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申请/专利权人:中山大学附属第三医院
摘要:本发明公开了一种miR4298通过LncRNA‑CTSD2调控组织蛋白酶D阻断AGEs异常堆积在皮肤慢性紫外线损伤中的方法,本发明发现慢性紫外线损伤角质细胞miR4298海绵吸附于LncRNA‑KRTAP5‑6‑3,可通过MAPK、ERK、TGF‑βSmad信号通路,调控组织蛋白酶D表达、活性及细胞自噬;并通过上调组织蛋白酶D酶的表达,激活AGEs自噬酶解过程,最终阻断组织蛋白酶D异常堆积。
主权项:1.一种miR4298通过LncRNA-CTSD2调控组织蛋白酶D阻断AGEs异常堆积在皮肤慢性紫外线损伤中的方法,其特征在于,所述方法包括:S1原代皮肤成纤维细胞培养取儿童包皮,分离培养皮肤成纤维细胞,培养至第3代冻存,取细胞复苏后10代以内的细胞行后续实验;S2建立皮肤成纤维细胞慢性光损伤模型,其中包括:细胞分为UVA照射组连续和空白对照组不照射,将3-6代成纤维细胞按1X106皿接种于直径6cm的细胞培养皿,待细胞长到70%融合时,弃培养液,PBS洗涤2次后,加2mLPBS。将UVA照射组细胞置于UVA辐照仪下,细胞距离光源15cm,平均照射功率为12.7mWcm2,设置单次照射时间为780s,照射剂量为9.9Jcm2,照射结束后PBS洗涤1次,加入2mL的DMEM培养基,每24h照射1次,连续照射14d。空白对照组细胞加入PBS后置于超净台避光,在DMEM培养基中培养14d;S3β-半乳糖苷酶染色检测细胞老化率,末次UVA照射后48h去除DMEM培养基,PBS洗涤1次,按照试剂盒说明书检测细胞老化。显微镜下观察结果,老化细胞胞质被染成蓝色,每皿至少计数500个细胞,计算阳性细胞所占百分比;实验重复3次,取均值;S4流式细胞仪检测细胞凋亡率,末次UVA照射后,用胰蛋白酶消化细胞,调整细胞为1X106mL。每组取1mL细胞,预冷PBS洗涤3次后细胞重悬于200μL结合缓冲液。加入10μL膜联蛋白V异硫氰酸荧光素及10μL碘化丙锭,4℃反应30min。加入300μL结合缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡率早期凋亡率+晚期凋亡率;实验重复3次,取均值;S5表达基因谱建库,对UVA照射组和空白对照组细胞,分别使用RNA逆转录试剂盒,将全部基因完整转录为总RNA,使用分光光度计检测样品的纯度和粗浓度,随后荧光定量检测RNA样品准确浓度,RNA检测试剂盒检测RNA样品完整性;上述检测合格后,对照组及UVA照射组使用DNaseⅠ处理,去除rRNA以富集mRNA和non-codingRNA,富集的mRNA和non-codingRNA随机打断成短片段,以打断后的短片段为模板,用六碱基随机引物合成cDNA第一链,在合成cDNA第二链时,用dUTP替代dTTP,然后合成的cDNA经过末端修复、加A、加测序接头后,加入UNG降解第二链,通过琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择后进行PCR扩增,最后建好的测序文库用Illumina测序平台进行测序;S6差异表达LncRNA检测,将得到的P值进行多重假设检验校正,通过控制FDR来决定P值的阈值;S7LncRNA功能注释分析,采用GeneOntology数据库对差异表达的LncRNA进行注释分析,提取可调控组织蛋白酶D的LncRNA;S8LncRNA-miRNA调控检测,用miRanda生物学软件对慢性紫外线损伤细胞miR4298进行表达验证,并对LncRNAs可靶向作用的miRNA预测分析。
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