申请/专利权人：杭州圣域生物医药科技有限公司

申请日：2023-05-26

公开（公告）日：2023-10-27

公开（公告）号：CN116609525B

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N33/50;G01N33/573;G01N21/64

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.10.27#授权;2023.09.05#实质审查的生效;2023.08.18#公开

摘要：本发明公开了基于细胞内ALDH3B1蛋白水平以验证小分子化合物为染色质重塑复合物抑制剂的方法，包括a细胞铺板、b药物处理、c细胞预处理、d细胞封闭、e一抗孵育、f二抗孵育和g成像和数据分析。本发明利用细胞内western检测原理，可直接先在培养板上对细胞内蛋白进行原位免疫荧光染色，再通过荧光扫描成像仪对荧光信号进行定量分析，从而根据ALDH3B1蛋白水平开发出一种在细胞水平上验证筛选得到的小分子化合物是否为染色质重塑复合体抑制剂的方法，与传统的筛选方法相比，无需提取蛋白或RNA，具有操作简单、灵敏度高、特异性强和通量高等优点，能够为进一步开发靶向染色质重塑复合体小分子药物提供有效的验证手段，具有临床药物开发价值。

主权项：1.基于细胞内ALDH3B1蛋白水平以筛选染色质重塑复合体抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：a细胞铺板：在培养腔室中加入人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299的癌细胞悬液并培养至人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299完全贴壁；b药物处理：将待验证的小分子化合物进行梯度稀释并分别滴加至不同的培养腔室，将滴加有不同浓度的待验证的小分子化合物的各个培养腔室共同作为药物检测组，将未滴加有待验证的小分子化合物的培养腔室作为阴性对照组，分别对药物检测组和阴性对照组进行培养；c细胞预处理：在利用润洗剂分别对药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室进行润洗后再分别滴加固定剂以进行细胞固定，在利用润洗剂分别对药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室进行润洗后再分别滴加溶脂剂以进行细胞增透；所述固定剂为3.5～4.5%的多聚甲醛且在药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室内的滴入体积均为80～120μl，固定时间为10～20min，所述溶脂剂为0.4～0.6%的TritonX100且在药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室内的滴入体积均为80～120μl，溶脂时间为3～10min；d细胞封闭：在利用润洗剂分别对药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室进行润洗后再分别滴加封闭剂以进行细胞封闭；所述封闭剂为2.5～3.5%的牛血清白蛋白且在药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室内的滴入体积均为80～120μl，封闭时间为15～45min；e一抗孵育：将ALDH3B1抗体经稀释剂稀释后再分别滴加至药物检测组的各个培养腔室内，在阴性对照组的各个培养腔室内仅滴加与药物检测组中经稀释剂稀释后的ALDH3B1抗体等体积的稀释剂，分别对药物检测组和阴性对照组进行孵育；f二抗孵育：在利用润洗剂分别对药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室进行润洗后再分别滴加经稀释剂稀释后的山羊抗兔IgGHL并进行孵育；g成像和数据分析：在利用润洗剂分别对药物检测组和阴性对照组的各个培养腔室进行润洗后分别对药物检测组和阴性对照组进行信号扫描和荧光成像并以阴性对照组的信号结果作为背景信号；若待验证的小分子化合物能显著抑制NCI-H1299细胞中的ALDH3B1蛋白表达水平且呈现剂量依赖性，则待验证的小分子化合物对染色质重塑复合体具有抑制作用且为该复合体抑制剂。

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