申请/专利权人：河北中医学院

申请日：2019-05-10

公开（公告）日：2023-08-01

公开（公告）号：CN110093443B

主分类号：C12Q1/6895

分类号：C12Q1/6895;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.08.01#授权;2019.08.30#实质审查的生效;2019.08.06#公开

摘要：本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别阳春砂的试剂盒及鉴别方法。该试剂盒中包括阳春砂探针，探针连接有荧光标记。上述探针与模板结合的热动力学效能提高，使探针能够更好地和阳春砂DNA结合，而不与疣果砂仁和海南假砂仁的DNA结合，重复性好，假阳性率低，与DNA杂交后即可通过荧光检测进行阳春砂与其伪品疣果砂仁和海南假砂仁的鉴别，操作简便快捷、成本低。

主权项：1.一种鉴别阳春砂的方法，其特征在于，用鉴别阳春砂的试剂盒对阳春砂进行鉴别，所述试剂盒用于鉴别阳春砂与疣果砂仁，或鉴别阳春砂与海南假砂仁；所述试剂盒包括阳春砂探针和扩增引物，所述阳春砂探针连接有荧光标记；所述阳春砂探针的序列为5´-TTGATGAAAAATCCCAA-3´；所述扩增引物的正向引物序列为5´-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3´，如SEQIDNO.2所示，反向引物序列为5´-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3´，如SEQIDNO.3所示；所述方法的具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入所述阳春砂探针进行杂交，然后电泳，荧光检测；所述杂交的方法为：向所述扩增引物中加入所述阳春砂探针，95℃变性5min，70℃退火1min。

全文数据：一种鉴别阳春砂的试剂盒及鉴别方法技术领域本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别阳春砂的试剂盒及鉴别方法。背景技术阳春砂是姜科植物阳春砂的干燥成熟果实，是《中国药典》规定的正品砂仁来源之一，具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎的功效，属于名贵常用中药材。阳春砂价格较高，市面上常见用伪品冒充正品的现象，如疣果砂仁、海南假砂仁等，加工后很难分辨。然而伪品的品质远不及阳春砂正品，由此可导致药效不稳定，可威胁到人民用药的安全与疗效。因此鉴别阳春砂真伪对于砂仁市场的规范化以及人民健康具有重要意义。目前中药常规鉴定方法有基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等，但对于已被加工的中药则有一定的局限性。近年来，以DNA条形码为基础的分子鉴定方法快速发展，成为了继传统鉴定方法后的中药鉴定新方法。现有的分子鉴定技术多基于聚合酶链式反应PCR及测序技术：PCR获得ITS2序列后，通过对PCR产物进行测序、比对序列信息，从而能够区分正品和伪品。分子鉴定技术可以保证试验数据的可靠性，且重复性高，结果可靠，从分子水平进行鉴定不受样品的状态及采收加工影响。但是由于需要特殊而昂贵的测序仪器对其进行测序一般需要由测序公司进行，其经济成本及易用性限制了其推广的可能性。后又有人利用荧光标记的方式，通过设计特异性引物，在PCR合成过程中于碱基间插入荧光标记以鉴别正品和伪品。该方法从一定程度上改善了原有技术的缺点，但是，全序列标记的荧光标记成本过高，且特异性引物的设计和筛选费时费力，针对不同的待鉴定中药很难获得相应的特异性引物，同样限制了此类技术的推广和应用。发明内容针对阳春砂有疣果砂仁、海南假砂仁等伪品，以及现有技术中分子鉴定方法成本高、不易设计和筛选特异性引物的技术问题，本发明提供了一种鉴别阳春砂的试剂盒。以及，本发明还提供了鉴别阳春砂的方法。以及，本发明还提供了上述鉴别阳春砂的试剂盒在鉴别阳春砂与疣果砂仁，或鉴别阳春砂与海南假砂仁中的应用。为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：一种鉴别阳春砂的试剂盒，包括阳春砂探针，所述阳春砂探针连接有荧光标记；所述阳春砂探针的序列为5′-TTGATGAAAAATCCCAA-3′如SEQIDNO.1所示。本试剂盒中的探针序列以阳春砂、疣果砂仁与海南假砂仁的ITS2差异序列中差异较大的序列为基础，经人工设计后得到。与根据差异序列直接得到的探针相比，上述探针与模板DNA结合的热动力学效能提高，能够更好地和阳春砂DNA结合，而不与疣果砂仁与海南假砂仁的DNA结合，重复性好，假阳性率低。将探针与DNA杂交后，即可通过荧光检测进行阳春砂与伪品疣果砂仁和海南假砂仁的鉴别。本试剂盒利用上述探针可获得准确的鉴别结果，可应用于阳春砂、疣果砂仁与海南假砂仁饮片、粉末的鉴定，并有效降低了单次反应成本，且不需要特殊检测仪器，大大提升了检测手段的易用性，可在涉及阳春砂及其伪品疣果砂仁和海南假砂仁鉴别的科研机构、药房、医院、加工采收厂、中药供应商等地广泛应用。优选地，所述试剂盒还包括植物ITS2引物，用于扩增阳春砂、疣果砂仁和海南假砂仁的基因组DNA。优选地，所述荧光标记连接于所述探针的5′端。一个探针仅连接一个荧光标记，可有效降低荧光基团的使用量，降低成本。优选地，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。以及，本发明实施例还提供了一种鉴别阳春砂的方法，用上述鉴别阳春砂的试剂盒对阳春砂进行鉴别。优选地，具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入上述阳春砂探针进行杂交，然后电泳，荧光检测。优选地，所述杂交的方法为：向所述扩增引物中加入所述阳春砂探针，95℃变性5min，70℃退火1min。在优选的变性、退火的温度和时间条件下，能够更好地使阳春砂探针与阳春砂DNA结合，而不与另二者伪品的DNA结合，从而可以将这三种物质鉴别区分。优选地，所述荧光检测的激发波长为488nm。优选地，所述电泳的条件为1％琼脂糖凝胶电泳，电压为180V。优选地，扩增所述基因组DNA的反应体系为：100ng基因组DNA或10ng质粒DNA，ITS2引物10pmolμL，DNA聚合酶1×，用双蒸水补齐至50μL；反应程序为：95℃5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃，5min，共1个循环；所述阳春砂探针的加入量为1pmolμL。以及，本发明实施例还提供了上述阳春砂的鉴别用试剂盒在鉴别阳春砂与疣果砂仁，或鉴别阳春砂与海南假砂仁中的应用，该试剂盒可用于将阳春砂与其伪品疣果砂仁和海南假砂仁区别开。附图说明图1为本发明实施例2中荧光检测结果；图2为本发明实施例3中荧光检测结果。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1本发明实施例提供了一种鉴别阳春砂的试剂盒，具体包括：1阳春砂探针，序列为5′-TTGATGAAAAATCCCAA-3′。2ITS2引物；正向引物序列为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′如SEQIDNO.2所示，反向引物序列为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′如SEQIDNO.3所示。3PCR反应试剂：DNA聚合酶1×，双蒸水。实施例2本发明实施例提供了一种鉴别阳春砂的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：1PCR反应提取待测物的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：体系：待测物的基因组DNA100ng，ITS2引物10pmolμL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。反应程序：95℃，5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃5min，共1个循环。2原位探针结合向扩增引物中加入阳春砂探针1pmolμL，95℃变性5min，60℃退火1min。3电泳检测经1％琼脂糖凝胶电泳检查上述退火后的样品180V，10min后在488nm激发波长下进行荧光检验。检验结果如图1所示。阳春砂样品出现明显荧光条带，而伪品疣果砂仁和海南假砂仁则均未出现荧光条带。实施例3本发明实施例提供了一种鉴别阳春砂的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：1PCR反应提取待测物的质粒DNA，以该质粒DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：体系：待测物的质粒DNA10ng，ITS2引物10pmolμL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。反应程序：95℃，5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃5min，共1个循环。2原位探针结合向扩增引物中加入阳春砂探针1pmolμL，95℃变性5min，70℃退火1min。3电泳检测经1％琼脂糖凝胶电泳检查上述退火后的样品180V，10min后在488nm激发波长下进行荧光检验。检验结果如图2所示。阳春砂样品出现明显荧光条带，而伪品疣果砂仁和海南假砂仁则均未出现荧光条带。由结果可见，本发明所提供的试剂盒在阳春砂及其伪品疣果砂仁和海南假砂仁的鉴别方面具有操作简便快捷、成本低的优势。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING河北中医学院一种鉴别阳春砂的试剂盒及鉴别方法2019.05.053PatentInversion3.5111DNA阳春砂探针1ttgatgaaaaatcccaa17220DNAITS2正向引物2atgcgatacttggtgtgaat20321DNAITS2反向引物3gacgcttctccagactacaat21

