申请/专利权人：滨州医学院;山东祥隆医药研究院有限公司

申请日：2018-03-22

公开（公告）日：2023-11-17

公开（公告）号：CN108872410B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.11.17#授权;2022.06.17#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明公开了一种润肺膏指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，属于中药制剂检测技术领域。所述指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：供试品溶液的制备；参照物溶液的制备；测定；润肺膏指纹图谱的构建。色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；检测波长为254nm；流速为1.0mLmin；柱温为25℃；进样量为20μL；乙腈和0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，记录50min的色谱图。该方法具有重复性好、稳定性和精密度高，操作简便等优点。采用本方法建立的润肺膏指纹图谱有10个共有峰，完善了润肺膏的质量控制方法，能从整体上对产品质量进行全面控制，从而保证润肺膏制剂的有效性和安全性。

主权项：1.一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：1供试品溶液的制备：精密称取一定质量的不同批次的润肺膏制剂，置于玻璃容器中，加入一定量溶剂稀释并定容，摇匀，过微孔滤膜，得供试品溶液；2参照物溶液的制备：精密称取一定量的绿原酸标准品，用溶剂溶解后，过微孔滤膜，得参照物溶液；3测定：分别精密吸取供试品和参照物溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；4润肺膏指纹图谱的构建：将不同批次的润肺膏供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次润肺膏色谱图中均存在的色谱峰作为共有的色谱峰，生成润肺膏对照指纹图谱，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间；其中，所述的步骤1中，供试品溶液的制备方法如下：精密称取润肺膏制剂5.0g于烧杯中，加入蒸馏水稀释，之后转移到10mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取滤液即得供试品溶液；所述的步骤2中，参照物溶液的制备方法如下：精密称取一定量的绿原酸标准品，加入50％甲醇配制绿原酸参照物溶液，浓度为50-100μgmL，过0.45μm微孔滤膜，滤液即为参照物溶液；所述的步骤3中，所述测定为分别精密吸取供试品和参照物溶液20μL，注入高效液相色谱仪，测定并记录50min的色谱图，使用的色谱条件为：色谱柱为慧德易SPODS-A柱，5μm，4.6×250mm；检测波长为254nm；流速为1.0mLmin；柱温为25℃；进样量为20μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，采用梯度洗脱的方式；流动相梯度为：0～10min，5％A，95％B；10～20min，5％-8％A，95-92％B；20～30min，8％-12％A，92-88％B；30～50min，12％-18％A，88-82％B；所述的步骤4中，所述建立方法得到的指纹图谱中含有10个特征峰，其中10号峰为对照品绿原酸，各峰以10号峰为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下：相对保留时间：峰1：0.251～0.255；峰2：0.360～0.363；峰3：0.382～0.388；峰4：0.434～0.441；峰5：0.517～0.519；峰6：0.549～0.556；峰7：0.566～0.580；峰8：0.600～0.606；峰9：0.623～0.627；峰10：1.000；相对峰面积：峰1：4.3576～5.1133；峰2：1.3582～1.7955；峰3：26.5149～35.4553；峰4：2.1450～2.5839；峰5：2.5258～3.1187；峰6：0.4975～0.5665；峰7：1.2079～1.3804；峰8：2.0684～2.3946；峰9：2.3285～2.4911；峰10：1.0000。

