申请/专利权人：石家庄市农林科学研究院;北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司

申请日：2022-07-07

公开（公告）日：2023-05-30

公开（公告）号：CN115161269B

主分类号：C12N5/077

分类号：C12N5/077;A01N1/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.30#授权;2022.10.28#实质审查的生效;2022.10.11#公开

摘要：本发明涉及细胞培养技术领域，具体公开一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法。所述乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法包括样品采集、原代培养、传代培养、细胞冻存以及细胞复苏过程。本发明提供的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法能够获得高纯度、高活率的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞，且分离培养过程中成纤维细胞易贴壁生长以及消化脱壁，只需2次传代就可将成纤维细胞分离纯化。

主权项：1.一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：a、以活体乌苏里貉为采集对象，对其耳部进行去毛和消毒，然后剪下0.5cm2-1.5cm2的耳缘组织，消毒、清洗，保存备用；所述清洗所用的清洗液为含500IUmL青霉素、500IUmL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；所述保存所用的保存液为含3-4gL的HEPES、100IUmL青霉素、100IUmL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；b、将所述耳缘组织放入装有dispaseⅡ消化液的离心管中进行消化，取出所述耳缘组织，去除表皮，剪碎，得到耳缘组织碎片；将所述耳缘组织碎片置于原代培养基中培养，待所述耳缘组织碎片完全贴壁后，每间隔2d-3d天更换一次原代培养基，待所述耳缘组织碎片周围长出新细胞，即为原代细胞；所述dispaseⅡ消化液为含0.18-0.22mgmL的dispaseⅡ的高糖DMEM，所述耳缘组织与所述dispaseⅡ消化液的体积比为1:4-6；所述消化的温度为35℃-40℃、时间为1h-2h；所述原代培养基为含100IUmL青霉素、100IUmL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；c、当所述原代细胞生长至汇合度达到80％-90％时，用PBS清洗，并加入胰蛋白酶消化液进行消化，所述胰蛋白酶消化液的加入量为耳缘组织碎片体积的3-5倍，当所述原代细胞由纤维状变为球状时，加入传代培养基终止消化并混匀，得到细胞悬浮液；将所述细胞悬浮液加入到细胞培养瓶中，进行第一次传代培养，待细胞贴壁后吸出培养液，并加入新的传代培养基继续培养，待细胞汇合度到达80％-90％，进行下一次传代培养；经过2-3次传代培养后，得到纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞；所述传代培养基是含100IUmL青霉素、100IUmL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；d、向所述纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞中加入细胞冻存液，进行细胞冻存，所述细胞冻存液的配制方法为：将DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:7-9:0.8-1.2的体积比混合后，加入蔗糖，使所述蔗糖在所述细胞冻存液中的浓度达到65-70gL；e、将冻存的细胞进行细胞复苏。

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