申请/专利权人：郑州大学

申请日：2022-12-19

公开（公告）日：2023-04-21

公开（公告）号：CN115993444A

主分类号：G01N33/53

分类号：G01N33/53;G01N21/64;G01N1/38;G16H50/20;G16H10/40

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.05.09#实质审查的生效;2023.04.21#公开

摘要：本发明公开了一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，包括获取待检患者的检验样本和特征信息、检测样本阳性初筛、构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK‑293T细胞模型、利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK‑293T细胞模型确证GFAP抗体、构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型和评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率步骤。本发明通过构建患者特征信息数据库，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型，可以根据模型的分类结果，通过待检患者的基本信息和临床症状信息预测患者GFAP抗体阳性的概率，并提出新的检测方法以提高GFAP抗体检出的准确性，探究GFAP星形细胞病的诊治方案，对于制定合理的诊治方案具有一定的指导意义。

主权项：1.一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；步骤二：检测样本阳性初筛取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK-293T细胞模型具体步骤为：S1，构建真核表达载体利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHIXhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；S2，细胞转染当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti-MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过westernblotting方法检测GFAP蛋白的表达；步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK-293T细胞模型确证GFAP抗体取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油-PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型具体步骤为：S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为特征信息数据库中真反例个数；FP为特征信息数据库中伪正例个数；FN为特征信息数据库中伪反例个数。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 郑州大学 一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法

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