全文数据：一种润肺膏指纹图谱的建立方法及其指纹图谱技术领域[0001]本发明属于中药制剂检测技术领域，具体涉及润肺膏指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。背景技术[0002]中药复方是我国传统医药宝库的重要组成部分，有着悠久的使用历史和明确的疗效。当前，对中药制剂的质量控制内容主要包括外观鉴别、性状检查及单个或几种指标成分的定量分析等。而中药复方含有多味药材，其发挥疗效的药效物质基础比较复杂，作用机制常为多靶点协同作用，单靠单个或几种成分的含量作为质量控制指标难以全面反映中药制剂的质量。[0003]作为一种综合及可量化的质量控制方法，中药指纹图谱能够全面、有效地反应中药材及其制剂的质量，这与中药多靶点与整体性的作用特点是相符合的。近年来，结合计算机软件分析建立的现代中药指纹图谱分析技术广泛应用于中药学研究的各个领域，是目前国际上公认的中药质量控制模式。指纹图谱建立的方法包括各种色谱法、光谱法、波谱法等，色谱法是其中最常用的一种。[0004]润肺膏是以莱阳梨清膏为主药，配以黄芪、党参、百部、紫菀、川贝母精制而成的中药复方制剂。其主要功效为润肺益气，止咳化痰，可用于治疗上呼吸道感染、支气管炎、哮喘肺气肿等多种肺系疾病，临床疗效显著。现有的润肺膏质量控制方法主要通过薄层色谱对原茶儿酸进行定性鉴别，难以全面反应药品的质量。以中药色谱指纹图谱作为润肺膏的质量控制方法，目前尚未见报道。因此，建立润肺膏指纹图谱对其产品质量进行全面控制具有重要意义。发明内容[0005]为弥补当前润肺膏质量控制方法方面的不足，本发明旨在提供一种润肺膏指纹图谱的建立方法及润肺膏的指纹图谱。该方法简便、稳定性和重复性好、精密度高。建立的指纹图谱可以完善润肺膏的质量控制方法，保证润肺膏的质量可靠稳定，从而可以保证润肺膏制剂的有效性和安全性。[0006]本发明的目的通过以下步骤实现：[0007]1.供试品溶液的制备:精密称取一定质量的不同批次的润肺膏制剂，置于玻璃容器中，加入一定量溶剂稀释并定容，摇匀，过微孔滤膜，得供试品溶液。[0008]2.参照物溶液的制备:精密称取一定量的绿原酸标准品，用溶剂溶解后，过微孔滤膜，得参照物溶液。[0009]3.测定:分别精密吸取供试品和参照物溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得各批次润肺膏的色谱图。[0010]4.润肺膏指纹图谱的构建:将不同批次的润肺膏供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次润肺膏色谱图中均存在的色谱峰作为共有的色谱峰，生成润肺膏对照指纹图谱，同时计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。[0011]5.如上所述润肺膏色谱指纹图谱的构建方法，优选的步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为:精密称取润肺膏制剂5.Og，置于烧杯中，加入蒸馏水稀释，之后转移到IOmL容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀，过0.45μπι微孔滤膜，取滤液即得供试品溶液。[0012]6.优选的步骤2中，配制绿原酸标准品溶液所用溶剂为50%甲醇，浓度为50-100μgmL〇[0013]7.优选的步骤3中，建立润肺膏指纹图谱的色谱条件为:采用慧德易SPODS-A柱5μπι，4.6X250mm;检测波长为254nm;流速为I.OmLmin;柱温为25°C;进样量为20yL;流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱的方式。流动相梯度为:0〜IOmin，5%A，95%B;10〜20min，5%-8%A，95-92%B;20〜30min，8%-12%A，92-88%B;30〜50min，12%-18%A，88-82%B〇[OOM]8.本发明另外提供一种根据所述构建方法建立的润肺膏指纹图谱，含有10个共有特征峰，其中1〇号峰为对照品绿原酸。以绿原酸峰为参照，1〇个共有峰相对保留时间依次为：峰1:0·251〜0·255;峰2:0·360〜0·363;峰3:0·382〜0·388;峰4:0·434〜0·441;峰5:0.517〜0.519;峰6:0.549〜0.556;峰7:0.566〜0.580;峰8:0.600〜0.606;峰9:0.623〜0.627;峰10:1.000。[0015]9.使用前述方法测定12个批次的润肺膏样品，得到12个批次的润肺膏指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004版评价各批次润肺膏HPLC图谱的相似度，12批次润肺膏指纹图谱的相似度均大于0.99,说明各批次样品一致性较好。[0016]相比现有技术，本发明的有益效果是：[0017]1本发明建立的润肺膏指纹图谱建立方法简便可靠、稳定性和精密度高、重复性较好。[0018]2用本发明中建立的方法制定的润肺膏指纹图谱，能从整体上、全面有效地对润肺膏制剂的质量进行控制，从而保证产品的稳定性、可靠性与安全性。附图说明[0019]图1-1〜1-3为本发明一种实施例的选择波长所得色谱图[0020]图2-1〜2-4为本发明一种实施例的选择流动相所得色谱图[0021]图3-1〜3-3为本发明一种实施例的选择柱温所得色谱图[0022]图4-1〜4-2为本发明一种实施例的选择色谱柱所得色谱图[0023]图5为本发明一种实施例的润肺膏对照指纹图谱[0024]图6为本发明一种实施例的12批润肺膏指纹图谱具体实施方式[0025]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅局限于下述的实施方式。[0026]以下各实施例中所使用的仪器:ThermoFisherU3000高效液相色谱仪;色谱柱为慧德易SPODS-A柱5ym，4.6X250mm。[0027]以下各实施例中所使用的药品和试剂：润肺膏由烟台渤海制药集团有限公司提供;绿原酸标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈为色谱纯;磷酸为分析纯。[0028]实施例一:采用HPLC法建立润肺膏的指纹图谱[0029]1.供试品溶液的制备:精密称取润肺膏制剂5.Og于烧杯中，加入蒸馏水稀释，之后转移到IOmL容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀，过0.45μπι微孔滤膜，取滤液即得供试品溶液。