权利要求：1.一种鉴别阳春砂的试剂盒，其特征在于，包括阳春砂探针，所述阳春砂探针连接有荧光标记；所述阳春砂探针的序列为5′-TTGATGAAAAATCCCAA-3′。2.根据权利要求1所述的鉴别阳春砂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括植物ITS2引物。3.根据权利要求1所述的鉴别阳春砂的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记连接于所述探针的5′端。4.根据权利要求3所述的鉴别阳春砂的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。5.一种鉴别阳春砂的方法，其特征在于，用权利要求1～4任一项所述的鉴别阳春砂的试剂盒对阳春砂进行鉴别。6.根据权利要求5所述的鉴别阳春砂的方法，其特征在于，具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入所述阳春砂探针进行杂交，然后电泳，荧光检测。7.根据权利要求6所述的鉴别阳春砂的方法，其特征在于，所述杂交的方法为：向所述扩增引物中加入所述阳春砂探针，95℃变性5min，70℃退火1min。8.根据权利要求6所述的鉴别阳春砂的方法，其特征在于，所述荧光检测的激发波长为488nm；和或所述电泳的条件为1％琼脂糖凝胶电泳，电压为180V。9.根据权利要求6所述的鉴别阳春砂的方法，其特征在于，扩增所述基因组DNA的反应体系为：100ng基因组DNA或10ng质粒DNA，ITS2引物10pmolμL，DNA聚合酶1×，用双蒸水补齐至50μL；反应程序为：95℃5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃，5min，共1个循环；所述阳春砂探针的加入量为1pmolμL。10.权利要求1所述的鉴别阳春砂的试剂盒在鉴别阳春砂与疣果砂仁，或鉴别阳春砂与海南假砂仁中的应用。

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