMV〈223淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒Clone13片段L，完整序列.-ACCESSIONDQ361066-版本DQ361066.1-GI:86440167.-ssRNA病毒；ssRNA负链病毒;沙粒病毒科；哺乳动物沙粒病毒

权利要求：1.用于治疗和或预防肿瘤的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒不含有基因组外来RNA02.根据权利要求1中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是野生型沙粒病毒。3.根据权利要求1中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是天然突变体。4.根据前述权利要求中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒从它的野生型形式开始通过在宿主动物和或宿主细胞中连续传代来制备。5.根据前述权利要求中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述肿瘤选自包含癌、黑素瘤、母细胞瘤、淋巴瘤或肉瘤或由它们组成的组。6.根据权利要求5中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述癌选自包含肛门癌、支气管癌、肺癌、子宫内膜癌、胆囊癌、肝细胞癌、睾丸癌、结肠直肠癌、喉癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺肿瘤、咽癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤和宫颈癌或由它们组成的组。7.根据权利要求5中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述肉瘤选自包含血管肉瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经源性肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤或由它们组成的组。8.根据前述权利要求中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是旧大陆沙粒病毒，其优选地选自包含伊派病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒或由它们组成的组。9.根据前述权利要求中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。10.根据权利要求1-7中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是新大陆沙粒病毒，其优选地选自包含奥尔帕瓦约病毒、阿马帕里病毒、熊峡谷病毒、Chapare病毒、库皮科斯病毒、Flexal病毒、瓜纳瑞托病毒、胡宁病毒、Candid#1CandidNo.1、拉蒂诺病毒、马丘波病毒、Oliveros病毒、帕腊南病毒、伯钦特病毒、Pirital病毒、沙比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒和白水河病毒或由它们组成的组。11.根据权利要求1-7或10中的任一项中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述沙粒病毒是胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1。12.根据权利要求10或11中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1，具有根据SEQIDNo.1的核酸序列，尤其是S-核糖核酸序列或双义序列，和根据SEQIDNo.2的核酸序列，尤其是L-核糖核酸序列或双义序列。13.根据权利要求10或11中所述的沙粒病毒，其特征在于，所述胡宁病毒，尤其是毒株Candid#1，具有根据SEQIDNo.3的核酸序列，尤其是S-核糖核酸序列或双义序列，和根据SEQIDNo.4的核酸序列，尤其是L-核糖核酸序列或双义序列。14.用于治疗和或预防肿瘤的药物，其特征在于，所述药物包含根据前述权利要求中的任一项中所述的沙粒病毒和优选的药学上可接受的载体。15.用于制备具有肿瘤消退或改善的肿瘤消退性能的沙粒病毒、尤其是根据权利要求1-13中的任一项中所述的沙粒病毒的体外方法，所述方法包括下述步骤：a用沙粒病毒感染树突细胞或肿瘤细胞，b在受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞中培养所述沙粒病毒，和c从受感染的树突细胞或受感染的肿瘤细胞分离所述培养的沙粒病毒或培养的沙粒病毒的一部分。16.根据权利要求15中所述的体外方法，其特征在于，所述沙粒病毒是在进行步骤a之前已经在宿主动物中进行连续传代的沙粒病毒。17.根据权利要求15或16中所述的体外方法，其特征在于，将步骤次序a至c重复1次至1000次，特别是10次至100次，优选地30次至60次，其中为每次重复使用新肿瘤细胞，优选相同类型的新肿瘤细胞。

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