[0030]2.参照物溶液的制备：取绿原酸标准品适量，加入50%甲醇配制绿原酸标准品溶液，浓度为50ygmL，过0.45μπι微孔滤膜，滤液即为参照物溶液。[0031]3.润肺膏指纹图谱的测定:精密吸取12个批次的润肺膏供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行测定，记录50min色谱图，得到12个批次的润肺膏色谱图。色谱条件为：色谱柱为慧德易SPODS-A柱（5μπι，4.6X250mm。检测波长为254nm，流速为I.OmLmin;柱温为25°C;进样量为20yL;以乙腈㈧和0.1%磷酸水溶液⑻为流动相，采用梯度洗脱的方式;流动相梯度为：〇〜10min，5%A，95%B;10〜20min，5%-8%A，95-92%B;20〜30min，8%-12%A，92-88%B;30〜50min，12%-18%A，88-82%B。[0032]4.润肺膏指纹图谱的构建:将12个批次的润肺膏供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择所有批次样品均有的10个色谱峰作为共有峰，生成润肺膏对照指纹图谱。其中，色谱峰10为绿原酸。以色谱峰10为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，结果见表1-1，1-2和表2。[0033]表1-112批润肺膏指纹图谱共有峰的相对峰面积1[0035]表1-212批润肺膏指纹图谱共有峰的相对峰面积2[0037]表212批润肺膏指纹图谱共有峰的相对保留时间[0039]5.使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版2004A”对12批润肺膏指纹图谱进行相似度评价，相似度均大于0.99，结果见表3。[0040]表312批润肺膏指纹图谱相似度计算结果[0042]实施例二:色谱条件的选择[0043]1.梯度洗脱方式的选择[0044]润肺膏为复方制剂，所含化学成分较为复杂，极性差别大，因此采用梯度洗脱的方式进行检测。[0045]2.检测波长的选择[0046]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈作为流动相A，0.1%磷酸水溶液作为流动相B，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下:0〜10min，5%A，95%B;10〜20min，5%-8%A，95-92%8;20〜30111丨11，8%-12%厶，92-88%8;30〜50111丨11，12%-18%厶，88-82%8。洗脱流速为1·OmLmin;柱温为25°C;进样量为20yL，分别考察检测波长为210nm，254nm，320nm时供试品溶液色谱图中色谱峰的数量和分离度，结果见图1-1〜1-3。[0047]从图1-1〜1-3可以看出，检测波长为254nm时，色谱峰的数目最多，各峰分离情况较好，因此选择254nm作为检测波长。[0048]3.流动相组成的选择[0049]采用上述梯度洗脱方法和检测波长，分别考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液几种溶剂系统的分离效果，结果见图2-1〜2-4。从图2-1〜2-4可以看出，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，各色谱峰分离效果较好，因此选用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。[0050]4.柱温的选择[0051]采用上述方法，选择柱温25°C、30°C和35°C对供试品溶液进行检测，结果见图3-1〜3-3。从图3-1〜3-3可以看出，当柱温为25°C时，各色谱峰分离效果较好。因此，选择柱温为25°C。[0052]5.色谱柱的选择[0053]采用上述方法，分别使用AgilentZorbaxExtendC185μηι，4·6X250mm和慧德易SPODS-A5μπι，4.6X250mm色谱柱对供试品溶液进行检测，结果见图4-1和4-2。结果表明，慧德易SPODS-A5μπι，4.6X250mm对润肺膏的分离效果较好。[0054]实施例三:对本发明中润肺膏指纹谱图的测定方法进行方法学考察[0055]方法学考察中使用的色谱条件:色谱柱为慧德易SPODS-A柱5ym，4.6X250mm，洗脱流速为I.OmLmin，柱温为25°C，检测波长为254nm，进样量为20yL，流动相使用乙腈㈧和O.1%磷酸水溶液（B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：O〜IOmin，5%A，95%B;10〜20min，5%-8%A，95-92%B;20〜30min，8%-12%A，92-88%B;30〜50min，12%-18%A，88-82%B〇[0056]1.精密度试验[0057]分别吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，分别测定峰面积和保留时间。实验结果见表4和表5，各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于1%，说明精密度良好。[0058]2.稳定性试验[0059]取同一润肺膏供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0、3、8、10、12、2处进样测定。实验结果见表6和表7，各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于1%，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。[0060]3.重复性试验[0061]取同一批次的供试品，按上述样品制备方法制备6份供试品溶液。按上述色谱条件注入高效液相色谱仪进行检测。实验结果见表8和表9,各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，相对保留时间的RSD均小于1%，说明建立的润肺膏指纹图谱检测方法重复性良好。[0062]表4精密度试验中各共有峰的相对峰面积[0064]表5精密度试验中各共有峰的相对保留时间[0066]表6稳定性试验中各共有峰的相对峰面积[0067][0068]表7稳定性试验中各共有峰的相对保留时间[0070]表8重复性试验中各共有峰的相对峰面积[0071][0072]表9重复性试验中各共有峰的相对保留时间

权利要求：1.一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：1供试品溶液的制备：精密称取一定质量的不同批次的润肺膏制剂，置于玻璃容器中，加入一定量溶剂稀释并定容，摇匀，过微孔滤膜，得供试品溶液；2参照物溶液的制备:精密称取一定量的绿原酸标准品，用溶剂溶解后，过微孔滤膜，得参照物溶液；3测定:分别精密吸取供试品和参照物溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图；4润肺膏指纹图谱的构建:将不同批次的润肺膏供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次润肺膏色谱图中均存在的色谱峰作为共有的色谱峰，生成润肺膏对照指纹图谱，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。2.根据权利要求1所述的一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤（1中，所述供试品溶液的制备方法如下:精密称取润肺膏制剂5.Og于烧杯中，加入蒸馏水稀释，之后转移到IOmL容量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀，过0.45μπι微孔滤膜，取滤液即得供试品溶液。3.根据权利要求1所述的一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2中，所述参照物溶液的制备方法如下:精密称取一定量的绿原酸标准品，加入50%甲醇配制绿原酸参照物溶液，浓度为50-100ygmL，过0.45μπι微孔滤膜，滤液即为参照物溶液。4.根据权利要求1所述的一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3中，所述测定为分别精密吸取供试品和参照物溶液20yL，注入高效液相色谱仪，测定并记录50min的色谱图。5.根据权利要求1所述的一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3中，润肺膏指纹图谱测定的色谱条件为:色谱柱为慧德易SPODS-A柱5ym，4.6X250mm;检测波长为254nm;流速为I.OmLmin;柱温为25°C;进样量为20yL;流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱的方式；流动相梯度为：〇〜10min，5%A，95%B;10〜20min，5%-8%A，95-92%B;20〜30min，8%-12%A，92-88%B;30〜50min，12%-18%A，88-82%B〇6.根据权利要求1所述的一种润肺膏指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤4中，所述建立方法得到的指纹图谱中含有10个特征峰，其中10号峰为对照品绿原酸，各峰以10号峰为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下：相对保留时间：峰1:〇.251〜0.255;峰2:0.360〜0.363;峰3:0.382〜0.388;峰4:0.434〜0.441;峰5:0.517〜0.519;峰6:0.549〜0·556;峰7:0·566〜0·580;峰8:0·600〜0·606;峰9:0·623〜0·627;峰10:1·000;相对峰面积：峰1:4.3576〜5.1133;峰2:1.3582〜1.7955;峰3:26.5149〜35.4553;峰4:2.1450〜2·5839;峰5:2·5258〜3·1187;峰6:0·4975〜0·5665;峰7:1·2079〜1·3804;峰8:2·0684〜2.3946;峰9:2.3285〜2.4911;峰10:1.0000。

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